Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57541
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 4, 2, 1,3, 1,2
1Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Lab, Division of Transplant, Department of Surgery, Comprehensive Transplant Center, Ohio State University Wexner Medical Center, 2Department of Surgery, Division of Transplant, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Department of Surgery, Division of CardioThoracic Surgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Department of Medicine, Ohio State University Wexner Medical Center

Summary

שיש מחסור משמעותי לתורם כבד, הקריטריונים עבור התורמים הכבד שהורחבו. Normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) פותחה כדי להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. מחקר זה מדגים מודל עכברוש של NEVLP, בדיקות היכולת של pegylated-קטלאז, להקל על פגיעה בכבד שימור.

Abstract

קיים מחסור משמעותי של allografts הכבד זמין עבור השתלת, בתגובה שהורחבו הקריטריונים התורם. כתוצאה מכך, normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) כבר הציג כשיטה להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. NEVLP יתרונות רבים בהשוואה בהיפותרמיה ו subnormothermic כולל זלוף מופחת פגיעה שימור, שיקום תפקוד האיברים נורמלי בתנאים הפיזיולוגיות, הערכה של ביצועי איברים, כפלטפורמה לתיקון איברים , שיפוצים ושינויים. מודלים NEVLP מאתר והן חזירי תוארו. אנו מדגימים מודל עכברוש של NEVLP ולהשתמש מודל זה להראות אחד מהיישומים החשובים שלה – השימוש של מולקולה טיפולית נוספו perfusate הכבד. קטלאז נבלות מינים (ROS) חמצן תגובתי אנדוגני, הוכח כדי להקטין איסכמיה-פגיעה reperfusion בתוך העין, מוח, ריאות. Pegylation הוכח למטרה קטלאז אנדותל. כאן, הוספנו pegylated-קטלאז (פג-חתול) הבסיס perfusate הדגימו את יכולתה לצמצם פגיעה בכבד שימור. יתרון של המודל NEVLP מכרסם שלנו היא שזה זול לעומת דגמים בעלי חיים גדולים. מגבלה של מחקר זה היא כי היא אינה כיום כוללת זלוף שלאחר השתלת כבד. לכן, אין אפשרות לבצע חיזוי של הפונקציה של השתלת איברים שלאחר בוודאות. עם זאת, הדגם השתלת הכבד עכברוש מבוססת היטב, בהחלט יכול לשמש בשילוב עם מודל זה. לסיכום, הראו מודל NEVLP זול, פשוט, בקלות ניתן לשכפול באמצעות חולדות. יישומים של מודל זה יכול לכלול בדיקות perfusates הרומן תוספים perfusate, בדיקות תוכנה שתוכננה עבור איברים הערכה ואני ניסויים שנועדו לתקן את האיברים.

Introduction

ישנם חולים 14,578 ברשימת ההמתנה עבור השתלת כבד, כ 7,000 השתלות מתבצעות לכל השנה1,2. בתגובה פירוש הדבר תורם משמעותית, הרחיבו הקריטריונים עבור התורמים כבד; אלה מכונים לעתים קרובות שולי איברים או קריטריונים המורחבת תורמים, צפויים לבצע פחות טוב לאחר ההשתלה מאשר allografts הקריטריונים הסטנדרטיים, עם שיעור גבוה יותר של תפקוד שתל ראשי ושתל עיכוב הפונקציה3, 4,5,6. כתוצאה מכך, NEVLP כבר הציג כשיטה להעריך ולשנות איברים פונקציה6,7. יש מעוצב דגם עכברוש של NEVLP ואנו בשימוש מודל זה כדי להדגים אחד שלה יישומים פוטנציאליים חשובים – בדיקה של מולקולה הרומן תוספות כדי perfusate הכבד.

NEVLP יוערכו מאתר (עכברים) והן מודלים חזירי, כמו גם איברי אדם שהושלך6,8,9. התוצאות של הניסויים האנושי הראשון של NEVLP היו גם לאחרונה פורסם10. למרות מכונת בהיפותרמיה זלוף הפך בבירור התקן לשימור הכליה, הטמפרטורה במכונת הכבד אשר זלוף צריכה להתרחש הוא עדיין שנוי במחלוקת. NEVLP יתרונות רבים המוצע לעומת בהיפותרמיה זלוף subnormothermic. אלה כוללים פגיעה השימור מופחתים, שיקום תפקוד האיברים נורמלי בתנאים הפיזיולוגיות, היכולת להעריך את ביצועי איברים, ולא כפלטפורמה איברים תיקון, שיפוץ של השינוי7,11, 12,13,14,15,16,17.

מספר רב של מחקרים הושלמו באמצעות מודלים NEVLP חזירי. למרות מודלים אלה הם זולים יחסית, כאשר דגמי שקילת שימוש שנמחקו איברי אדם או ניסויים קליניים בבני, הם מאוד יקר בהשוואה שלנו דגם NEVLP בעלי חיים קטנים. מרכיב משמעותי של לכל ניסוי העלות היא perfusate. אנחנו יכולים להשלים זלוף 4 שעות עם 300 מ של perfusate במחיר נמוך יחסית. בנוסף, העלות של חיות קטנות כולל חולדות הוא נמוך מאוד לעומת העלות של חזירים.

