Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung
Summary
Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.
Abstract
Die Bewertung der modernen Untereinheit Impfstoffe zeigt, dass die Generation von neutralisierenden Antikörpern wichtig, aber nicht ausreichend für die adjuvante Auswahl. Daher sind Hilfsstoffe mit humorale und zelluläre Immuno-stimulierende Funktionen, die in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Antworten zu fördern sind dringend notwendig. So steht treu Überwachung der adjuvanten Kandidaten, die Kreuz-Grundierung zu induzieren und anschließend verbessern CTL-Generation einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung von Impfstoffen. Hier präsentieren wir einen Antrag auf eine Methode, die SIINFEKL-spezifische verwendet (OT-ich) T-Zellen, die Kreuz-Präsentation des Modells Antigen Ovalbumin (OVA) in Vivo in Anwesenheit von verschiedenen adjuvante Kandidaten zu überwachen. Diese Methode stellt ein Schnelltest Adjuvantien mit den besten Cross-Priming-Funktionen auswählen. Die Proliferation von CD8+ T Zellen ist die wertvollste Angabe des Kreuz-Grundierung und es gilt auch als Korrelat des Adjuvans-induzierte Kreuz-Präsentation. Diese Funktion kann in verschiedenen immun Organen wie Lymphknoten und Milz ausgewertet werden. Das Ausmaß der CTL-Generation auch überwacht werden kann, wodurch es Erkenntnisse über die Natur eines einheimischen (Lymphknoten vor allem entleeren) oder eine systemische Reaktion (entfernte Lymphknoten und/oder Milz). Diese Technik weiter erlaubt mehrere Modifikationen zum Testen Medikamente, die können hemmen bestimmte Wege Kreuz-Präsentation und bietet auch die Möglichkeit in verschiedene Stämme von konventionellen und gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen wird die Anwendung, die wir hier präsentieren nützlich für Impfstoff-Labors in Industrie oder Wissenschaft sein, entwickeln oder ändern chemischen Hilfsstoffe für Impfstoff-Forschung und Entwicklung.
Introduction
Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren Impfstoffe sind wichtige therapeutische Interventionen, die entwickelt wurden, um bestimmte Arten von Krebs1zu kämpfen. CTL sind auch wichtig für prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger2. Darüber hinaus CTL sind eine der wenigen immun Abwehrmechanismen in Gefahr Bevölkerungen wie Neugeborene3,4 wen auch abhängig von CTL gegen frühen Lebens Infektionen5funktionell aktiv. In diesem Zusammenhang führte Impfstoffe gegen Respiratory Syncytial Virus (RSV), die mit Adjuvans entwickelt wurden, die nicht CTL-Antworten (Alaun) entlocken wird ein Totalausfall des Impfstoffes führt zu schwerwiegenden Komplikationen bei Infektionen bei Säuglingen6. Diese negativen Auswirkungen der Impfung können rückgängig gemacht werden, indem eine CD8+ T-Zell Antwort7. Wir haben bereits gezeigt, dass die wichtigsten Zytokine (Typ-I-Interferone) hervorgerufen durch einige Stimulator der Interferon-Genen (STING)-Agonisten unerlässlich für die CTL-Antworten generiert durch diese Adjuvantien8, teilweise sind durch die Messung der Verbreitung von OT-I T-Zellen nach Impfung und anhand dieser Ergebnisse als ein Maß für die CTL induzierende Fähigkeiten beobachtet Impfung Zeitpläne9erweitert. Die Messung der Verbreitung von OT-ich CD8+ T-Zellen in einem Wild-Typ (WT) C57BL/6 Empfänger Maus durch Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Farbstoff Verdünnung ist eine robuste Einschätzung der Fähigkeit des Adjuvans eines Impfstoffs zu generieren Kreuz-Grundierung von SIINFEKL, (die Immuno-dominante Peptid von Ovalbumin, Eizellen). Variationen dieser Technik sind weit verbreitet für die Beurteilung der Verbreitung von OT-ich CD8+ und OT-II CD4+ T Zellen. Zum Beispiel hat es in Abwesenheit des ausgewählten Zytokine (KO-Mäusen) oder impfstoffwirksamkeit nach Antigen-Rückruf bei WT Tieren Messen eingesetzt. Wir entwickelten ein kurzes Protokoll (4 Tage-Experiment) in dem nach Passive Übertragung der CFSE–gefärbten OT-ich CD8+ T-Zellen, eine subkutane (s.c.)-Immunisierung, bestehend aus einer Dosis von 50 µg von Endotoxin-freie OVA ergänzt mit Test Adjuvantien verabreicht (Abbildung 1). Die Follow-up der Ergebnisse 48 h nach der Impfung bietet zuverlässigen Beweis für die Fähigkeit des Adjuvans, CTL-Antworten zu generieren. Mit dieser Strategie ist es möglich, die Wirksamkeit der lokalen Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung sowie das Ausmaß der Reaktion zu bewerten, durch Messung der CTL-Aktivität in der Milz (oder entfernte Lymphknoten).
Protocol
Representative Results
Discussion
Moderne Impfstoffe sind im Idealfall Composedof gereinigte Antigen und Hilfsstoffe, mit den möglichen Zusatz eines Liefersysteme wie Liposomen, virusähnliche Partikel, Nanopartikel oder live Vektoren. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Impfstoffes ist, die richtigen adjuvanten nach den klinischen Bedürfnissen wählen. Bestandteil des Lieferumfangs könnte begünstigt eine humorale vs. zelluläre Immunantwort (oder beides), die Wahl eines lokalen vs. einer systemischen Immunantwort (oder beides) und die Art…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind verpflichtet, unseren technischen Assistenten: U. Bröder und H. Shkarlet, die uns während der experimentellen Verfahren geholfen. Diese Arbeit wurde teilweise von EU-Zuschüssen (UniVax, Vertrag Nr. 601738 und TRANSVAC2, Vertrag Nr. 730964) und ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft (HAI-IDR) finanziert. Die Finanzierungsquellen hat keinen Einfluss auf die Forschung design, Erzeugung von Manuskript oder Entscheidung, zur Veröffentlichung übermitteln.
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
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