Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling
Summary
Wij presenteren hier een aanvraag voor een standaard immunologische techniek (CFSE gekleurd OT-ik proliferatie) willen snel controleren adjuvans-gemedieerde cytotoxische T lymfocyten (CTL) generatie in vivo. Deze snelle inschatting van CTL capaciteiten is nuttig voor de ontwikkeling van profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen, alsmede therapeutische kanker vaccins.
Abstract
Dat de generatie van neutraliserende antilichamen belangrijk, maar niet voldoende voor adjuvante selectie is, zo blijkt uit de evaluatie van moderne subeenheid vaccins. Hulpstoffen met zowel de humorale als de cellulaire immuno-stimulerende mogelijkheden die kunnen bevorderen van cytotoxische T-lymfocyten (CTL) Reacties zijn daarom dringend noodzakelijk. Dus, trouwe monitoring van adjuvante kandidaten, die cross-priming induceren en vervolgens verbeteren CTL generatie vertegenwoordigt een cruciale stap in de ontwikkeling van een vaccin. Hier presenteren we een aanvraag voor een methode die SIINFEKL-specifieke gebruikt (OT-ik) T-cellen om te controleren de Kruis-presentatie van het model antigeen ovoalbumine (OVA) in vivo in aanwezigheid van verschillende adjuvans kandidaten. Deze methode geeft een snelle test om te selecteren met de beste mogelijkheden voor cross-priming hulpstoffen. De proliferatie van CD8+ T cellen is de meest waardevolle indicatie van cross-priming en het wordt ook beschouwd als een correlaat van adjuvans-geïnduceerde Kruis-presentatie. Deze functie kan worden geëvalueerd in verschillende immuun organen zoals lymfklieren en de milt. De omvang van de CTL generatie kan ook worden gecontroleerd, waardoor inzichten over de aard van een lokale (drainage lymfeklier voornamelijk) of een systemische aanpak (verre lymfeklieren en/of milt). Deze techniek verder maakt het mogelijk meerdere wijzigingen voor het testen van de drugs die specifieke Kruis-presentatie-trajecten kunnen remmen en biedt ook de mogelijkheid om te worden gebruikt in verschillende stammen van conventionele en genetisch gemodificeerde muizen. Kortom, zal de toepassing die wij hier presenteren nuttig voor vaccin laboratoria in industrie of academici die ontwikkelen of aanpassen van chemische hulpstoffen voor vaccin onderzoek en ontwikkeling zijn.
Introduction
Cytotoxische T-lymfocyten (CTL) inducerende vaccins zijn belangrijke therapeutische interventies die zijn ontwikkeld ter bestrijding van bepaalde soorten kanker1. CTL zijn ook belangrijk voor profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen2. Bovendien, CTL zijn een van de paar immuun afweermechanismen functioneel actief in risicogroepen zoals pasgeborenen3,4 , wie ook afhangen van CTL ter bestrijding van vroege leven infecties5. In dit verband resulteerde vaccins tegen het respiratoir syncytieel Virus (RSV) die zijn ontwikkeld met adjuvans die niet CTL Reacties (aluin uitlokken doet) in een complete mislukking van het vaccin leidt tot ernstige complicaties op infecties bij zuigelingen6. Deze negatieve effecten van vaccinatie kunnen worden teruggedraaid door een CD8+ T cel reactie7. Wij hebben eerder aangetoond dat de belangrijkste cytokines (type ik interferon) ontlokte door sommige stimulator van interferon genen (STING) agonisten essentieel voor de reacties van de CTL gegenereerd door deze hulpstoffen8, gedeeltelijk zijn door het meten van de proliferatie van OT-ik T cellen na vaccinatie en het gebruik van deze resultaten als een maatregel van CTL inducerende mogelijkheden waargenomen uitgebreid vaccinatie schema’s9. De meting van de proliferatie van OT-ik CD8+ T cellen in een wild type (WT) C57BL/6 ontvangende muis door carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) kleurstof verdunning is een robuuste schatting van het vermogen van de adjuvante van een vaccin voor het genereren van Kruis-priming van SIINFEKL, (de immuno-dominante peptide van ovoalbumine, eicellen). Variaties van deze techniek worden veel gebruikt voor de beoordeling van de proliferatie van OT-ik CD8+ en OT-II CD4+ T cellen. Bijvoorbeeld, is het gebruikt in de afwezigheid van geselecteerde cytokinen (KO muizen) of voor het meten van de doeltreffendheid van het vaccin na antigeen in dieren WT recall. We een korte protocol (4 dagen experiment) bedacht waarin na passieve overdracht van CFSE gebeitste OT-ik CD8+ T cellen, een onderhuidse (SC) immunisatie bestaande uit één dosis van 50 µg endotoxine-vrije eicellen aangevuld met test hulpstoffen wordt beheerd (Figuur 1). De follow-up van de resultaten 48 h na de vaccinatie biedt een betrouwbare bewijs van hoedanigheid van de adjuvante voor het genereren van CTL reacties. Door deze strategie is het mogelijk om te beoordelen van de potentie van de lokale immuunrespons in de zuig lymfeklier na immunisatie, alsmede de omvang van het antwoord door het meten van de activiteit van de CTL in de milt (of verre lymfeklieren).
Protocol
Representative Results
Discussion
Moderne vaccins zijn ideaal composedof gezuiverd antigeen en hulpstoffen, met de mogelijke toevoeging van een levering systeem zoals liposomen, virusachtige deeltjes, nanodeeltjes of live vectoren. Een belangrijk aspect bij het ontwerpen van een vaccin is om te kiezen van de juiste adjuvans volgens de klinische behoeften. Deel van het toepassingsgebied zou kunnen inhouden ten gunste van een humorale vs. cellulaire immuunrespons (of beide), de verkiezing van een lokale vs. een systemische immuunrespons (of beide) en het s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dank verschuldigd aan onze technische medewerkers: U. Bröder en H. Shkarlet, die ons hebben geholpen tijdens de experimentele procedures. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de EU (UniVax, het contract nr. 601738 en TRANSVAC2, contract nr. 730964) en een subsidie van Helmholtz Association (HAI-IDR). Het onderzoek heeft geen invloed op de financieringsbronnen ontwerpt, generatie van het manuscript of de beslissing tot indient voor publicatie.
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3′,5′)-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O’Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