לעומת דגמים אחרים של NEVLP בחולדה, המודל המוצג כאן הוא פשוט יחסית ליישום ובעל מגוון רחב של יישומים. המעגל זלוף ניתן לראות באיור1. Perfusate מתחיל במאגר perfusate (1), אשר הוא מיכל מים המעטפת. Perfusate הוא שלף מתוך המאגר על ידי משאבה רולר (2), דחף לתוך windkessel (3), ולאחר מכן את oxygenator (4). Oxygenator מוגדרת עבור גז countercurrent perfusate זרימה לספק חילוף הגזים המרבי. Perfusate ואז מההכנסות כדי חימום סליל (5) בתוך התא זלוף כדי להבטיח זאת היא בטמפרטורה הפיזיולוגיות, מלכודת בועות (6) כדי למנוע זלוף של בועות אוויר שם הם איברים מראש (7) ו עוגב שלאחר (8) מדגם יציאות, אשר מאפשרים את perfusate. לטעום. Perfusate ואז נכנס דרך הצינורית וריד שער הכבד. הצינורית וריד שער הכבד מחובר צג לחץ תרשימים הערכים על התוכנה אוסף נתונים. לאחר מכן, perfusate היציאות הכבד דרך הצינורית IVC, זורם לתוך הרחוב אקולייזר לחץ (9). לבסוף, perfusate משך מהגוש לחץ בחזרה דרך המשאבה רולר, רוקן לתוך המאגר. מודל זה כולל זלוף רציפה כדי וריד שער הכבד, משאיר בחוץ זרימה פועמת עורק הכבד, דיאליזה בשימוש גם דגמים אחרים, שכל אחד מהם דורש מעגל נוסף ונפרד, אך בעבר הוכחו לא להיות נדרש9,13.

על מנת לחקור התוספת של מולקולה טיפוליים חדשניים כדי perfusate, בחרנו את האנזים קטלאז. קטלאז הוא נבלות ROS אנדוגני, המהווה חלק של מנגנון ההגנה הפנימית תאים כדי. לרכך את ההשפעות של רוס18. הביטוי קטלאז הוא גדל איסכמיה הכבד פגיעה reperfusion פציעה19. תוספת ניסיוני של קטלאז הוכח כדי להקטין איסכמיה-פגיעה reperfusion, עיניים, המוח, ואת ריאות20,21,22,23,24. Pegylation הוכח למטרה קטלאז אנדותל, סיוע קטלאז ספיגת לתוך תאי אנדותל25. פג-חתול מנוהל מערכתית עם יעילות מוגבלת בהפחתת פגיעה כבדית איסכמיה-פגיעה reperfusion; עם זאת, שיערנו כי הוספת שפג-החתול מעגל זלוף מטלטלים יוביל ל שיפור תוצאות26,27,28. כאן, אנו מוסיפים פג-חתול perfusate הבסיס שלנו להדגים את יכולתו לצמצם פגיעה בכבד שימור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם לקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים, המועצה הלאומית למחקר של מדריך עבור טיפול אנושי ו שימוש של מעבדה בעלי חיים (IACUC), עבר אישור על-ידי ועדת IACUC אוניברסיטת מדינת אוהיו.

1. הגדרת הראשונית

  1. להכין את הפתרון זלוף על-ידי שילוב הבאות: 86 מ של 25% אלבומין, 184 מ של המדיה של וויליאמס, 30 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (10 U/mL פניצילין ו- 0.01 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין), אינסולין (50 U/L), הפרין (0.01 U/mL),-גלוטמין (0.292 g/L), ו הידרוקורטיזון (0.010 g/L) את הנפח הכולל של 300 מ. כדי להפוך את הבסיס perfusate פג-חתול קבוצה, הוסף 625 U/mL של פג-חתול.
    1. מאגר הפתרון perfusate באמצעות טריס (hydroxymethyl) aminomethane (תאם) ל pH 7.4. השתמש מכונת גזים בדם כדי לאשר את רמת החומציות של perfusate.
  2. להגדיר את המעגל (איור 1).
    1. להפעיל את האמבטיה במים חמים יותר ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס. לאפשר לתא איברים להתחמם.
    2. שופכים את perfusate מעורב, במאגר לתוך המאגר ולהתחיל מחזור הדם.
      הערה: perfusate שהוזכר בשלב זה הוכן בשלב 1.1.1.
    3. הפעל את הגז oxygenating (95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני) לדלפק זרימה דרך oxygenator בתוך השורה.
    4. להפעיל את התוכנה אוסף נתונים ולחץ על "התחל" כדי להקליט את משך זמן הניסוי.
  3. כיוונון מיקרוסקופ כירורגי מחדר ניתוח (איור 2).
    1. הפעל את כל הציוד כולל לוח התחממות כדור הארץ, electrocautery, ואת הרדמה סימנים חיוניים (לב קצב וחמצן רוויה) פיקוח על ציוד.
      הערה: ההגדרות מיקרוסקופ ישתנו בהתבסס על המיקרוסקופ בשימוש ולא ניתן לכוונן נוחות המשתמש.
    2. למלא את המזרק הרדמה 10 מ ל 10 מ של איזופלוריין נוזלי האינהלציה (משקל מולקולרי 184.5 g/mol) ולמקם יחידת הרדמה.
    3. עמדה מזרק 0.5 מ"ל של הפארין (50 U), מכשירי הניתוח, 4-0 ו- 7-0 משי תפר ספוגיות כותנה סטרילי, 4 ס"מ על 4 ס"מ ארוגים גזה ספוגים כראוי (איור 2).
  4. הכינו את תא איזופלוריין.

2. אינדוקציה של הרדמה

  1. ללבוש את הבאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי): מסכה רפואית, כפפות כירורגי, שמלת חד פעמיות.
  2. שוקלים את החולדה.
    הערה: אנו משתמשים ספראג-Dawley חולדות בין 250 – 350 גר'.
  3. הפעל את מדחס חמצן ואיזופלוריין. הנח את העכבר, לאחר נשקל, אל החדר איזופלוריין ולאבטח את המכסה. לגרום הרדמה באמצעות איזופלוריין 6% הנכללת 2 ל'/דקה של חמצן.
    הערה: המינון המדויק איזופלוריין בשימוש יהיה תלוי במערכת הרדמה ספציפי בשימוש.
  4. השתמש קוצץ אלקטרונית קליפ שיער בטן החיה.
  5. החלף את החיה בבית הבליעה איזופלוריין.
  6. הפעל את יחידת הרדמה ממוקם בחדר הניתוח.
  7. הסר את החולדה תא איזופלוריין כאשר הרדמה מלאה מושרה. לאשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטה הבוהן.

