מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון
Summary
אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג’וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טיפולית.
Abstract
ההערכה של יחידת המשנה מודרני חיסונים מגלה כי הדור של נטרול נוגדנים היא חשובה אך אינה מספקת עבור אדג’וונט הבחירה. לכן, adjuvants עם יכולות חיסונית-מופחתים ההורמונאלית והן הסלולר מסוגלים לקדם ציטוטוקסיים התגובות לימפוציטים (CTL) T נחוצים בדחיפות. לפיכך, ניטור נאמן של מועמדים אדג’וונט זירוז קרוס-לקרקע ולשפר לאחר מכן CTL דור מייצג שלב חיוני בפיתוח החיסון. כאן אנו מציגים יישום שיטה המשתמשת SIINFEKL ספציפיים (OT-אני) ותאי T כדי לפקח על הצלב-המצגת של ה הדגם אנטיגן אובלבומין (פשוט) ויוו בנוכחות המועמדים אדג’וונט שונים. שיטה זו מייצגת בדיקה מהירה כדי לבחור adjuvants עם היכולות קרוס-לקרקע הטוב ביותר. ההתפשטות של CD8+ T תאים הסימן החשוב ביותר של צלב-לקרקע, זה גם נחשב לתאם אדג’וונט-induced קרוס-מצגת. תכונה זו ניתן להעריך באיברים חיסוניים שונים כמו הלימפה והטחול. היקף הדור CTL יכול גם להיות במעקב, ובכך לתת תובנות על טבע מקומי (ניקוז הלימפה בעיקר) או תגובה מערכתית (בלוטות הלימפה רחוק ו/או הטחול). טכניקה זו נוסף מאפשר שינויים מרובים עבור בדיקות סמים יכול לעכב מסלולים קרוס-מצגת מסוימת, מציעה גם את האפשרות שישמש זנים שונים של עכברים מהונדסים קונבנציונאלי. לסיכום, היישום אנחנו מציגים כאן יהיה שימושי עבור מעבדות חיסון תעשייה או אקדמיה לפתח או שינוי כימי adjuvants חיסון למחקר ופיתוח.
Introduction
לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (CTL) גרימת חיסונים הם המפתח התערבויות טיפוליות אשר פותחו כדי להילחם סוגים מסוימים של סרטן1. CTL חשובים גם עבור חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים2. יתר על כן, CTL הם אחד כמה המערכת החיסונית מנגנוני ההגנה באופן פונקציונלי פעיל בקרב אוכלוסיות סיכון כגון neonates3,4 למי גם תלוי CTL להילחם זיהומים בתחילת החיים5. בהקשר זה, חיסונים נגד הנשימה Syncytial וירוס (RSV) שפותחו עם אדג’וונט זה לא זכה CTL תגובות (אלום) הביא כישלון מוחלט של החיסון המוביל לסיבוכים רציניים על זיהומים אצל תינוקות6. אלה תופעות שליליות של החיסון יכול להיות הפוך על ידי CD8+ תא T בתגובה7. בעבר הראו כי ציטוקינים הראשי (מסוג האינטרפרונים) שהפיק קצת ממריץ של אינטרפרון גנים (סטינג) אגוניסטים חיוניים התגובות CTL שנוצרו על-ידי אלה adjuvants8, בין השאר על ידי מדידת התפשטות OT-אני T תאים לאחר חיסון ושימוש תוצאות אלו כפי מידת CTL גרימת יכולות שנצפתה מורחב לוחות זמנים חיסון9. מידת ההתפשטות של OT-אני CD8+ T תאי עכבר הנמען של C57BL/6 פראי סוג (WT) על ידי carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לצבוע הדילול הוא שערוך חזקים של יכולות אדג’וונט של חיסון כדי ליצור קרוס-לקרקע של SIINFEKL, (פפטיד חיסונית-הדומיננטי של אובלבומין, ביצית). וריאציות של טכניקה זו נמצאים בשימוש נרחב עבור ההערכה של התפשטות OT-אני CD8+ ו CD4 OT-II+ T תאים. לדוגמה, שהשתמשו בה בהיעדרו של ציטוקינים שנבחר (KO עכברים) או כדי למדוד את יעילות החיסון לאחר אנטיגן האחזור ב WT בעלי חיים. אנחנו בדימיון פרוטוקול קצר (4 ימים הניסוי) שבו לאחר העברה פסיבית של שהוכתמו CFSE OT-אני CD8+ T תאים, של חיסונים (ש) תת עורית בהיקף של מנה אחת של 50 µg של ביצית ללא אנדוטוקסין בתוספת מבחן adjuvants מנוהל (איור 1). בצע את התוצאות 48 שעות לאחר החיסון מספק הוכחה אמינה של הקיבולת של אדג’וונט ליצירת רשימת אישורים אמינים תגובות. על ידי אסטרטגיה זו, זה אפשרי להעריך את עוצמת התגובה החיסונית המקומית הצומת לימפה המנקזים לאחר חיסון, כמו גם היקף התגובה על ידי מדידת הפעילות CTL הטחול (או מרוחק בלוטות הלימפה).
Protocol
Representative Results
Discussion
חיסונים מודרניים הם אידיאלי composedof אנטיגן מטוהרים adjuvants, עם תוספת אפשרית של מערכת המסירה כמו ליפוזומים, חלקיקים דמויי וירוס, חלקיקים או וקטורים בשידור חי. היבט מרכזי בעת עיצוב חיסון היא לבחור את אדג’וונט הנכון בהתאם לצרכים קליניים. חלק הטווח עשוי להיות כרוך העדפה ההורמונאלית לעומת התגובה ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו חבים שלנו סגל: U. Bröder, ה Shkarlet, שעזר לנו במהלך הליכי ניסיוני. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האיחוד האירופי (UniVax, חוזה מס 601738 ו- TRANSVAC2, חוזה מס 730964), ומענקים מענק האגודה הלמהולץ (חי-ד ר רודי). מקורות המימון לא להשפיע על המחקר, עיצוב, דור של כתב היד או להגיש את זה לפרסום.
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3′,5′)-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O’Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
