Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme
Summary
Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.
Abstract
Modern alt birim aşılar değerlendirilmesi antikorları nötralize üretimi önemli ancak adjuvan seçim için yeterli olduğunu ortaya koymaktadır. Bu nedenle, adjuvan sitotoksik T lenfositler (CTL) yanıt teşvik edebiliyoruz humoral ve hücresel immün uyarıcı yetenekleri ile acilen ihtiyaç vardır. Böylece, çapraz-astar ikna etmek ve daha sonra CTL üretimi geliştirmek adjuvan adayları sadık izleme aşı geliştirmede önemli bir adımı temsil eder. Burada biz SIINFEKL özgü kullanan bir yöntem için bir uygulama mevcut (OT-ben) T hücreleri farklı adjuvan adayların huzurunda modeli antijen ovalbumin (OVA) vivo içinde çapraz sunumunu izlemek için. Bu yöntem en iyi çapraz-astar yetenekleri ile adjuvan seçmek için hızlı bir test temsil eder. CD8 yayılması+ T hücreleri çapraz-astar en değerli belirtisi olduğunu ve aynı zamanda adjuvan kaynaklı çapraz-sunum ilişkili kabul edilir. Bu özellik, lenf düğümleri ve dalak gibi farklı bağışıklık organlarında değerlendirilebilir. CTL oluşturma kapsamını da izlenebilir, böylece bir yerel doğa üzerinde anlayışlar veren (lenf nodu esas olarak boşaltılmasına) ya da sistemik yanıtın (uzak lenf düğümleri ve/veya dalak). Bu tekniği daha da belirli çapraz-sunum yolları inhibe olabilir ve ayrıca geleneksel ve genetiği değiştirilmiş fare farklı suşları kullanılmak üzere imkanı sunuyor ilacını test için birden fazla değişiklik sağlar. Özetle, burada mevcut uygulama geliştirmek veya aşı araştırma ve geliştirme için kimyasal adjuvan değiştirme aşı laboratuarlar sanayi veya Akademi için faydalı olacaktır.
Introduction
Aşılar inducing sitotoksik T lenfositler (CTL) belirli türde kanser1mücadele için geliştirilmiş anahtar tedavi müdahaleler vardır. CTL de intrasellüler patojenlerin2karşı koruyucu aşıları için önemli. Ayrıca, CTL bir kaç bağışıklık savunma mekanizmaları da erken hayat enfeksiyonlar5mücadele için CTL üzerinde bağlıdır kime risk nüfus yenidoğan bebeklerin3,4 gibi işlevsel olarak etkin bulunmaktadır. Bu bağlamda, CTL yanıt (şap) temin etmez bir adjuvan ile geliştirilen aşılar karşı solunum sinsityal virüs (RSV) aşı bebeklerde6adet enfeksiyondan üzerine ciddi komplikasyonlara yol tam bir başarısızlık sonuçlandı. Aşı bu olumsuz etkileri bir CD8 tarafından ters+ T hücre yanıt7. Biz daha önce interferon genler (STING) agonistler bazı uyarıcı tarafından elde edildi (tip ı interferonlar) ana sitokinler bu adjuvan8tarafından kısmen yayılması ölçerek oluşturulan CTL yanıt için gerekli olduğunu göstermiştir OT-ı T hücreleri sonra aşı ve yetenekleri inducing CTL ölçüsü gözlenen bu sonuçları kullanarak aşılama programları9erişmek. OT yayılması ölçümü-ben CD8+ T hücreleri bir vahşi türü (WT) C57BL/6 alıcı fare carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) boya tarafından seyreltme bir aşı adjuvan yeteneği oluşturmak için sağlam bir tahmin olduğunu. SIINFEKL, (ovalbumin, OVA IMMUNO-baskın peptid), çapraz-astar. Bu tekniğin varyasyonları yaygın OT yayılması değerlendirilmesi için kullanılan-ben CD8+ ve OT-II CD4+ T hücreleri. Örneğin, seçili sitokinler (KO fareler) ya da antijen hatırlama WT hayvanlarda sonra aşı etkinliği ölçmek için yokluğunda kullanılmıştır. Hangi OT CFSE lekeli pasif transfer sonra kısa protokol (4 gün deneme) geliştirmiştir-ben CD8+ T hücreleri, 50 bir doz oluşan bir cilt altı (SC) bağışıklama endotoksin-Alerjik OVA test adjuvan ile desteklenmiş µg yönetilen (Şekil 1). 48 h sonrasi hipererjik sonuçları takip adjuvan kapasitesi CTL yanıt-e doğru oluşturmak için güvenilir bir kanıtı sağlar. Bu strateji, dalak (veya uzak lenf düğümleri) CTL etkinliğini ölçerek ölçüde yanıt yanı sıra bağışıklama sonra drenaj lenf nodu yerel Bağışıklık yanıtında potens değerlendirmek mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modern aşılar ideal Avusturyalıanti arıtılmış antijen ve adjuvan lipozomlar, virüs gibi parçacıklar, nano tanecikleri veya canlı vektörel çizimler gibi bir iletim sistemi mümkün ilavesi ile vardır. Bir aşı tasarlarken önemli bir yönü klinik gereksinimlerinize uygun bir doğru adjuvan seçmektir. Kapsamı parçası humoral ve hücresel immün yanıt (veya her ikisi), sistemik bir immün yanıt (veya her ikisi) vs yerel seçim ve aşı hedef popülasyon oluşturmak için gereken bellek tür lehine içe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bizim teknik görevlileri için borçlu bulunmaktadır: U. Bröder ve H. Shkarlet, deneysel işlemler sırasında bize yardım etti. Bu eser kısmen EU hibe (sözleşme UniVax, Sözleşme No 601738 ve TRANSVAC2, No. 730964) ve bir Helmholtz Derneği hibe (HAI-IDR) tarafından finanse edildi. Finansman kaynakları araştırma etkilemek değil tasarım, makale veya yayın için göndermek için karar nesil.
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3′,5′)-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O’Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