3. נוהל רכש

  1. להכין שהקפל פורטל 16 גרם (איור 3).
    1. מתחילים עם angiocatheter 16 גרם. לחתוך קטע 7 מ מ של אבובים. לקבוע את נקודת האמצע של מקטע 7 מ מ על ידי מדידת 3.5 מ מ. Incise אל נקודת האמצע ולהסיר את החלק הקדמי של הצנרת.
    2. השתמש עוצר דימום לרסק חלק שטוח עכשיו זה. להשתמש במשחה כדי להמיס את הקצה השני של angiocatheter כדי ליצור שפה. אין למקם את הטיפ ישירות על הלהבה או זה תוצת.
  2. הכינו את הצינורית צינור המרה.
    1. קח angiocath 27 G, לחתוך את הנמל הזרקת להשאיר רק את הקטטר. להתחבר זה קטע 10 ס מ של הצנרת cannular 27 G.
  3. מקם את העכברוש עם האף שלה בקונוס האף בהרדמה, שלה ארבע הגפיים. מרותק למיטה. לפקח על סימני החיים על ידי הצמדת שהצג הגפיים האחוריות השמאלי. לבצע צביטה הבוהן כדי לאשר עומק ההרדמה המתאימה. המשך הרדמה איזופלוריין 4% (לבעלי שמכבידים > 250 גרם).
  4. תרסיס הבטן של החיה עם אלכוהול איזופרופיל 70%. אפשר להתייבש. המקום סטרילי תלוי מעל בעל החיים.
  5. עושים קו האמצע חתך של מצאתי לשימוש לחיקו חדות מספריים והרחבת דרך העור (איור 4). הזן של הצפק ובעדינות תחתכי את השריר. לטפל כדי למנוע נזק לשלפוחית השתן של ההיבט נחות של החתך הזה ולכבד בהיבט מעולה של החתך.
  6. להרחיב את החתך רוחבית על ימין ועל שמאל כדי ליצור צלב ברמה של הגבול נחות של הכבד.
  7. להפוך את ההרדמה עד 2% (לבעלי שקילה > 250 גרם).
  8. . משכי הסרעפת באמצעות מלחציים נגד יתושים מעוקל הצלעות באמצעות צלעות רטרקטורים (איור 5).
  9. לחתוך את falciform, הסרעפת, והרצועות gastrohepatic עם מספריים חדות.
  10. אתר את העניבה-off הווריד הסרעפת 7-0 בתפר כמו קרוב ומקורו ככל האפשר למנוע דליפה.
  11. המעיים העכברוש באמצעות המוליך עצה של כותנה בטעימת סטרילי, עוטף את המעי גזה לחלח עם תמיסת מלח 0.9%. הקפידו לא למתוח את להערכת של המעי הדק.
  12. לנתח מעל הכלילי התחתון (IVC) כדי להסיר את עודפי רקמת. לנתח מאחורי IVC פשוט נעלה ההסתעפות ולהעביר לולאה של 4-0 בתפר משי לשימוש מאוחר יותר (איור 6).
  13. . משכי את הכליה הימנית כדי לספק חשיפה וריד הכליה. . משכי את האונה הימנית של הכבד עליונית עם גזה... . תקשור וריד הכליה 7-0 בתפר משי קרוב IVC ככל האפשר, לצרוב על פני זה דיסטלי השולטת (איור 7).
  14. בזהירות שווייץ וריד הטחול, תקשור אותו בעזרת שני תפרים משי 7-0, חצו אותה בין שתי התפרים.
  15. תקשור, מאתרים ומפסיקים ורידים נוספים באמצעות תפרים משי 7-0 עבור אורך נוסף על וריד שער הכבד, במידת הצורך.
    הערה: ישנם לפעמים ענפים קטנים של infrahepatic IVC בין וריד הכליה נכון את הכבד נחות.
  16. לנתח סביב העורק gastroduodenal, לקשור את העורק gastroduodenal 7-0 בתפר משי, מאתרים ומפסיקים את העורק gastroduodenal.
  17. לנתח סביב עורק הכבד ולאחר מכן מקם עניבה תפר משי 7-0 סביבו (איור 8).
  18. שווייץ המרה.
    1. בדוק את האורך של המרה. . תקשור צינור המרה בקצה הדיסטלי באמצעות 7-0 בתפר משי. במקום הלולאה של 7-0 בתפר משי סביב המרה הציר הקרוב ככל האפשר.
    2. לחתוך חור זה מחצית מהקוטר התעלה עם מספריים קטנות, למקם צנתר 27 G המרה הציר הקרוב. לקשור את הצנתר במקום באמצעות בתפר העניבה סנדל הרומי (איור 9).
  19. להזריק 0.5 מ של הפארין (50 U) לתוך הווריד הפין או IVC של החיה באמצעות מחט 27 גרם.
    הערה: מזרק אינסולין 27 G גם ניתן להשתמש במקום זאת.
  20. מלחציים, תקשור IVC באמצעות הקודם שמוקם תפר משי 4-0.
  21. . תקשור עורק הכבד באמצעות הקודם שמוקם תפר משי 7-0
  22. . להסיר וריד שער הכבד באמצעות סרטון המיקרוכירורגית מלקחיים נקרר את וריד שער הכבד באמצעות angiocatheter של 22 גרם. מיושרות וריד שער הכבד עם 60 מ ל תמיסת קר 0.9% עם הפרין 1 מ"ל (100 U) עד הכבד blanches (איור 10).
    הערה: אם הכבד לא בלנש מיד זה אפשר לעסות עם צמר גפן סטרילי עצה applicators.
  23. לחשוף את suprahepatic IVC, חצו אותו בתור גבוה בחזה ככל האפשר.
  24. בצע hepatectomy כדלקמן. . לחתוך את הסרעפת חתך את עורק הכבד, לחתוך את IVC, לחתוך וריד שער הכבד, לחתוך כל הרצועות נוספים, להוציא את הכבד. מקם את הכבד קרח קר 0.9% תמיסת מלח (איור 11).
  25. מקום מגבון וסקולרית 16 גרם וריד שער הכבד (איור 12). מקם את הכבד על המעגל זלוף הכבד normothermic ex-vivo .

4. זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

הערה: perfusate המשמש כאן הוכן פרוטוקול שלב 1.1.1.

  1. מקם את הצינורית וריד שער הכבד לווריד פורטל בעצור (איור 13).
  2. במהלך מיקום בצינורית וריד שער הכבד, לשמור על זרימה של perfusate דרך המעגל ב 2 מ ל/דקה כדי להתחיל. תסתכלו על המסך עבור התוך וריד שער לחץ; זה עשוי להצביע על הספינה יש להפוך occluded, מיקום מחדש של צנתרים הדרוש.
  3. תפר ב הצינורית IVC זרימה החזרה של perfusate השימוש בתפר משי 7-0.
  4. לאחר שני קנולות במקום, מתחילים להופיע את הזרימה ב- 1 מ ל/דקה עד לחץ פיזיולוגיים בטווח של 10-16 cmH2O.
  5. לקחת דגימה 1 מ"ל מן קדם ויציאות פוסט--0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו 240 דקות של זלוף. לחלק את הדגימה 1 מ"ל בשתי הדגימות 0.5 mL.
    הערה: 0.5 מ ל זה ישמש בשלב פרוטוקול 4.5.1, ו- 0.5 מ ל ישמש בשלב פרוטוקול 4.5.2.
    1. הצמד להקפיא 0.5 מ של דגימה זו צינורות קריוגני בחנקן נוזלי.
    2. להפעיל ניתוח גזים בדם באמצעות 0.5 mL הנותרים של perfusate.
    3. לאחר הפעלת הבדיקה גז דם בכל נקודה בזמן (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו- 240 דקות) לבחון את דרגות החומציות ואת החיץ את perfusate לפי הצורך כדי לחזור pH 7.4.
  6. בתום 4 שעות של זלוף, נתק את הכבד של המעגל זלוף. לחלק הכבד 0.5 ג'י מקטעים. הצמד הקפאת רקמת הכבד צינורות קריוגני בחנקן נוזלי.

5. ניסוי שלאחר ניתוח

  1. לקבוע אלנין aminotransferase (ALT) ברמה perfusate-0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו 240 דקות באמצעות ערכת מסחרי assay ערכי צבע מוחלטים.
    1. בקצרה, דגירה של perfusate עם ריאגנטים לערבב התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דק מדד הצפיפות האופטית ערכים-570 nm באמצעות קורא microplate.
  2. Homogenize 0.5 גרם של רקמת הכבד עם 100 µL פירוק מאגר ולנתח את הרקמה lysate אדנוזין טריפוספט (ATP), גלוטתיון (GSH) של malondialdehyde (מד א).
    1. בקצרה, למדוד את רמות ATP הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית. לערבב את הדגימה עם המאגר התגובה, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות מדד הצפיפות האופטית-570 nm באמצעות קורא microplate.
    2. למדוד את רמות GSH הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית. מערבבים את דגימות רקמה עם קוקטייל וזמינותו. למדוד את ערכי צפיפות אופטית-405-414 nm.
    3. למדוד את רמות מד"א של הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית. לערבב את הדגימות עם יפורסם ומחממים עד 95 מעלות צלזיוס במשך 60 דק צנטריפוגה מגיבים, להעביר את תגובת שיקוע צלחת 96-ובכן. למדוד את הצפיפות האופטית-532 ננומטר.
  3. Homogenize 0.5 גרם של רקמת הכבד עם 100 µL פירוק מאגר ולנתח את הרקמה lysate לפעילות היחסי של קספאז-3/7 באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית.
    1. לערבב את הרקמה lysate עם המאגר assay ריאגנט קספאז-3-7, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. למדוד את רמת קרינה פלואורסצנטית כל טוב באמצעות קורא microplate.
  4. לקבוע את הרמה של מוות תאים הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת זיהוי מוות מסחרי ב באתרו .
    1. מראש לטיפול של 0.5 g רקמות חלקים עם Proteinase U/mL 10 K 10 דקות, ואז דגירה עם תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות לבצע ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גודל דגימה של חולדות שלוש לכל קבוצה היה בשימוש. ALT נמדדה ב 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו 240 דקות של זלוף. השתמשנו הסטודנט t-בדיקות כדי להשוות בין תוצאות בין הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת פג-חתול קבוצות בכל נקודה בזמן. השוואת את הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת קבוצות פג-חתול, יש פחות באופן משמעותי (p < 0.05) ALT perfusate בסיס בתוספת פג-חתול הקבוצה ב 150, 180, 210 ו 240 דקות (איור 14 א').

רקמת הכבד היה רכש על מנת לנתח את רקמת נזק מן הן הבסיס perfusate perfusate בסיס בתוספת קבוצות פג-חתול. השתמשנו הסטודנט t-בדיקות כדי להשוות בין תוצאות בין הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת קבוצות פג-חתול. רקמות ATP נשמר את הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד perfusate הבסיס (איור 14 ב, p < 0.05). רקמות מד א הייצור היה גבוה באופן משמעותי בקבוצה perfusate בסיס מאשר הבסיס perfusate בתוספת את פג-חתול בקבוצה (איור 14C, p < 0.05). GSH הכולל נשמר את הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד perfusate הבסיס (איור 14D, p < 0.05).

כדי לנתח אפופטוזיס, רקמת הכבד קספאז 3/7 פעילות היה להשוות בין הקבוצות. קרינה פלואורסצנטית נמדדה כל היטב. השתמשנו הסטודנט t-בדיקות כדי להשוות בין תוצאות בין הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת קבוצות פג-חתול. פעילות קספאז 3/7 ירדו באופן משמעותי הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד perfusate הבסיס (איור 15A, p < 0.05). מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז (TdT) dUTP מכתים תיוג ניק-End (TUNEL) נעשה שימוש כדי להשוות אפופטוזיס בין הקבוצות. האחוז של מוות תאים היה פחות באופן משמעותי הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד בסיס perfusate (איור 15 ב p < 0.05).

Figure 1
איור 1: מעגל זלוף. מרכיבי המעגל מסומנות. Perfusate מתחיל במאגר perfusate (1), אשר הוא מיכל מים המעטפת. Perfusate הוא שלף מתוך המאגר על ידי משאבה רולר (2), דחף לתוך windkessel (3), ולאחר מכן את oxygenator (4). Oxygenator מוגדרת עבור גז countercurrent perfusate זרימה לספק חילוף הגזים המרבי. Perfusate מכן ממשיך את סליל חימום (5) בתוך החדר זלוף כדי לוודא שהוא עומד בבית הטמפרטורה הפיזיולוגיות, מלכודת בועות (6) כדי למנוע זלוף של בועות אוויר. ישנם איברים מראש (7) ו עוגב שלאחר (8) מדגם יציאות, אשר מאפשרים את perfusate מתחננות שיטעמו. Perfusate ואז נכנס דרך הצינורית וריד שער הכבד. הצינורית וריד שער הכבד מחובר לצג לחץ, המסדירה את האקולייזר לחץ (9). לבסוף, perfusate משך מהגוש לחץ בחזרה דרך המשאבה רולר, רוקן לתוך המאגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: חדר הניתוח ולהגדרה כלי כירורגי. מיקרוסקופ כירורגי (1) צריך ניתן לכוונן את הגובה המתאים ואת ההגדלה עבור המשתמש. איזופלוריין ניתן לטעון מראש לתוך מכונת ההרדמה (2). האף של החיה ממוקם קונוס האף (3). מכשירי ניתוח צריך להיות פרוש שבהם הם עשויים להיות בעלי גישה קלה (4). לאחר electrocautery (5) בקרבת מקום הוא מועיל. התפרים (6) צריך להיות חתוכות מראש כך ניתן להשיג חלקים במהירות בעת הצורך, במיוחד צריך להיות זמין (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הכנת שהקפל וריד שער 16 גרם- מתחילים עם angiocatheter 16 גרם. לחתוך קטע 7 מ מ של אבובים. לקבוע את נקודת האמצע של מקטע 7 מ מ על ידי מדידת 3.5 מ מ. Incise כאן ולהסיר את החלק הקדמי של הצנרת. השתמש עוצר דימום לרסק חלק שטוח עכשיו זה. השתמש מצית כדי לצרוב את הקצה השני של angiocatheter כדי ליצור ערכת lip. אין למקם את הטיפ ישירות על הלהבה או זה תוצת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: קו האמצע החתך. עושים קו האמצע חתך של מצאתי (1) ל עצם בושת (2) באמצעות חדות מספריים והרחבת דרך העור והשרירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: לקבל התנצלות הולמת. . משכי הסרעפת (1) באמצעות מלחציים נגד יתושים מעוקל (2) והצלע על-ידי הצבת רטרקטורים צלעות (3, 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ניתוח הכלילי (IVC). להעיף את הכבד עד וחושפים הכליה הימנית (1) ואת וריד שער הכבד (2). לנתח בסביבה IVC (3) ולמקם לולאה של 7-0 בתפר לשימוש עתידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: מצדו של וריד הכליה נכון. . משכי את הכליה הימנית (1) לספק חשיפה לוריד הכליה. . תקשור הווריד יותרת הכליה, קיצור דרך זה. גזה בטעימת (2) יכול לשמש כדי להגן על הכבד במהלך זה תמרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: עורק הכבד. לנתח סביב ולמקם עניבה סביב עורק הכבד (1) ליד שבו הוא עובר תחת וריד שער הכבד (2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: תעלות המרה. Cannulate המרה (1) שימוש את angiocatheter 27 G (2) מחובר הצנרת 27 G (3). זה יעזור כדי לאסוף המרה במהלך זלוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10: סומק הכבד. לשטוף את הכבד (1) עם 60 cc תמיסת קר 0.9% עם 100 U (1 מ"ל) הפארין באמצעות angiocatheter של 16 גרם (2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11: לאחר hepatectomy. לבצע hepatectomy ולמקם את הכבד בתוך תמיסת מלח קר. לטפל לא כדי לסלק את הצינורית צינור המרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12: וריד שער הכבד אוזקים. אתר וריד שער הכבד. להשתמש במלחצת גדול (1) לעכב את הווריד עוזב מספר מילימטר-lip של וריד מעל המלחציים. השתמש המיקרוכירורגית מלקחיים (2, 3) כדי למקם מגבון וסקולרית 16 גרם (4) וריד שער הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 13
איור 13: וריד שער הכבד ומכונת תעלות IVC מעולה. נקרר את וריד שער הכבד (1) ומכונת IVC סופריור (2). יש לנקוט זהירות רבה לא לנתק את הצינורית צינור המרה (3). בנוסף, הקפידו לא לעוות את IVC מעולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 14
איור 14: ניתוח של רקמת נזק הבסיס perfusate perfusate בלבד, הבסיס, וגם קבוצות פג-חתול (N = 3/קבוצה). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. (א) אלנין aminotransferase (ALT) רמות. השוואת רמות ALT בין הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת קבוצה pegylated-קטלאז (פג-חתול), קיימת באופן משמעותי פחות ALT perfusate בסיס בתוספת פג-חתול הקבוצה ב 150, 180, 210 ו 240 דקות (p < 0.05). רמות אדנוזין טריפוספט (B). רקמות אדנוזין טריפוספט (ATP) נשמר את הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד perfusate בסיס (p <0.05). רמות Malondialdehyde (C). רקמת ייצור malondialdehyde (מד א) היה גבוה באופן משמעותי בקבוצה perfusate בסיס מאשר הבסיס perfusate בתוספת את פג-חתול בקבוצה (p < 0.05). רמות גלוטתיון (D). סך גלוטתיון (GSH) נשמר את הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד perfusate הבסיס (p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 15
איור 15: ניתוח של אפופטוזיס הבסיס perfusate perfusate בלבד, הבסיס, וגם קבוצות פג-חתול (N = 3/קבוצה). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. (א) קספאז-3/7 Activity.Caspase 3/7 פעילות ירדו באופן משמעותי הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת הקבוצה לבד perfusate הבסיס (p < 0.05). (B) מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז (TdT) dUTP תיוג ניק-End (TUNEL) מכתים. התמונות צולמו באמצעות של 4x מיקרוסקופ פלואורסצנטי. האחוז של מוות תאים היה פחות באופן משמעותי הבסיס perfusate בתוספת פג-חתול קבוצה לעומת בסיס perfusate (p < 0.05). ירוק: מוות תאים. כחול: גרעיני. גודל ברים = 1,000 מיקרומטר. TUNEL חיובי התאים היו לכמת על ידי ספירת תאים משדות מיקרוסקופיים אקראי 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קיים מחסור משמעותי של allografts הכבד זמין עבור השתלת, בתגובה קריטריונים התורם היה מורחב1,2,3,4,5. בשל המחסור התורם, NEVLP כבר הציג כשיטה להעריך ולשנות איברים פונקציה6,7. עיצבנו עכברוש מודל של NEVLP. יתר על כן, השתמשנו מודל זה כדי להדגים אחד מהיישומים פוטנציאל חשוב שלה – בדיקה של מולקולה הרומן תוספות כדי perfusate הכבד. כאן, הוספנו פג-החתול perfusate הבסיס והפגינו את יכולתה לצמצם פגיעה בכבד שימור.

שלבים קריטיים

המעגל זלוף הכבד היה לקנות ולהשתמש בהם ללא שינוי. ניתן לאבחן את המעגל באיור1. המאגר perfusate בשימוש הוא מיכל מכסה מים המשמש כדי לשמור את perfusate בטמפרטורה פיזיולוגיים. מן המאגר perfusate יצא החוצה על ידי מכבש שאוב ודחפו לתוך תא windkessel. החדר הזה מסייע לצנן את זרימת פועמת perfusate ולהפוך אותו יותר למינריות עבור הערך לתוך איבר המין. לאחר windkessel קאמרית על תזרימי perfusate כדי oxygenator. Oxygenator מוגדר countercurrent גז, perfusate זרימה לספק גז מקסימלית exchange כדי perfusate 95% חמצן. Perfusate מכן ההכנסות סליל חימום כדי לוודא שהוא עדיין בטמפרטורת פיזיולוגיים. מלכודת בועות ממש לפני האיבר מונע זלוף של בועות אוויר. Perfusate נשאבים ואז לצאת המלכודת בועות ובאמצעות את הצינורית וריד שער לתוך הכבד. הצינורית וריד שער הכבד יש סניף קטן ממנו שהצג לחץ. צריכה להיות בשלה הצנרת החיישן בנוזל לא אוויר אז אין אובדן הלחץ החיישן. לאחר oxygenating האיבר, perfusate יאזלו הכבד דרך הצינורית וריד נחות כדי אקולייזר לחץ. הרחוב אקולייזר הלחץ מסייע למנוע לחץ של מעגל או איברים. לבסוף, perfusate משך מהגוש לחץ בחזרה דרך המשאבה רולר, רוקן לתוך המאגר.

לפני תחילת כל זלוף בדיקה ויזואלית של המעגל צריכה להתבצע כדי לזהות כל נזק או הצטברות על רכיבי מעגל או אבובים. אם יש הצטברות של חיידקים או חומרים אחרים על המעגל, צריך חלקים להחליפם או לנקות, במידת האפשר. בשלב הבא, הפתרון דטרגנט שמירה על הרכיבים הפנימיים כדאי לשטוף. כל הרכיבים הם להיות לשטוף החוצה את חיישן הלחץ, קו הלחץ צריך הגעלה של בועות אוויר עם מים יונים. גם, צריך להיות מותאם זרימה במרווחי זמן קבועים כדי לוודא הלחץ קריאה מגיבה בהתאם לשינויים. אם החיישן לחץ אינו מגיב כראוי, כל הפריטים בקו החיישן צריך להיות בדק, חותמת במידת הצורך. בתחילת זלוף חשוב לוודא כלי הדם של הכבד לא הופכים. לפגוע או מעוותת בעת התחברות הכבד אל המעגל. אם זה התרחש שם ספייק לחץ מיידית יראו על המסך במגמה לוגריתמי. השגיאה הנפוצה ביותר היא והציצה וריד שער הכבד עם בצינורית לקוי בכל אחד מחדריו. ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הזזת את כלי הקיבול סמיכה יותר טבעי על ידי משיכתו מעט בחוץ מיישר את וריד שער הכבד. הצג לחץ מציין ברזולוציה של הבעיה עם ירידה בלחץ ועקביות משופרת. בשלב הבא, בעת התחברות שהקפל וריד שער הכבד הצינורית וריד שער הכבד כלי הקיבול יכול מתעוותים זלוף ופגיעה של האיבר. התאמת שהקפל ותיקון שגיאה זו תגרום יתד פתאומית בלחץ וריד שער זה ואז מיד לחזור לחץ נמוך ורמת חופש-זרימה עקבית. ניתן לזהות של IVC. לפגוע או מעוות במהירות על ידי אין זרימת מן את הצינורית בולטות של כלי השיט. שתי שגיאות אלה ב- הווריד הנבוב גם תוצאה של לחץ מוגבר, אולם בניגוד וריד שער הכבד הצרות הלחץ הזה הוא ללחוץ על איבר המין ואת צריכה להיפתר במהירות. בעיה זו נפתרה בתוך 10 דקות או יש לבטל את הניסוי. אינדיקציה עבור מבטל את הניסוי רואה ברור בצקת באיבר במרחק 20 דקות קודם.

אם יש דליפה מן הכבד, או מאחד מן החיבורים בצינורית זה יהיה חשוב לעקוב אחר רמת מאגר perfusate. אוזל perfusate ושאיבה אוויר יכול להיות קטסטרופלי הניסוי. ברגע אוויר נשאב לתוך הקווים בלתי אפשרי פריים מחדש את קווי צינורות ובדק את הניסוי. התיקון האפשרי היחידי הוא מלכודת בועות ללכוד את האוויר מוזרק.

שינויים ופתרון בעיות

ברגע המעגל שרוקן oxygenator ניתן לשים קו ו אז המעגל יכול להיות בשלה עם perfusate. כראוי טיהור אוויר מ oxygenator יכולה לקחת כמה דקות אבל היא צעד מכריע בהפיכת בטוח שמתסחיף אוויר לא נוצר באמצע זלוף. לאחר oxygenator יעבוד באופן מלא עם perfusate שמלכודת בועות אמורה להיות מלאה לצד לכידת בועות אוויר כי הטופס. בשלב זה הזרם במעגל צריך להיות מוגדר זרם של 1 או 2 mL/min לשמור את perfusate עד הכבד הוא מוכן תעלות.

לאחר cannulating וריד שער הכבד, IVC את הכבד, הלחץ צריך להגדיל, ואז גובה. כמו זרימה מוגברת של לחץ פיזיולוגי נורמלי הלחץ מוקלטות צריך להתחיל להגדיל באופן stepwise דומה. ברגע הזרימה הרצויה (8-16 מ מ כספית) השיגה הלחץ צריכים להישאר קבוע למדי. נוכל לכוון בלחץ של 10 מ מ כספית, להתאים את זרימת בהתאם. הזרם הנדרש כדי להגיע בלחץ של 10 מ מ כספית עשויים להשתנות על ידי איברים. אולי יש דליפה קלה של perfusate של איבר המין אבל זה perfusate יכול להיות לאסוף והוחזר למאגר המים.

המעגל צריך לנקות אחרי כל זלוף לשמור את החדר ואת מאגר וכדי לשמר את צינורות חד פעמיות יציאות. כל perfusate יש להסיר מן המעגל. המעגל צריך יבוצע ריקון מיידי עם מינימום של 300 מ ל מים יונים. בעוד המים יונים ריקון הצנרת מעגל שצריך לנקות את החלקים החיצוניים כראוי. רכיבים חיצוניים צריך להיות ישטפו או בעדינות ניגבו ולא לאוויר יבש. רכיבים במעגל הם שבירים, עלולים להיפגע בקלות. לכן זה בעל חשיבות עליונה כדי לנקות אותו בעדינות. המעגל הפנימי צריך להישמר בריכוז 5% של דטרגנט אלקליין במים יונים כאשר אינו בשימוש. ? הנוזל במעגל מסייעת כדי להאריך את חיי הצנרת, למנוע הצטברות על רכיבים אחרים, כגון מלכודת בועות ולחץ אקולייזר.

ניתן למנוע רוב הקשיים עם המעגל עם יסודית ניקוי ותחזוקה של המעגל אחרי כל שימוש. פעולה זו מסייעת להבטיח יש אין הצטברות משקעי perfusate זה יכול להוביל צינורות סתומים או קנולות. רכיבים במעגל של אבובים צריך להיות בדק באופן קבוע והחליף כנדרש לפני כל שימוש כדי לוודא כי אין זיהום או הגבלת זרימת.

מגבלות

מגבלה של דגם NEVLP בעלי חיים קטנים זה היא כי היא אינה כיום כוללת זלוף שלאחר ההשתלה. לכן ניתן להעריך תפקוד הכבד שתל לאחר ההשתלה. זהו אזור חשוב למחקר עתידי. בנוסף, ניצול המעגל בעלי חיים קטנים דורש מיומנות וידע.

משמעות לגבי המודלים הקיימים

חזירי, מאתר (עכברים) דגמי זלוף בהיפותרמיה, subnormothermic ו- normothermic ex-vivo הכבד תוארו בספרות. למרות המחלוקת עדיין קיימת לגבי הטמפרטורה זלוף, הוכח כי זלוף מכונת הזה יכול לשפר את תפקוד הכבד שתלים ללא קשר לטמפרטורה9. המודל NEVLP המובאת כאן היא פשוטה, בקלות ניתן לשכפול, עלות נמוכה, ויש מגוון רחב של יישומים. מודל זה אינו כולל דיאליזה או זרימה פועמת עורק הכבד, אשר הינם כלולים גם דגמים אחרים, כמו הם הוכחו להיות מיותרים9,13. יתר על כן, התוצאות של הניסויים האנושית הראשונה באמצעות NEVLP הראו שזו תהיה שיטה יעילה השתמרות הכבד – לכן, מודל זה הינו אידיאלי עבור יישומים עתידיים של ex-vivo זלוף כבד10בדיקות.

יישומים עתידיים

מגוון רחב של יישומים עתידיים עבור NEVLP הוצעו בספרות. שכל אחד מהם צריך להיבדק באופן שיטתי במודלים של בעלי חיים לפני בדיקות באיברים אנושיים זרוקים, ואז תוך כבדי אדם. המודל המוצג כאן הינו אידיאלי עבור בדיקות אלה יישומים עתידיים הרומן כפי שזה בקלות ניתן לשכפול, מבטלת צעדים שאינם שייכים, עלותו נמוכה. אחד היישומים הפוטנציאליים החשובים ביותר של מודל זה הוא זה שמוצג כאן - בדיקה של הרומן perfusate תרופתי תוספים. יישומים אחרים המוצע כוללים תיקון איברים פגומים, defatting של כבדי להתיר השתלת איברים steatotic, הקדמה של התנגדות נגיפי הפטיטיס C, טיפול בתאי גזע mesenchymal, התאמת גנים זלוף עם immunosuppressant סוכנים11,31,32,33,34,35,36,37,38.

מסקנות

לסיכום, הראו מודל NEVLP זול, בקלות ניתן לשכפול באמצעות חולדות. השימוש מודל זה דורש הכנה זהירה, התמחות וידע, אבל יכול להיות מיושם במחיר נמוך. יישומים של מודל זה יכול לכלול בדיקות תוספי perfusate הרומן, כפי הודגם בתוצאות נציג. יישומים נוספים של מודל זה עשוי לכלול בדיקות תוכנה שתוכננה עבור איברים הערכה, perfusates שונים, ואת נושאות חמצן מלאכותי או מבוסס-המוגלובין סוכנים נועדה לתקן את האיברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מדווחים שיש להם אין גילויים הרלוונטיים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32AI 106704-01A1, קרן פלש טי השתלת איברים, זלוף, הנדסה, התחדשות ב אוניברסיטת אוהיו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusate
8% Albumin CLS Behring, King of Prussia, PA 0053-7680-32
Williams Media Sigma Aldrich, St. Louis, MO W1878
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, St. Louis, MO P4333
Insulin Eli Lilly, Indianapolis, IL 0002-8215-91
Heparin Fresnius Lab, Lake Zurich, IL C504701
L-glutamine Sigma Aldrich, St. Louis, MO G3126
Hydrocortisone Sigma Aldrich, St. Louis, MO H0888
THAM Hospira, Inc, 0409-1593-04
Polyethylene Glycol - Catalase Sigma Aldrich S9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical Mask Generic N/A
Protective Gown Generic N/A
Surgical Gloves Generic N/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley Rat Harlan Sprague Dawley Inc. 250 -350 grams
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Piramal Healthcare N/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe  Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen Praxair 98015
Rib retractors Kent Scientific INS600240
GenieTouch Kent Scientific GenieTouch
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven Sponges Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5mL Syringe BD REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical REF 103-S
16 gauge Catheters BBraun Introcan Safety 4252586-02
14 gauge Catheters BBraun Introcan Safety 4251717-02
Bile Duct Cannular Tubing Altec 01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath Warmer Lauda Ecoline Staredition E103
Data Collection Software ADInstruments  Labchart 7
Liver Perfusion Circuit Harvard Apparatus 73-2901
Membrane Oxygenator Mediac SPA M03069
Roller Pump Ismatec ISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) Praxair 98015
Organ Chamber Harvard Apparatus ILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific 1418-7410
Mucasol Sigma-Aldrich Z637181
Microsurgical Instruments
Small Scissors Roboz RS-5610
Large Scissors S&T SAA-15
Forceps - Large Angled S&T JFCL-7
Forceps - Small Angled S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip S&T FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Small Mosquito Clamps Generic N/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit BioVision K752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit BioVision K354
Glutathione Assay Kit Cayman Chemical 703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit Abcam ab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems Promega G8090
POLARstar OMEGA Microplate Reader BMG LABTECH N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
  2. OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
  3. Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
  4. Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
  5. Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
  6. Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
  7. Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
  8. Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
  9. Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
  10. Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
  11. Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
  12. Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
  13. Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
  14. Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
  15. Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
  16. Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
  17. Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
  18. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
  19. Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
  20. Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
  21. He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
  22. Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
  23. Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
  24. Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
  25. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
  26. Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
  27. Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
  28. Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
  29. Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
  30. Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
  31. Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
  32. Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
  33. Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
  34. Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
  35. Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
  36. Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
  37. Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
  38. Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).

Tags

רפואה גיליון 136 Normothermic לשעבר vivo זלוף הכבד NEVLP שולי איברים מורחב קריטריונים תורמים במודל חיה קטנה מכרסמים עכברים
מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic<em> Vivo לשעבר </em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., … More

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Akateh, C., Eren, E., Maynard, K., Sen, C. K., Zweier, J. L., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (136), e57541, doi:10.3791/57541 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter