Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكولات المصادقة الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 كهدف المخدرات في سرطان الدم باستخدام الماوس الوراثية وأنسنة في المختبر والمجراه في نماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

Abstract

مظاهرة تيروزين كيناز مثبطات (تكيس) في علاج سرطان الدم النقوي المزمن (CML) وقد يبشر بعهد جديد في علاجات السرطان. ومع ذلك، عدد صغير من الخلايا لا تستجيب ل TKI العلاج، أسفر عن الأمراض المتبقية الحد الأدنى (MRD)؛ فشل تكيس حتى أقوى للقضاء على هذه الخلايا. هذه الخلايا MRD بمثابة مستودع تطوير مقاومة للعلاج. ولا يعرف لماذا غير فعال ضد الخلايا MRD TKI العلاج. عامل النمو مما يشير إلى تورط في دعم بقاء الخلايا MRD أثناء TKI العلاج، ولكنها تفتقر إلى فهم ميكانيكية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المنحدر ج مرتفعة وتعبير Dusp1 نتيجة متقاربة النمطان وعامل النمو الإشارات في الخلايا MRD التوسط المقاومة TKI. يجعل التضليل الحساسة رائع تكيس تثبيط الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 ويشفي التضليل في كلا النموذجين الوراثي وأنسنة الماوس. وقد حددنا هذه الجينات المستهدفة باستخدام عدة [ميكروارس] من TKI-حساسة-وخلايا مقاومة. هنا، نحن نقدم طرق للتحقق من صحة الهدف باستخدام الماوس في المختبر والمجراه في النماذج. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على أي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

Introduction

يؤدي النشاط كيناز تيروزين التأسيسي للمركز-ABL1 الانصهار السرطاني التضليل، الذي يوفر الأساس منطقي لاستهداف النشاط كيناز بمثبطات جزيء صغير. نجاح تكيس في علاج مرضى CML أحدثت ثورة في مفهوم العلاج المستهدفة1،2. وفي وقت لاحق، قد وضعت كيناز المضادة العلاج كدواء الدقة لعدة الأورام الخبيثة الأخرى، بما في ذلك الأورام الصلبة. وحتى الآن، أكثر من ثلاثين kinase مثبطات أقرها "المتحدة الدولة إدارة الأغذية والعقاقير" لعلاج الأورام الخبيثة المختلفة. بينما TKI العلاج فعالة جداً في القضاء على هذا المرض، إلا أنها ليست العلاجية. وعلاوة على ذلك، استمر عدد صغير من الخلايا السرطانية أثناء فترة العلاج:4،3،5. وبقي حتى المرضى الذين أظهر مغفرة كاملة مع MRD، التي قمعت في نهاية المطاف نتائج في الانتكاس إذا لم يكن بشكل مستمر. ولذلك، يلزم القضاء على الخلايا MRD لتحقيق استجابة دائمة أو العلاجية. التضليل يمثل نموذجا قيماً لتعريف مفهوم الطب الدقة، وآليات أونكوجينيسيس والعلاجات الموجهة الهدف الرشيد، وتطور المرض والمقاومة للعقاقير. ومع ذلك، وحتى اليوم، إليه القيادة موت الخلايا المستحثة TKI في الخلايا السرطانية ليست مفهومة تماما، ولا لماذا MRD الخلايا (التي تتألف من الخلايا الجذعية ليوكيميك []) مقاومة جوهريا تكيس4،6. على الرغم من ذلك، هو ظاهرة "السرطاني الاعتماد" إلى أونكوبروتين كيناز متحولة المتورطين في فعالية TKI حيث يسبب تثبيط السرطاني المستهدفة تكيس الحاد حدوث صدمة النمطان التي تؤدي إلى استجابة بروابوبتوتيك ضخمة أو التتابع في الخلية طريقة تعتمد على السياق6،7،،من89. ومع ذلك، تفتقر إلى الأساس آليا للاعتماد السرطاني. وقد تورط الدراسات الأخيرة أن إشارات عامل النمو ويلغي الاعتماد السرطاني ويضفي عليه مقاومة TKI العلاج10،،من1112. ولذلك، للحصول على نظرة ثاقبة إليه الاعتماد السرطاني، أجرينا التعبير كل الجينوم التنميط من المركز-ABL1 مدمن والخلايا نوناديكتيد (نمت مع عوامل النمو)، التي كشفت عن أن ج-المنحدر و Dusp1 من الوسطاء الحرجة من إدمان السرطاني13. حذف الوراثية ج-المنحدر و Dusp1 الخلايا القاتلة للتعبير عن ABL1 بنك الاصطناعية والفئران استخدمت في التجربة لم يطور سرطان الدم. وعلاوة على ذلك، شُفي تثبيط ج-المنحدر و DUSP1 بمثبطات جزيء صغير التضليل التي يسببها ABL1 بنك في الفئران. وتبين النتائج أن مستويات التعبير ج-المنحدر و Dusp1 بتحديد عتبة أبوبتوتيك في الخلايا السرطانية، حيث أن المستويات الأدنى يضفي حساسية المخدرات بينما تسبب ارتفاع مستويات مقاومة للعلاج13.

تحديد الجينات القيادة الاعتماد السرطاني، أجرينا عدة التعبير كل الجينوم التنميط تجارب حضور عامل النمو و TKI (imatinib) باستخدام كلا الماوس-والتضليل المستمدة من المريض خلايا (K562). وجرى تحليل هذه البيانات بالتوازي مع التضليل المريض مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من CD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم قبل وبعد العلاج مع imatinib. كشف هذا التحليل عن ثلاثة جينات (عامل النسخ [ج-المنحدر]، وخصوصية المزدوج الفوسفاتيز 1 [Dusp1]، والحمض النووي الريبي ملزمة بروتين [Zfp36]) الذي يشيع أوبريجولاتيد في خلايا مقاومة TKI. للتحقق من أهمية هذه الجينات في منح المقاومة للعقاقير، قمنا بتنفيذ التحليل في المختبر و في فيفو خطوة بخطوة. وأكدت مستويات التعبير هذه الجينات قبكر في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) وغربي النشاف في خلايا مقاومة للأدوية. علاوة على ذلك، كدنا overexpression وضربه قاضية بدبابيس الشعر شرنا من ج-المنحدر، Dusp1، و Zfp36 كشفت أن مرتفعة ج-المنحدر والتعبيرات Dusp1 الكافية واللازمة لمنح المقاومة TKI. ولذلك، أجرينا المجراة في التحقق من صحة باستخدام نماذج الماوس مع ج-المنحدر و Dusp1 فقط. للتحقق من الصحة الوراثية ج-المنحدر و Dusp1، ونحن إنشاء روساكريرت-إيندوسيبلي ج-المنحدرfl/fl الفئران (خروج المغلوب الشرطي)14 وعبرت لهم مع Dusp1-/- (خروج المغلوب على التوالي)15 جعل ROSACreERT2-ج--المنحدرfl/fl Dusp1-/- الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة. الخلايا المشتقة من نخاع العظم ج-كيت+ (من ج-المنحدرfl/فلوريدا-، Dusp1--/----، وج-المنحدرfl/flDusp1--/--) معربا عن المركز-ABL1 قد تم تحليلها في المختبر في تشكيل مستعمرة المقايسة وحدة (زيمبابوي)، و في فيفو بزرع نخاع العظام في الفئران المشععة قاتلة، لاختبار شرط ج-المنحدر و Dusp1 منفردة أو مجتمعة في تطور سرطان الدم. وبالمثل، الموانع الكيميائية ج-المنحدر من DFC (ديفلوريناتيد الكركمين)16 و Dusp1 من BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 تم اختبارها في المختبر والمجراه في استخدام المركز-ABL1-الإعراب عن، العظام الخلايا المشتقة من نخاع ج-كيت+ من الماوس (WT) البرية من نوع. لتأكيد شرط ج-المنحدر و Dusp1 في الخلايا الجذعية ليوكيميك، نحن تستخدم نموذج ماوس التضليل حيث حملت ABL1 المركز على وجه التحديد في خلاياه الجذعية الدوكسي (تعرب عن ترانساكتيفاتور تيت تحت الخلايا الجذعية موريني اللوكيميا (SCL) الجين 3 ' محسن لائحة)18،19. قمنا باستخدام نخاع العظام لين–الخلايا Sca++ (LSK) ج-مجموعة من هذه الفئران في مقايسة المجراة في زرع. وعلاوة على ذلك، أنشأنا مستويات فوبشو-p38 والتعبير عن إيل-6 كالمؤشرات الحيوية الديناميكية دراسة معمقة من العقاقير Dusp1 وتثبيط ج-المنحدر، على التوالي، في فيفو. وأخيراً، توسيع نطاق الدراسة للبشرية أهمية، المستمدة من المريض CD34+ الخلايا (ما يعادل الخلايا ج-كيت+ من الفئران) كانت تعرض على المدى الطويل في المختبر الشروع في ثقافة الخلية فحوصات (لتسيك) ونموذج ماوس أنسنة المجراة في التضليل20،21. تم زرع الفئران العوز مع التضليل CD34 + الخلايا، متبوعاً بالعلاج من تعاطي المخدرات وتحليل لبقاء الخلية ليوكيميك البشرية.

في هذا المشروع، نقوم بوضع أساليب لتحديد الهدف وعمليات التحقق من الصحة باستخدام الأدوات الجينية والكيميائية على حد سواء، باستخدام نماذج الإكلينيكية المختلفة. يمكن تطبيق هذه الأساليب بنجاح التحقق من صحة الأهداف الأخرى تطوير الطرائق الكيميائية للتنمية العلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في المستشفى الطبي مركز (كتشمك سينسيناتي الأطفال). العينات البشرية (BM عادي وأنه من التضليل (p210-المركز-ABL +) اللوكيميا) تم الحصول عليها عن طريق البروتوكولات التي وافق عليها "مجلس المراجعة المؤسسية" (مجلس المراجعة المؤسسية: المركز الطبي في مستشفى فيديرالويدي ضمان #00002988 سينسيناتي الأطفال) و موافقة الجهات المانحة-وأبلغ من كتشمك وجامعة سينسيناتي.

1-في الوقت الحقيقي قبكر التحليل

  1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا BaF3 المتنامية في ربمي تكملة مع 10% FBS و 10% WEHI قضى الثقافة المتوسطة كمصدر انترلوكين-3 (إيل-3).
  2. حصاد الخلايا في مرحلة لوغاريتمي (99% على قيد الحياة) من المعالجة (إيل-3 و imatinib) وكذلك من عينات غير المعالجة، والطرد المركزي لهم في 435 س ز لمدة 3 دقائق. الصحية ومراحل نمو الخلايا حاسمة لملفاتهم التعبير الجيني يمكن أن يتغير بشكل كبير.
  3. عزل الحمض النووي الريبي بتنقية الحمض النووي الريبي إجمالي22. التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي المجموع؛ ثم، إخضاعه ل معاملة الدناز23. تحويل كميات متساوية من خالية من الحمض النووي الريبي (2 ميكروغرام) إلى كدنا مع المنتسخة العكسية24.
  4. أداء قبكرس مع الإشعال الخاصة بالجينات (الجدول 1). القيام بتقارير إتمام المشروعات في 20 ميليلتر التفاعلات في 0.2 مل، رقيقة الجدران أنابيب PCR مع قبعات الضوئية، بوليميراز 1 x استخدام مزيج (انظر الجدول للمواد)، 0.5 ميكرون لكل التمهيدي، 1 ميليلتر من الحمض النووي، والمياه. ضع رد فعل في ثيرموسيكلير مع دورة التالية: الخطوة 1، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ الخطوة 2، 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ الخطوة 3 في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ الخطوة 4، كرر الخطوات من 2-3 مرات 40. أداء جميع تقارير إتمام المشروعات في تريبليكاتيس وتطبيع البيانات في الوقت الحقيقي للتعبير β أكتين قبل التآمر.

2-الغربية النشاف

ملاحظة: أعدت مقتطفات كامل الخلية بإضافة 250 ميليلتر من 1 × تحلل المخزن المؤقت كما هو موضح في كيسارواني et al.13 تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل، ومثبطات الفوسفاتيز 2 كوكتيل.

  1. حصاد الخلايا BaF3 5 مليون في مرحلة لوغاريتمي (99% على قيد الحياة) من معاملة (إيل-3 و imatinib) فضلا عن الخلايا من BaF3 غير المعالجة بالطرد المركزي في 435 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت تحلل (250 ميليلتر) من بيبيتينج صعودا وهبوطاً x 1، متبوعاً حضانة 5 دقيقة عند 80 درجة مئوية. Sonicate لكسر جميع الحمض النووي مع البقول 5 – 6 من 5 s كل في غرفة باردة في 4 درجات مئوية.
  2. نقل إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي أنه في س 16,000 ز لمدة 5 دقائق لإزالة أي مواد غير قابلة للذوبان. ويمكن تخزين الاستخراج في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة حرارة قبل التحميل. تحميل 10 ميليلتر من العينة باستخدام تلميح هلام-تحميل على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%.
  3. حل البروتينات في 150 الخامس حتى صبغ إشارة تصل إلى الجزء السفلي من الجل. نقل البروتين للأغشية النيتروسليلوز نقل الغرواني الكهربي في 1 أمبير ح 1. بعد النقل، كتلة الأغشية في 1 × تريس مخزنة المالحة + 0.1% 20 توين (تبسة) مع الحليب غير الدسم 5% ح 1 والتحقيق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة المناسبة في إضعاف 1:1,000.
  4. غسل الأغشية 3 x 5 x مع تبسة لمدة 10 دقائق في كل؛ ثم، من التحقيق مع مترافق HRP مناسبة ثانوي جسم (1:5، وتمييع 000) في درجة حرارة الغرفة ح 1. مقدار تبسة المستخدمة يعتمد على حجم الحاوية. تأكد من غمر الغشاء في تبسة تماما. أغسل جسم الثانوي 3 x ل 5 دقائق مع تبسة.
  5. وضع وصمة عار باستخدام كاشف الركيزة تشيميلومينيسسينت. مزيج من كميات متساوية من الركيزة والمخزن المؤقت من زجاجتين، الحق قبل الاستخدام. إضافة الركازة إلى الجزء العلوي من الغشاء الذي يغطي الغشاء كله مع ماصة 1 مل واحتضان لمدة 1 دقيقة. وينبغي أن تصويرها البقع داخل 1 – 10 دقيقة من إضافة الركازة.
  6. استخدام الملقط حادة، بعناية مكان الغشاء على منصة نظام التصوير (انظر الجدول للمواد)، تجنب الكثير من السائل. حدد طريقة عرض لايف واختر البقع وتشيميلومينيسسينسي من القائمة. استخدام اقتناء اليدوي، الحصول على التعرض لأخطار متعددة في نقاط زمنية مختلفة. هذه الملفات يمكن تصور وقياسها كمياً باستخدام برامج التصوير.

3-جيل فئران خروج المغلوب

  1. عبر الفئران ج-المنحدرfl/fl مع الفئران ROSACreERT2 لتوليد المنحدر ROSACreERT2cfl/fl الفئران13. لإنشاء الفئران (كو) مزدوجة-خروج المغلوب، تولد الفئرانfl/fl المنحدر ROSACreERT2c مع Dusp1--/-- الفئران لتوليد المنحدر ROSACreERT2cfl/fl Dusp1--/-- الفئران13. النمط الوراثي الفئران بذيل القصاصات التي تليها بكر، كما هو موضح أدناه.
  2. الوراثي:
    1. إعداد الحمض النووي ومقطع جزء صغير جداً من الذيل مع المقص ووضعه في أنبوب 1.5 مل. كوي الذيل مع مقص ساخنة. إضافة 200 ميليلتر من 50 مم هيدروكسيد الصوديوم بذيل المقطوعة في الأنبوب واحتضان عند 95 درجة مئوية في كتلة حرارة ح 1.
    2. دوامة الأنبوب جيدا، وتحييد ثم قم بإضافة 50 ميليلتر من 1 M HCl تريس الأس الهيدروجيني 6.8 ودوامه مرة أخرى. الطرد المركزي الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
    3. القيام بتقارير إتمام المشروعات في ردود الفعل ميليلتر 20 مل 0.2، رقيقة الجدران أنابيب PCR باستخدام 1 x Taq بوليميريز الرئيسي مزيج يحتوي على صبغ، 0.5 ميكرون لكل التمهيدي، 1 ميليلتر من الحمض النووي، والمياه. وضع الأنابيب في ثيرموسيكلير وتشغيل دورات المناسبة كما هو موضح في الجدول 2.
    4. تشغيل المنتج بكر على 2% [اغروس] هلام والصورة باستخدام نظام توثيق هلام.

4-عزل الخلايا ج-كيت+ من نخاع العظام

  1. التضحية الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: هنا، تعرضت الفئران لثاني أكسيد الكربون (CO2) في وفقا وبرايتون أوصت معدل التدفق حتى تقرر الموت بوقف التنفس وضربات القلب، متبوعة بخلع عنق الرحم.
  2. حصاد الساقالعظام من الماوس — قصبة اثنين، وهما تيبياس، إيلياكس اثنين. نظيفة من جميع الأنسجة من العظام كشط بعيداً مع مشرط. وضع عظام الساق في برنامج تلفزيوني الباردة 1 x على الجليد – 5 مل في أنبوب 15 مل. صب محتويات الأنبوبة في قذيفة هاون وسحق مع مدقة.
  3. تصفية تعليق خلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل ملولبة مع ماصة 10 مل المرفقة، باستخدام ماصة. أغسل بقذائف الهاون والمدقة عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة x 1، جمع وإضافة تعليق خلية في أنبوب 50 مل. تدور أسفل نخاع العظام في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة طاف عبر فراغ مع ماصة زجاجية تعلق. تعليق بيليه الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني x 1 مع ماصة.
  4. مع ماصة، إضافة معلقة نخاع العظام ببطء إلى الأعلى من 5 مل من درجة حرارة الغرفة (ودرجة الحرارة الحرجة) بوليسوكروسي، أخذ عناية كبيرة ليس تعكير الواجهة. تدور في 400 x ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل.
  5. جمع واجهة الخلية مونو النووية مجموع غائم (تمنك) مع ماصة ووضعه في أنبوب 15 مل جديدة. جلب الحجم يصل إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني 1 x للغسيل، أخذ 20 ميليلتر للعد، وتدور في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 تجاهل المادة طافية وحفظ بيليه على الجليد للخطوة 4.6.1.
  6. أداء ج-كيت+ خلية العزلة.
    1. متابعة بروتوكول كيت ميكروبيد ج-كيت+ خلية العزلة. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميليلتر 80 1 x برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة إلى 107 الخلايا. لتعليق خلية، قم بإضافة 20 ميليلتر CD117 ميكروبيدس/107 مجموع الخلايا. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. جلب الحجم يصل إلى 10 مل بإضافة 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة وتدور في 1,200 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. إزالة المادة طافية عبر فراغ وتعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر/108 خلايا الكلية في برنامج تلفزيوني 1 x + يدتا + جيش صرب البوسنة. استخدام حامل المغناطيس مع العمود المغناطيسي المرفقة، أضف 3 مل 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة والسماح لها بالتدفق من خلال عن طريق الجاذبية إلى أنبوب جمع 15 مل.
    3. وبمجرد الانتهاء من إضافة المخزن المؤقت الأول يمر عبر العمود، إضافة تعليق خلية في العمود، السماح لها بالتدفق من خلال عبر الجاذبية في أنبوب جمع 15 مل. فلووثروغ هذا هو الكسر الخلية غير مرغوب فيها.
    4. تغسل من العمود 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x مل 3 + يدتا + جيش صرب البوسنة في كل مرة، مما يسمح لها بالتدفق من خلال عبر الجاذبية في أنبوب جمع. إزالة العمود من المغناطيس ووضعه على الجزء العلوي من أنبوب 15 مل.
    5. إضافة 5 مل 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة، وطرد فورا مع المكبس المقدمة مع العمود. إزالة المكبس وكرر دافق مع مل 5 إضافية من 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة. عد الخلايا في الحجم الإجمالي باستخدام الطرق القياسية.
    6. وتدور أسفل الخلايا في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة المادة طافية ريسوسبيند بيليه في إيمدم كاملة (إيمدم + 10% FBS + إيل-6 [10 نانوغرام/مل] + + سوف [50 نانوغرام/مل] + [20 نانوغرام/مل] [ليغند] FLT3 إيل-3 [10 نانوغرام/مل]) للثقافة. ثقافة هذه الخلايا المبيت في 2 × 106 خلايا/1 مل من الخلية إيمدم وسائل الإعلام كاملة بوضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.

5-توصيل

  1. تعداء بلازميد النسخ العكسي
    1. طازجة إذابة الخلايا HEK293 بعد ظهر اليوم قبل في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية. وتدور كريوتوبي تحتوي على خلايا HEK في 435 س ز في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 إزالة طاف عبر فراغ تعليق بيليه الخلية في 1 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS، البنسلين، ستربتوميسين، والجلوتامين.
    2. عد الخلايا، وإضافة وحدة التخزين المناسبة لطبق 10 سم تعامل (~ 4 × 106 HEK293T الخلايا). إضافة 14 مل 10 دميم وسائل الإعلام إلى الطبق ومزجها جيدا قبل الانزلاق صعودا وهبوطاً للمساواة في توزيع. ضع الطبق في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة بين عشية وضحاها.
    3. في صباح اليوم التالي، تحقق التقاء الخلايا تحت مجهر خفيفة مقلوب (50% أو أكثر يعمل بشكل جيد).
    4. تجمع الحمض النووي (بلازميد النسخ العكسي المطلوب)، بكليكو (تغليف بلازميد)، كاكل 2 م2وح20 في أنبوب 1.5 مل (= 500 ميليلتر) باستخدام ميكروبيبيتي بالمبالغ التالية: 7.5 ميكروغرام للحمض النووي (المركز-ABL1-يفب)، 7.5 ميكروغرام من بكليكو، ميليلتر 62 م 2 كاكل2 ، والماء لوحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر. إضافة 500 ميليلتر من x HBS 2 إلى آخر 1.5 مل الأنبوبة.
    5. إضافة الحمض النووي مزيج dropwise إلى 1.5 مل الأنبوب الذي يحتوي على 500 ميليلتر من x HBS 2 (مم 280 كلوريد الصوديوم و 100 مم هيبيس و 1.5 مم نا2هبو4) بينما خلط. تحقيق ذلك عن طريق إعداد دوامة إلى أقل سرعة وأنبوب ميزانيات على أنه عقد لخلط مستمر أثناء إضافة مزيج تعداء.
    6. السماح لهذا المزيج تعداء لاحتضان لمدة 20 – 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الاحتضان، إضافة 25 نانومتر الكلوروكين للخلايا HEK ووضعها مرة أخرى في الحاضنة. بعد الاحتضان، إضافة مزيج تعداء الخلايا HEK دروبويسي، وثم بلطف دوامة وسائل الإعلام لخلط المزيج تعداء في جميع أنحاء اللوحة.
    7. احتضان الخلايا مع هذا المزيج ح ~ 8 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة. تغيير وسائط الإعلام بشأن هذه الخلايا بإضافة ببطء شديد مل 14 الطازجة 10 دميم وسائط. بيبيتينج ببطء ضد الجدار للطبق يساعد على منع أي تجريد الخلايا HEK. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
    8. جمع المادة طافية الفيروسية مع حقنه 10 مل ورسم المادة طافية في المحاقن، وإرفاق عامل التصفية حقنه 0.45 ميكرومتر. يغرق المادة طافية الفيروسية في أنبوب مجموعة جديدة. أن أول مجموعة من ح ~ 16 طاف الفيروسية في وقت لاحق.
  2. تركيز فيبرونيكتين الفيروسية وتوصيل
    1. إضافة 2 مل جزء فيبرونيكتين البشري الماشوب 0.1 مغ في برنامج تلفزيوني 1 x إلى ألواح غير المعالجة 6-بئر الثقافة. إعداد قدر فيبرونيكتين حسب الحاجة، والذي يعتمد على العدد من الخلايا والأنماط الجينية. واحد جيد يمكن بما فيه الكفاية ترانسدوسي 10 مليون ج-كيت+ الخلايا. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. في اليوم التالي، إزالة فيبرونيكتين من الآبار مع ماصة, ماصة 2 مل من جيش صرب البوسنة 2% العقيمة في برنامج تلفزيوني 1 x كتلة اللوحة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة جيش صرب البوسنة عبر فراغ وتغسل جيدا قبل بيبيتينج 2 مل من 1 x برنامج تلفزيوني ثم إزالته عن طريق فراغ.
    3. فور إضافة الطازجة التي تم جمعها وتصفيتها (في 0.45 ميكرومتر) الفيروسية طافية ما يصل إلى 5 مل. الطرد المركزي في 435 س ز على 32 درجة مئوية على حاء 2 إزالة طاف عبر فراغ، وكرر هذه الخطوة مع إضافية من المادة طافية الفيروسية جمعها طازجة وتدور مرة أخرى. إزالة طافية عبر فراغ وغسل الآبار بإضافة 2 مل من 1 x PBS؛ ثم إزالته عن طريق فراغ.
    4. إضافة خلايا الماوس ج-كيت+ أن مثقف بين عشية وضحاها (الخطوة 4.6.6) إلى الآبار المغلفة الفيروسية خلط تعليق الخلية جيدا وبيبيتينج لهم في لوحة الفيروسية فيبرونيكتين تتركز الآن. تدور في 1,200 س ز عند 25 درجة مئوية عن 90 دقيقة وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
    5. بوستترانسدوكشن ح 48، بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 1,200 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت #1 (برنامج تلفزيوني x 1 + 0.5% جيش صرب البوسنة) إلى 6 × 106/mL. تحديد النسبة المئوية للخلايا إيجابية المركز-ABL1 بقياس النسبة المئوية يفب إيجابية باستخدام التدفق الخلوي.
    6. الحصول على الأحداث مع الإجراء القياسي. أولاً، بوابة الخلايا الحية استناداً إلى مبعثر أمامية وجانبية. ثم، بوابة الخلايا الحية الإيجابية يفب باستثناء يفب-نيجاتيفيسيلس تحددها السيطرة السلبية (الشكل 4).

6-تشكيل مستعمرة أونيتاسايس

  1. ذوبان الجليد methylcellulose مع السيتوكينات للماوس في درجة حرارة الغرفة لمل حاء – 1 – 2 3 الكوة من ميثيلسيلولوسي في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام حقنه 5 مل دون إبرة. فرز الخلايا يفب إيجابية على أرز خلية.
  2. وتدور الخلايا أسفل تعليق بيليه في وسائل الإعلام كاملة إيمدم. عد الخلايا يكون مطلي وتمييع لهم الحصول على الخلايا إيجابية يفب 5,000 في 100 ميليلتر من إيمدم كاملة وسائط الإعلام.
  3. إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية تحتوي على 5,000 يفب-إيجابية الخلايا ومثبطات مناسبة لمل 3 من ميثيلسيلولوسي (انظر الجدول للمواد). دوامة على ارتفاع مزجها على 10-30 ثانية.
  4. بعد أكثر من الهواء وقد هرب فقاعات، استخدم حقنه 1 مل للوحة 1 مل من وسائل الإعلام في ثلاث نسخ متماثل سم 3 لوحات بإخراج الوسائط على جانب واحد، وآماله ببطء اللوحة في حركة دائرية ينتشر بالتساوي.
  5. يتم التركيز النهائي لمثبطات لاستخدام imatinib في 3 ميكرومتر، مركز دبي للزهور في 0.2 ميكرون، وبي سي أي في 0.5 ميكرومتر، وحدها أو في مجموعات. حيثما كان ذلك مناسباً، حذف ج-المنحدر بطلاء الخلايا مع 4-هيدروكسيتاموكسيفين (1 ميكروغرام/مل) إضافة إلى ميثيلسيلولوسي.
  6. بعد الطلاء، وضع اللوحات في طبق بتري كبيرة مع صحن مفتوح واحد يحتوي على 2 مل الماء المعقم في الوسط. تغطية صحن بتري كبيرة واحتضانها بعناية عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة. سجل الأرقام مستعمرة بعد أسبوع واحد من الطلاء بحساب العدد الإجمالي للمستعمرات تحت مجهر.
  7. تحليل المستعمرات عدد قليل من اللوحات المناسبة للحذف ج-المنحدر من بكر. جمع المستعمرات بمص لهم مع تلميح P1000. إزاحة الخلايا الموجودة في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x بغسل هذه المعلومة في برنامج تلفزيوني عدة مرات. تدور تعليق خلية في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة واستخراج الحمض النووي من خلية بيليه استخدام عدة عزل دنا جينومي.
  8. استخدام الحمض النووي الجينومي للاسترداد باستخدام كبسولة تفجير مفوس-FP3 ومفوس-RP5، كما هو موضح في الجدول 2. تحليل منتجات PCR على 2% [اغروس] هلام والصورة باستخدام نظام توثيق هلام.
  9. لعرض الرسوم بيانية للمستعمرات، وصمة عار المستعمرات، باستخدام كلوريد إيودونيتروتيترازوليوم. حل 10 ملغ كلوريد إيودونيتروتيترازوليوم في 10 مل الماء للحصول على حل 1 ملغ/مل. فلتر تعقيم الحل باستخدام قفل اللوير مع مرشح 0.2 ميكرومتر تعلق بحقنه 10 مل تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.
  10. في هود زراعة الأنسجة، إضافة 100 ميليلتر من حل المصبوغة dropwise حول لوحة زيمبابوي؛ احرص على عدم الانزلاق أو تخل بالمستعمرات. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة. سوف تتحول المستعمرات المحمر الظلام براون. استخدام خلفية بيضاء في هود زراعة الأنسجة المعقمة، التقاط صور للوحة زيمبابوي الملون.

7-زرع وفحص معدل الوفيات

  1. دكت تشعيع الفئران مع تقسيم الإشعاع استخدام 137 المستندة إلى Cs أشعة غاما في جرعة من 7.0 غراي تليها 4.75 غراي (0.5 غراي/دقيقة)، ح 3 عن بعضها قبل عملية الزرع.
  2. زرع 4 × 104 التي لم يتم فرزها يفب الإيجابية (يحسب استناداً إلى النسبة المئوية يفب) الخلايا التي تحتوي على 3 × 105 خلايا نخاع العظم الطبيعي كناقل في كل الماوس عن طريق الذيل الوريد الحقن.
  3. بعد أسبوع واحد من الزرع، تحديد انجرافتمينت عن طريق تحليل الخلايا يفب إيجابية من الدم الطرفية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  4. إجراء ذيل الوريد التسييل ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل.
    1. الحارة من قفص الفئران تحت مصباح حرارة مع الحذر ليس إفراط أو نسخها.
    2. كبح جماح ماوس في ريسترينير ماوس ونك على المنوال ذيل بشفرة معقمة. الحليب بلطف الذيل من عرفت الخلفي، يسمح قطره دم تتراكم. جمع الدم بأنبوب شعري هيبارينيزيد حتى أنه مليء (جمع حوالي 75-100 ميليلتر). يغرق الدم من أنبوبة شعرية شغلها في أنبوب جمع دم الذي يحتوي على يدتا ومزيج جيد.
    3. كرات الدم الحمراء بإضافة 30 – 40 ميليلتر من الدم لمل 3 1 x ربك تحلل من المخزن المؤقت (150 مم كلوريد الأمونيوم وبيكربونات البوتاسيوم 10 ملم 0.13 مم يدتا). المزيج جيدا، عكس الأنبوبة عدة مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة عن 10 – 15 دقيقة تدور في س 1,200 ز عند 4 درجة مئوية أدنى 5 إزالة طاف عبر فراغ وتعليق بيليه في 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 ليغسل.
    4. تدور في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليقه في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية #1. القيام بتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.2.5–5.2.66. أنبوب قصيرة الأجل مخزن الدم المتبقية في المجموعة، التي يمكن استخدامها لأغراض أخرى مختلفة، في 4 درجات مئوية.
  5. واستخدمت زرع الفئران التي أظهرت 10 – 40% يفب-إيجابية الخلايا في الدم المحيطي للتجربة. الفئران التي كانت أقل من 2 ٪ خلايا إيجابية يفب استبعدت من الدراسة.
  6. يعد تاموكسيفين في 20 ملغ/مل في زيت الذرة عند 60 درجة مئوية مع فورتيكسينج متقطعة حتى يذوب تماما، وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة العلاج. بعد أسبوع واحد من الزرع، حذف اليل ج-المنحدرfl/فلوريدا بالحقن تاموكسيفين (100 مغ/كغ في زيت الذرة) إينترابيريتونيلي (القائمة) في الفئران، كل يوم لمدة ثلاثة أيام متتالية. فمن المهم أن يتم وزنه بالفئران لتحديد مقدار تاموكسيفين لحقن. بعد علاج تاموكسيفين (عند الاقتضاء)، مجموعة الفئران للعلاج بالعقاقير (n = 5/المجموعة).
  7. مراقبة الفئران لبقاء وتطور سرطان الدم وتحديد أعلى عبء ليوكيميك (يفب-إيجابية الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية) الأسبوعية إلى ثمانية أسابيع في الباقين على قيد الحياة الفئران.
  8. تحليل الدم للحذف ج-المنحدر حيثما كان ذلك مناسباً، كما هو موضح أعلاه في القسم 6. سجل العدد الفئران الباقين على قيد الحياة كل يوم وارسم منحنى البقاء على قيد الحياة في نهاية التجربة استخدام برامج الرسوم البيانية.

8. نموذج الفئران المعدلة وراثيا من اللوكيميا المركز-ABL1

  1. عزل LSK
    1. الحفاظ على الفئران المحورة وراثيا Scl-نقل واكتساب التكنولوجيا على تشو الدوكسيسيكلين لمنع تعبير عن المركز-ABL1. تأخذ أربعة أسابيع قبل عملية الزرع، الفئران قبالة الدوكسي تشو للتعبير المركز-ABL1.
    2. عزل تمنكس من الفئران المحورة وراثيا Scl-نقل واكتساب التكنولوجيا كما هو موضح أعلاه في القسم 4. تعليق تمنكس في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية #2 (برنامج تلفزيوني x 1 + 0.5% جيش صرب البوسنة + 2 مم يدتا) للحصول على 106 خلايا/مل.
    3. تستنفد تمنكس للنسب-إيجابية الخلايا بإضافة 10 ميليلتر من الكشف عن خلية النسب البيوتين كوكتيل (مترافق البيوتين مونوكلونل ضد CD5 [الفئران IgG2a]، CD11b [الفئران IgG2a]، CD45R [B220] [الفئران IgG2a]، مكافحة--7-4 [الجرذ IgG2a], مكافحة-غرام-1 [لي-6G/C, فأر IgG2a]، ومكافحة-ثالثا-119 [الجرذ IgG2b]) الواحدة 1 × 106 خلايا. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية عن 10 دقيقة في الظلام، تليها يغسل مع 5 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة #2، وتدور في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 Aspirate المادة طافية تماما ووقف الخلايا في 400 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة #2.
    4. إضافة 5 ميليلتر من المتقارن البيوتين المضادة الأجسام المضادة-فيتك وميليلتر 1.2 من PECy7 Ly-6A/E (Sca1) ميليلتر 2.4 CD117 الأجسام APC (ج-Kit) لتصل إلى 108 ملايين الخلايا. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة يغسل بالحجم يصل إلى 5 مل مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية #2؛ ثم الطرد المركزي في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة #2.
    5. تصفية تعليق خلية في أنبوب أزرق الحد الأقصى لتصفية نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    6. بوابة الخلايا الحية باستخدام مبعثر الأمامية والجانبية. ثم حدد الخلايا لين– التي أظهرت مؤسسة مونتانيار (يعني fluorescence كثافة أقل من 102) للحصول على LSK الخلايا ج-كيت+ و Sca1+ في بيكسبونينتيال الأرض من الأصل لين– ، وفرزها (الشكل 7 ج).
    7. جمع الخلايا تم فرزها والطرد المركزي لهم في س 1,200 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. زرع الأعضاء
    1. دكت تشعيع الفئران بيج مع جرعة إشعاع انقسام غراي 7.0 تليها غراي 4.75 بعد ح 3، قبل عملية الزرع.
    2. حقن 3 × 103 إلى 5 × 103 المركز-ABL1-LSK الخلايا مع 0.3 × 106 مساعد خلايا نخاع العظام من الفئران بيج WT عبر الذيل الوريد (رابعا) في الفئران المشععة بيج.
    3. بوستترانسبلانتيشن أربعة أسابيع، تحليل الفئران المستفيدة ل CD45.1 و CD45.2. الحصول على تمنك من الدم المحيطي بذيل نزيف الوريد كما هو موضح في الخطوة 7، 4. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان الخلايا مع ميليلتر 1 كل من جسم فيتك CD45.1 و CD45.2-PE في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    4. غسل الخلايا بتنشئة الحجم إلى 3 مل مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتدور في 1,200 س ز عند 4 درجة مئوية لإزالة المادة طافية 5 كحد أدنى وريسوسبيند أنه في 200 ميليلتر من 1 x PBS.
    5. تحليل نسبة CD45.1 و CD45.2 بأول النابضة الخلايا الحية استناداً إلى مبعثر إلى الأمام والجانب، تليها النابضة الخلايا فيتك و PE إيجابية استناداً إلى عينة أونستينيد.
    6. مجموعة الفئران إلى أربع مجموعات (n = 6 كل مجموعة). تبدأ العلاج imatinib (75 ملغ/كغ 2 × يوميا) وحدها وفي تركيبة مع DFC + بي سي أي (كلا المخدرات أعطيت بجرعة 10 مغ/كغ 2 × يوميا).
    7. وبالمثل، التعامل مع المجموعات الأخرى مع مجموعات من imatinib (75 ملغ/كغ) + الكركمين (150 مغ/كغ) + بي سي أي (10 مغ/كغ) و imatinib (75 ملغ/كغ) + ندجا (100 مغ/كغ) + بي سي أي (10 مغ/كغ) لمدة ثلاثة أشهر، 2 × يوميا، حقن القائمة
    8. تحليل الفئران 1 x شهر لمدة ستة أشهر تشيميريسم ليوكيميك بتحديد النسبة مئوية CD45.2 إيجابية الخلايا في الدم المحيطي بذيل الوريد ينزف كما هو موضح في الخطوة 7، 4.

9-وفي تقييم فيفو BCI والنشاط DFC

  1. تحليل والرمات-p38
    1. أن الفئران ليوكيميك الثلاثة (8 – 12 أسبوعا القديمة) التي تم زرعها مع الإعراب عن المركز-ABL1 ج-كيت+ الخلايا، كما هو موضح في القسم 7. حقن الفئران مع بي سي أي (10 مغ/كغ) عن طريق حقن بوستترانسبلانت الأسابيع الأربعة القائمة.
    2. قياس مستويات الدم المحيطي والرمات-p38 تمنك استخدام طقم الفسفرة التدفق الخلوي وفقا لتعليمات المورد. جمع الدم من كل الماوس قبل و 6 ح بعد حقن المخدرات. عزل في تمنكس قبل استنفاد ربك وإصلاحها على النحو التالي.
    3. إضافة 4 مل من ربك تحلل الحل الواحد 100 ميليلتر من الدم المحيطي. خلط واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق كرات الدم الحمراء. تدور أسفل الخلايا في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية. كرر تحلل 1 x أكثر.
    4. بعد الخطوة الثانية تحلل، تغسل الكريات الخلية مع 1 مل من جيش صرب البوسنة 2% في برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميليلتر من التثبيت و permeabilization الحلول واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام. بيليه الخلية باستخدام الطرد المركزي في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. تغسل الكريات مع 1 مل 1 × بيرميبيليزيشن المياه والصرف الصحي. كتلة الخلايا بإضافة 300 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 2% في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي بيرميبيليزيشن في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 20 تقسيم الخلايا إلى مختبرين تساوي ثلاثة من كل 100 ميليلتر (~ 1 x106).
    6. كل قاسمة للخلايا الثابتة إضافة 1 ميليلتر من جسم p-38 مجموع أو 1 ميليلتر من جسم p38 والرمات 1 ميليلتر من ايستب مراقبة مفتش، على التوالي، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    7. تغسل الخلايا 1 x مع 5 مل من جيش صرب البوسنة 2% في برنامج تلفزيوني واحتضان مع جسم الثانوي (1 ميليلتر من فلور أليكسا-488 مترافق) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. وقف لهم في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x وتغسل الخلايا 1 x مرة أخرى.
    8. الحصول على البيانات من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليلها قبل التدفق الخلوي تحليل البرامج.
    9. خصم مؤسسة مونتانيار لمراقبة مفتش من مؤسسة مونتانيار للعينات التجريبية. ثم يتم تطبيع قيم مؤسسة مونتانيار والرمات-p38 إلى أنه من مجموع p-38 لتحديد مستويات والرمات-p38 بعد حقن BCI.
  2. تحليل التعبير الجيني الكمي الجينات المستهدفة ج-المنحدر
    1. أن الفئران ليوكيميك الثلاثة (8 – 12 أسبوعا القديمة)، التي تم زرعها مع الإعراب عن ABL1 بنك الخلايا ج-كيت+ كما هو موضح في القسم 7. جمع الدم المحيطي من كل الماوس وثم حقن الفئران مع 10 مغ/كغ كل DFC + بي سي أي.
    2. جمع الدم المحيطي ح 6 بعد تعاطي المخدرات بالحقن. عزل تمنكس عن طريق استنفاد ربك، كما هو موضح أعلاه. بيليه تمنكس، وتعليق عليها في المخزن مؤقت تحلل تستند الفينول (انظر الجدول للمواد).
    3. القيام بتحليل RT-قبكر (كما هو موضح في القسم 1) Bcl2l11، ليف، وايل-6 استخدام الإشعال الخاصة بالجينات (كما هو مبين في الجدول 1).

10-طويل الأجل بالانزيم الخلية الشروع في الثقافة

ملاحظة: وأجرى مقايسة لتسيك كما هو موضح سابقا25.

  1. تنمو ماوس تنتجها الخلايا الليفية خلية خط MS-5 في MEMα إلى كونفلوينسي في قارورة زراعة الأنسجة T175. تريبسينيزي الخلايا كما هو موضح أعلاه ل HEK293T. تعليق الخلايا الموجودة في MEMα في 2 × 106 خلايا/مل. تأخذ 10 × 106 خلايا في أنبوب 50 مل مخروطية ويتهددها في 80 غراي. تمييع الخلايا إلى 0.5 × 106 خلايا/مل في MEMα وتستكمل مع 10% FBS (M10) وسائل الإعلام. لوحة 2 مل كل بئر في لوحة 12-جيدا واحتضان أنه في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة بين عشية وضحاها.
  2. في اليوم التالي، إعداد هيميسوكسيناتي الصوديوم الهيدروكورتيزون بتذويب 2.5 ملغ في 5 مل MEMα (حل م 1). عامل التصفية-تعقيم الهيدروكورتيزون الحل باستخدام عامل تصفية حقنه ميكرومتر 0.2 في غطاء السلامة الأحيائية. تمييع الهيدروكورتيزون واسطة تمييع المسلسل في الذاكرة للحصول على حل 100 ميكرومتر. إضافة 250 ميليلتر من هذا إلى 25 مل متوسطة الثقافة البشرية الطويلة الأجل (هلتم) (انظر الجدول للمواد) فقط قبل الاستخدام، لتحقيق تركيز نهائي من 1 ميكرومتر.
  3. تدور أسفل التضليل-CD34+ وتمنكس UCP3 وتعليق لهم في هلتم واسطة فورتيكسينج قصيرة، وتحديد التهم التي هيموسيتوميتير.
  4. فراغ إيقاف الوسائط M10 من لوحة 12-جيدا المصنف مع خلايا ستروما واستبدله مع 1 مل خلايا المريض (UCP3 تمنكس والتضليل-CD34+ [10,000] [1 × 106]) تعليق في هلتم. استخدم ثلاثة آبار كل تركيبة المخدرات حسب نوع الخلية.
  5. تمييع مخزونات الأدوية إلى x 2 للتركيز المطلوب في هلتم. أضف 1 مل من وسائل الإعلام مع المخدرات في الخلايا المشار إليها أعلاه للحصول على تركيز المخدرات 1 x. استبدال نصف عدد من وسائل الإعلام مع هلتم الطازجة كل أسبوع لمدة خمسة أسابيع.
  6. في نهاية فترة الفحص LTC-IC ستة أسابيع، جمع الخلايا نوناديرينت في أنبوب من الثقافات. تريبسينيزي الخلايا ملتصقة والجمع بينها وبين الخلايا نوناديرينت المقابلة.
  7. غسل الخلايا ومقايسة كفوس في methylcellulose المتوسطة تحتوي على 30% العجل الجنين المصل، الاريثروبويتين (3 وحدات/mL)، سادس (50 نانوغرام/مل)، وايل-3(20 ng/mL)، إيل-6 (20 نانوغرام/ملليلتر)، ز-CSF (20 نانوغرام/مليلتر)، وعامل تحفيز مستعمرة المحببات/بلعم (GM-CSF) (20 نانوغرام/ مل)-تحديد التهم التي هيموسيتوميتير.
  8. لوحة 5 × 104 خلايا في replicates الثلاثة. تجميد أسفل الخلايا المتبقية في 20% FBS و 10% [دمس]. ترتيب اللوحات في طبق بتري كبيرة مع صحن مفتوح واحد يحتوي على الماء في الوسط. تغطية صحن بيتري الكبيرة بعناية واحتضان أنه في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة لمدة أسبوعين.
  9. نقاط المستعمرات بعد ذلك بأسبوعين. وفي بعض الحالات، سوى جزء من الحصاد هو جزيئي كفوس). حساب إجمالي عدد لتسيك موجودة في تعليق خلية أولية باستقراء استناداً إلى كفوس التي تم الحصول عليها من جزء من محصول الخلية. إخراج زيمبابوي متوسط كل LTC IC هو 8.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا في البداية 1 × 106 مطلي في بئر، بعد خمسة أسابيع، كانت تحصد 0.5 × 106 خلايا، لزيمبابوى، كانت مطلي 5 × 104 خلايا وتم الحصول على 50 كفوس. وهذا يساوي كفوس/1 500 مليون خلايا مطلي. قسمة هذا الرقم 8 للحصول على لتسيك، وهو 62.5.

11-أنسنة طراز الماوس باستخدام التضليل CD34 الخلايا+

  1. سوبليثالي تشعيع الأسبوع عمره 8 مشمولان إيماءة غاما الفئران، معربا عن IL3 البشرية، GM-CSF، و "صندوق إنقاذ الطفولة" (نسجس)، مع جرعة واحدة من 7.0 غراي (700 راد) مع راد 50/دقيقة.
  2. حقن 3 × 106 CD34+ تحديد خلايا من مرضى المرحلة المزمنة CML المركز--ABL1--الإيجابية في الفئران المشععة بالحقن الوريدي.
  3. وبعد أسبوعين زرع، تحديد انجرافتمينت ليوكيميك في نخاع العظام بنظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالماوس والإنسان ضد CD45.
  4. إجراء تحليل لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
    1. تأخذ أسبيراتي نخاع العظام من قصبة الفئران زرع. كرات الدم الحمراء باستخدام المخزن المؤقت لتحلل ربك كما هو موضح أعلاه وجمع تمنكس واسطة الطرد المركزي. أغسل بيليه 1 x مع x 1 الباردة برنامج تلفزيوني.
    2. كتلة الخلايا البشرية FcR كتلة وكتلة FcR الماوس متبوعاً تلطيخ مع الإنسان المضادة CD45 فيتك والماوس المضادة الجيش الشعبي الكونغولي CD45Cy7 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. القيام بتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية على لسريي وتحليل البيانات باستخدام برمجيات تحليل التدفق الخلوي.
  5. مجموعة الفئران إلى أربع مجموعات مختلفة (n = 6/المجموعة) لمعالجة بالسيارة، imatinib (75 ملغ/كغ)، DFC + BCI (سواء في 10 مغ/كغ)، أو imatinib (75 ملغ/كغ) + DFC BCI (سواء في 10 مغ/كغ). تخفف الأدوية الأسهم في برنامج تلفزيوني 1 x (المركبات) وإدارتها عن طريق حقن هذه القائمة 2 × يوميا.
  6. علاج الفئران لمدة ستة أسابيع وتحديد عبء ليوكيميك كل أسبوعين، حتى الأسبوع ثمانية بعد زرع الأعضاء كما هو موضح أعلاه في 11.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إدمان السرطاني قد تورطت في الفعالية العلاجية تكيس. ومع ذلك، ليست مفهومة آليات القيادة الاعتماد السرطاني. ونحن أداء متعددة تحليلات التعبير الجيني غير متحيزة لتحديد المكون الوراثي المتورطين في تدبير الإدمان. وكشفت هذه التحاليل upregulation من ثلاثة جينات، ج-المنحدر و Dusp1 و Zfp36، في الخلايا السرطانية التي لا تعتمد على إشارات النمطان للبقاء على قيد الحياة، وهكذا، لا تراعي TKI العلاج. دوونريجوليشن ج-المنحدر و Dusp1 بضربه قاضية بوساطة شرنا كافية لاستعادة حساسية المخدرات في خلاف ذلك TKI مقاومة الخلايا.

للتحقق من صحة دور ج-المنحدر و Dusp1 كهدف العلاجية في اللوكيميا، تأكدت بهم overexpression أولاً استخدام الخلايا BaF3 الإعراب عن السرطاني المركز-ABL1. ويلغي عامل النمو الإشارات في الخلايا BaF3 با السرطاني الاعتماد؛ نتيجة لذلك، لا تستجيب للعلاج TKI. وأكد تحليل التعبير الكمي RT-قبكر والنشاف الغربية أن ج-المنحدر و Dusp1 هي الناجمة عن المركز-ABL1 والتعبير عنها هو زيادة إضافية على عامل النمو إيل-3 (الشكل 1A - ج 1).

لدراسة دور ج-المنحدر و Dusp1 الحية، الفئران التي تفتقر إلى ج-المنحدر (الماوس الشرطي نموذج ج-المنحدرfl/fl مع Rosa26-CreERT2) أو Dusp1 (مستقيم Dusp1 كو--/--) والفئران التي تفتقر إلى ج-المنحدر و Dusp1 (Rosa26-CreERt2-المنحدرfl/fl/Dusp1-/- ) وقد وضعت. هذه الفئران جينوتيبيد بالاسترداد باستخدام الحمض النووي من الذيل، وبكر بسهولة تمييز ج-المنحدرfl/fl، Dusp1 كو من الفئران WT (الشكل 2أ). وأكد الحذف المتعمد للمنحدر ج تاموكسيفين العلاج بكر، بظهور عصابة مقارنة لا الفرقة في الفئران التي لا تعامل مع تاموكسيفين (الشكل 2ب).

لاختبار دور ج-المنحدر و Dusp1، الخلايا المشتقة من نخاع العظم ج-كيت+ من الوزن، Dusp1-/-، ج-المنحدرfl/fl، و Dusp1--/--/c-Fosfl/فلوريدا كانت معزولة وترانسدوسيد مع مسكف-المركز-ABL1-إيريس-يفب الجزيئي؛ ويرد في الشكل 3تخطيطي للإجراء. الإعراب عن يفب+ (تستخدم كعلامة بديلة للتعبير ABL1 بنك) تم فرز حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية (الشكل 4) كذلك في المختبر (زيمبابوي) والاختبارات المجراة. وتبين النتائج أن حذف ج-المنحدر و Dusp1 وحدها تحول دون أرقام زيمبابوي (< 50%). من المثير للاهتمام، الشبهة الخلايا التي تفتقر إلى ج-المنحدر و Dusp1 إلى حد كبير في قدرتها تشكيل مستعمرة، والعلاج imatinib محا جميع كفوس، مما يوحي بأن فقدان ج-المنحدر و Dusp1 الفتاكة صناعيا للتعبير المركز--ABL1 (الرقم 5 ).

فحوصات زيمبابوي في المختبر تمكن الباحثين من اختبار النمط الظاهري كو ونشاط مثبطات جزيء صغير بسرعة. ومع ذلك، كذلك المجراة في التحليل سوف تأكيد صحة الأهداف. المجراة في التحقق من الصحة، ونحن أولاً تستخدم نموذج زرع توصيل سريعة1 حيث المركز-ABL1 أسباب وفيات خلال أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. خمسين ألف يفب-إيجابية الخلايا، جنبا إلى جنب مع 300,000 – 500,000 المشتقة من نخاع العظم خلايا وحيدات النوى من الماوس العادي، تم حقن الفئران المشععة قاتلة للحث على CML. تم حقن الفئران تحمل الخلايا ج-المنحدرfl/fl أو الخلايا-/- ج-المنحدرfl/flDusp1 مع تاموكسيفين بعد 10 أيام زرع لحذف ج-المنحدر. الفئران التي تلقت الخلايا WT أو Dusp1-/- اللوكيميا واستسلمت للموت خلال أسبوعين إلى أربعة أسابيع، مع حذف ج-المنحدر وحدها أظهرت تأخير كبير في تطوير المرض، والعلاج TKI حفظ ما يقرب من 50 في المائة الفئران من الموت. من المثير للاهتمام، الفئران زرع الخلايا التي تفتقر إلى ج-المنحدر و Dusp1 على قيد الحياة أطول، ومعاملة TKI يشفي جميع الفئران من التضليل (الشكل 6A - ج 6). الفئران التي نجت تدريجيا فقدت الخلايا يفب+ ، كما هو مبين في ج-المنحدر وكو مزدوجة عندما تعامل مع imatinib (الشكل 6-6F)، مما يوحي بإزالة الألغام من بنك ABL1 الخلايا إيجابية.

ونظرا لأن التضليل مرض خلايا الجذعية، ونظرا لعدم قدرة الجزيئي لاستهداف الخلايا المكونة للدم البدائية وهادئة، من المحتم لاختبار ما إذا كان استهداف ج-المنحدر و Dusp1 سيكون كافياً للقضاء على الخلايا الجذعية ليوكيميك. التتراسيكلين إيندوسيبلي ABL1 بنك الفئران المعدلة وراثيا حيث يعبر عن نقل واكتساب التكنولوجيا محسن Scl، التي يعبر عنها على وجه التحديد في الخلايا الجذعية المكونة للدم، وقد استخدمت سابقا دراسة دور الجينات المستهدفة في لسكس. واستخدمت التتراسيكلين إيندوسيبلي ABL1 بنك الفئران المحورة وراثيا (الشكل 7 ألف-7B) للتحقيق في دور ج-المنحدر و Dusp1 في لسكس. تم فرز الخلايا LSK من هذه الفئران باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية وحقن الفئران المستفيدة (الشكل 7ج). بعد شهر واحد من الزرع، وكان سجل انجرافتمينت ليوكيميك، متبوعاً بالعلاج من تعاطي المخدرات. وتحددت بعبء ليوكيميك ومستويات LSK كل شهر لمدة ستة أشهر. تعامل مع imatinib وحدها أظهرت قمع اللوكيميا الفئران لكن تركت مع. ولذلك، وقف العلاج، كما لوحظ في العيادة، أدى إلى انتكاس المرض. في المقابل، الفئران تعامل مع مزيج من imatinib المخدرات + DFC (ج-المنحدر المانع) + بي سي أي (مثبطات Dusp1) القضاء تماما على الخلايا ليوكيميك، والفئران وقد شُفي من التضليل (الشكل 7 و 7E).

إنشاء القراءة الديناميكية دراسة معمقة من العقاقير ج-المنحدر ومثبطات Dusp1 ودراسة أثرها على الهدف، مستويات والرمات-p38 (علامة بديل لتثبيط Dusp1) وقيست والتعبير عن الجينات ج-المنحدر-ينظم، مثل إيل-6، bcl2l11، وليف، وكان كمياً. وأنشأت نحن وآخرون أن يؤدي إلى تثبيط Dusp1 تنشيط p38 (تقاس الفسفرة زيادة من p38)13. تم قياس مستويات فوسبو-p38 بنظام مراقبة الأصول الميدانية في خلايا الدم كله المعزولة من الفئران المعالجة بالعقاقير. كما هو متوقع، زيادة مستويات والرمات-p38 (الشكل 8أ) والتعبير عن الجينات ج-المنحدر-ينظم (إيل-6، bcl2l11، وليف) دوونريجولاتيد في الفئران المعالجة بالعقاقير (الشكل 8ب). هذه النتائج تشير إلى أن الموانع تحول دون هدفهم وبقاء الفئران بسبب تثبيط ج-المنحدر و Dusp1.

لأهمية الإنسان، تم اختبار كفاءة ج-المنحدر، ومثبطات Dusp1 باستخدام عينات المرضى في المختبر (LTC-IC) والاختبارات المجراة في (تكثيفها الماوس). المعاملة مع DFC + BCI ليست فعالة على الخلايا الجذعية ليوكيميك. ومع ذلك، استئصال مزيجاً من DFC BCI + imatinib بشكل انتقائي الخلايا الجذعية ليوكيميك في كلا فحوصات بينما تدخر الخلايا الجذعية العادي (الشكل 9-ألف - 9 ج). تثبت هذه النتائج أن ج-المنحدر و Dusp1 ضرورية للتحول ليوكيميك، وتعبير مرتفعة من هذه الجينات ويلغي الاعتماد السرطاني مما أدى إلى انتكاس المرض ومقاومة الأدوية. ولذلك، استهداف اندماجي ج-المنحدر و Dusp1 جنبا إلى جنب مع السرطاني السائق سوف تكون أكثر فعالية، وربما، استراتيجية علاجية لكثير من أنواع السرطان. ونحن نتوقع أن الأساليب الموصوفة هنا عموما يمكن أن تطبق لتحديد الهدف الإضافي والتحقق من الصحة.

Figure 1
الشكل 1 : هي overexpressed ج-المنحدر و Dusp1 استجابة لعامل النمو إيل-3- تحليل قبكر أوفيريكسبريشن (A) ج-المنحدر و Dusp1 (ب) في تعامل سيتوكين با BaF3 الخلايا. تم تحديد التعبير النسبي بعد تطبيع إلى β أكتين. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من ثلاث عينات نسخ متماثل. (ج) تحليل لطخة غربية للخلايا BaF3 با تعامل مع إيل-3 وبحث مع مجموع ج-المنحدر أو جسم فج-المنحدر و Dusp1. كجسم أكتين المضادة تحميل عنصر التحكم. تم تكييف هذا الرقم مع إذن من كيسارواني et al.13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الوراثي للفئران ج-المنحدرfl/flDusp1 وروزا cre-ER- (أ) بكر تحليل الحمض النووي الذيل. المتوقع أن العصابات من وزن أو من ج-المنحدرfl/فلوريدا-حمل التحوير كرير والفئران Dusp1 كو. يتم الإشارة إلى أحجام الفرقة التي على اليسار. (ب) بكر تحليل الفرقة أصغر بعد حذف ج-المنحدر مع العلاج التاموكسيفين. M = 1 كيلو بايت + سلم الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التخطيطي نموذج نقل وزرع الأعضاء- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : نظام مراقبة الأصول الميدانية تبين تواتر يفب+ الخلايا من الدم زرع وماوس WT (مراقبة سلبية). وتظهر اللوحات أعلى مؤامرة مبعثر من الخلايا والنابضة. تظهر لوحات أقل رسوم بيانية يفب مقابل مبعثر الجانب. الخلايا التي تحتوي مؤسسة مونتانيار > 10 واعتبرت3 يفب +. واستخدمت النابضة مماثلة لخلايا نخاع العظام بعد توصيل لحساب توصيل النسبة المئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : لوحات تمثيلية من زيمبابوي والطلاء- اللوحات إظهار المستعمرات الملون مع كلوريد إيودونيتروتيترازوليوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : ج-المنحدر والقصور Dusp1 تمس التنمية اللوكيميا. (أ-ج) منحنيات البقاء على قيد الحياة من الفئران زرعها مع ج-كيت+ الخلايا ABL1 المركز من وزن، Dusp1-/-ج-المنحدر-/-، والفئران-/- ج-المنحدر-/- Dusp1. (د-ه) النسبة المئوية يفب + الخلايا كما يحددها نظام مراقبة الأصول الميدانية في الدم المحيطي لدى الفئران زرع رسمها بوستترانسبلانت كل أسبوع. زيادة مستويات يفب والفئران تستسلم للموت كما هو الحال في وزن و Dusp1 كو. الفئران التي البقاء على قيد الحياة تدريجيا تفقد الخلايا يفب+ كما هو موضح في كو ج-المنحدر ومزدوجة عندما تعامل مع imatinib. وهذا الرقم تم تكييفها مع إذن من كيسارواني . وآخرون 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : ج-المنحدر و Dusp1 هناك حاجة لبقاء لسكس. (أ) التخطيطي من التحوير المستخدمة في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن المركز-ABL1 في الخلايا الجذعية. (ب) تصميم تجريبي لدراسة آثار Dusp1 وتثبيط ج-المنحدر من مركز دبي للزهور و BCI in فيفو. (ج) نظام مراقبة الأصول الميدانية يرسم استراتيجية النابضة سوينغ استخدامها لفرز الخلايا LSK لزرع الأعضاء. (د) النسبة المئوية للخلايا إيجابية المركز-ABL1 (تحدد بنسبة CD45.2 من الفئران المانحة) في الفئران خلال وبوستريتمينت مع مثبطات. مبعثر (ﻫ) نظام مراقبة الأصول الميدانية المؤامرات عرض تشيميريسم CD45 في الخلايا الحية، وكذلك في حجرة خلية LSK. يرجى ملاحظة عدم وجود CD45.2 في المجموع وفي حجرة LSK في الفئران المعالجة. وهذا الرقم تم تكييفها مع إذن من كيسارواني et al.13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: النشاط المجراة في مركز دبي للزهور وبي سي أي. (أ) خط الرسم البياني يبين مستويات والرمات-p38 بعد العلاج بي سي أي. (ب) RT-قبكر عرض التعبير عن الجينات المستهدفة ج-المنحدر في الدم المحيطي لدى الفئران بعد العلاج DFC. تمثل النقاط replicates ثلاثة من كل الماوس (n = 3). يمثل العدد أعلاه الرسوم البيانية فالقيمه المحسوبة من الطالب t-اختبار. وهذا الرقم تم تكييفها مع إذن من كيسارواني et al.13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الرقم 9 : دور ج-المنحدر وتثبيط DUSP1 في عينة المرضى بشرية. (أ) "النسبة المئوية كفوس" يحدده المقايسة LTC IC من مريضين بالتضليل، ومانح صحية تعامل مع السيارة أو تركيبات العقاقير المشار إليها. (ب) النسبة المئوية للخلايا البشرية ليوكيميك (hCD45) في نخاع العظام من الفئران نسجس في الأسبوع الثاني (إلى اليسار) وأسبوع 4 (يمين) للعلاج. (ج) يظهر هذا الفريق الممثل مؤامرات نظام مراقبة الأصول الميدانية تبين انخفاض كبير من الخلايا hCD45 في الفئران المعالجة بالعقاقير بينما تدخر الماوس الخلايا كما هو موضح mCD45. وهذا الرقم تم تكييفها مع إذن من كيسارواني et al.13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية، هو توسط الاستجابة العلاجية ل TKI حصار تيروزين-كيناز-أونكوبروتين الإشارات التي الورم مدمن. ومع ذلك، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيفية الهروب أقلية خلايا السرطانية التي تساهم الاعتماد والعلاج السرطاني4. كشفت الدراسات الأخيرة أن يشير إلى عامل النمو يتوسط المقاومة للعقاقير في سرطان الدم والأورام الصلبة الجهاز. وهذا يوحي بأن مختلف الآليات الجزيئية قد تكمن وراء المقاومة المتأصلة10،،من1112. لفهم الآلية وتحديد الجينات أهدافا للتنمية العلاجية، أجرينا ملامح شاملة كل الجينوم التعبير باستخدام الماوس (BaF3) والخلايا البشرية (K562). لم تستخدم العينات الأولية من الفئران ليوكيميك أو التضليل المرضى نظراً لأننا يشتبه في أن، كما عينات نخاع العظام الأولية غير متجانسة إلى حد كبير، أنها سوف يحجب هوية الجينات/الأهداف ذات الصلة. حتى الخلايا المنقي بجسم بوساطة الفرز (الخلايا الجذعية السلف) يحمل تغايرية مهمة. ولذلك، خط خلية المنقي ربما أكثر ملاءمة لتحديد الهدف لتجنب أي تعقيد غير مرغوب فيها التي تفرضها التغاير الوراثي. وحدد التحليل التعبير كل الجينوم أن ج-المنحدر، و Dusp1، و Zfp36 عادة أوبريجولاتيد في خلايا مقاومة للأدوية. حالما يتم تحديد الأهداف، يصبح على التحقق من الصحة جزء حاسم الاعتراف بدورها في هذا السياق الوراثية. استخدام overexpression كدنا والدراسات الوراثية ضربة قاضية في الخلايا BaF3 كشفت أن تثبيط ج-المنحدر و Dusp1 الكافية واللازمة لفعالية TKI حساسية. ولعل واحدة من أهم الخطوات في التحقق من صحة الهدف للتحقق من مدى أهمية الجينات/الأهداف التي تم تحديدها في العينات الأولية من الفأر والإنسان. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم خطوة باستخدام نماذج وراثية متعددة وتقديم أفضل الأفكار الميكانيكية لمزيد من الصقل لتقييم المخدرات/الهدف.

لفحص سريع على المستوى الخلوي استخدام كفوس أو الإنزيم لتسيك تساعد الباحثين لاختبار عدة تركيبات المخدرات، فضلا عن التركيزات، بسرعة قبل أن يتوجه إلى أساليب زرع وقتاً أكثر. ونظرا لأن التضليل مرض خلايا الجذعية، ونظرا لعدم قدرة الجزيئي لاستهداف الخلايا المكونة للدم البدائية وهادئة، من الضروري اختبار باستخدام نماذج تتصدى مباشرة لدورها في بقاء احلركه. لمعالجة هذه المسألة، ونحن تستخدم ماوس المعدلة وراثيا المركز-ABL التتراسيكلين إيندوسيبلي حيث يعبر عن نقل واكتساب التكنولوجيا محسن Scl. ومع ذلك، تعاني من نقص في حظيا بالمرض البشري النماذج الوراثية. ولذلك، من الضروري اختبار عينات المريض الأولية في نماذج أنسنة الماوس. ليتمكن من القيام بدراسة طويلة الأمد للكشف عن MRD على مر الزمن، إكسينوجرافت مستقرة غير المطلوبة التي قد تختلف أنواع، اعتماداً على الفئران والخلايا. بعد أربعة أشهر زرع، تم استنفاد الخلايا CD34 + البشرية حتى بدون علاج المخدرات، الذي قيد في الأكثر أنسنة الماوس نماذج. ويجري وضع نماذج الماوس أنسنة أفضل لاختبار الخلايا البشرية في الفئران26. نوصي بشدة بتحديد النشاط على الهدف لمثبطات أي تأثير خارج الهدف قد يسبب سمية للخلايا الطبيعية، الحد من تطبيق آخر. ومع ذلك، إذا كان لا يعرف الهدف المتلقين للمعلومات، وينبغي أن تستخدم نهج مختلفة. على سبيل المثال، تحديد طفرات مقاومة للأدوية باستخدام الطفرات العشوائية من البروتين المستهدف يمكن أن تعالج مباشرة سواء مثبط على الهدف27.

ينص البروتوكول على المقدمة هنا أسلوب شامل لتحديد الهدف والتحقق من الصحة باستخدام أنظمة نموذجية في المختبر و في فيفو متعددة. هذه الطرق يمكن تكييفها بسهولة للأهداف وأنواع السرطان الأخرى. كذلك حددت الدراسات الميكانيكية في الأهداف والصقل في توجيه الأدوية قد تساعد في وضع أفضل الطرائق العلاجية للعلاج الفعال و/أو العلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب ممتنون لدالي س. غ. لتوفير خلايا BaF3 و WEHI و "ريا ت." مسكف-المركز-ABL-آيريس--يفب بنيات. الكتاب ممتنون كارول م. لتوفير عينات المرضى من أزمة انفجار التضليل. هذه الدراسة وأيد منح للماجستير من لجنة التحقيق الوطنية (1RO1CA155091) ومؤسسة أبحاث سرطان الدم ومؤسسة الخامس، ومن نهلبي (R21HL114074-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Materials
RPMI Cellgro (corning) 15-040-CV
DMEM Cellgro (corning) 15-013-CV
IMDM Cellgro (corning) 15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment Takara T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) Stem Cell 3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) Stem Cell 4434
4-Hydroxytamoxifen Sigma H6278
Recombinant Murine SCF Prospec CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand Prospec CYT-340
Recombinant Murine IL-6 Prospec CYT-350
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17
DFC LKT Laboratories Inc. D3420
BCI Chemzon Scientific NZ-06-195
Imatinib LC Laboratory I-5508
Curcumin Sigma 458-37-7
NDGA Sigma 500-38-9
Penn/Strep Cellgro (corning) 30-002-CI
FBS Atlanta biological S11150
Trypsin EDTA 1x Cellgro (corning) 25-052-CI
1x PBS Cellgro (corning) 21-040-CV
L-Glutamine Cellgro (corning) 25-005-CL 5 mg/mL stock in water
Puromycin Gibco (life technologies) A11138-03
HEPES Sigma H7006
Na2HPO4.7H2O Sigma S9390
Protamine sulfate Sigma P3369 5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%) Sigma T8154
DMSO Cellgro (corning) 25-950-CQC
WST-1 Roche 11644807001
0.45 μM acro disc filter PALL 2016-10
70 μm nylon cell stariner Becton Dickinson 352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) Simga 1083
PBS Corning 21040CV
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail Roche CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5762
Nitrocullulose Membrane Bio-Rad 1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) Thermo Scientific 34075
CD5 eBioscience 13-0051-82
CD11b eBioscience 13-0112-75
CD45R (B220) BD biosciences 553092
CD45.1-FITC eBioscience 11-0453-85
CD45.2-PE eBioscience 12-0454-83
hCD45-FITC BD Biosciences 555482
Anti-Biotin-FITC Miltenyi 130-090-857 
Anti-7-4 eBioscience MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) eBioscience 13-5931-82
Anti-Ter-119 eBioscience 13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 BD  558612
CD117 APC  BD  553356
BD Pharm Lyse BD  555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) BD  554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow) BD  554723
phospho p38 Cell Signaling Technologies 4511S
total p38 Cell Signaling Technologies 9212
Mouse IgG control BD  554121
Alexa Flour 488 conjugated  Invitrogen A-11034
Calcium Chloride Invitrogen K278001
2x HBS Invitrogen K278002
EDTA Ambion AM9261
BSA Sigma A7906
Blood Capillary Tubes Fisher 22-260-950
Blood Collection Tube Giene Bio-One 450480
Newborn Calf Serum Atlanta biological S11295
Erythropoiein Amgen 5513-267-10
human SCF Prospec CYT-255
Human IL-3 Prospec CYT-210
G-SCF Prospec CYT-220
GM-CSF Prospec CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay) Stem Cell Technologies 5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate Stem Cell Technologies 7904
MEM alpha Gibco 12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 Becton Dickinson 329461
Mortor pestle Coor tek  60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM) Butler Schien 29405
SOC New England Biolabs B90920s
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar) Difco 214050
Terrific broth Becton Dickinson 243820
Agarose Genemate E-3119-500
Doxycycline chow TestDiet.com 52662 modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline 
Tamoxifen Sigma T5648
Iodonitrotetrazolium chloride  Sigma I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit Qiagen 69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) Promega M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit) Qiagen 217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) Ambion, Life Technologies AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) Invitrogen 18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) Bio-Rad 1725270
CD117 MicroBead Kit Miltenyi 130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R Eppendorf
TC-10 automated cell counter Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2 Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) Bio-RAD 17001401
Hemavet (boold counter) Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer) BD 
Fortessa I (FACS analyzer) BD 
FACSAriaII (FACS Sorter) BD 
Magnet Stand Miltenyi
Irradiator  J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA Mark I Model 68A source Cs 137
Mice
ROSACreERT2 Jackson Laboratory
Scl-tTA  Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ  mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6  Jackson Laboratory
NSGS mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-  Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Made in house
Cells
BaF3 Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells University Hospital, University of Cincinnati

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
  2. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
  3. Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
  4. O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
  5. Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
  6. Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
  7. Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
  9. Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  10. Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
  11. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
  12. Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
  13. Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
  14. Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
  15. Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
  16. Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
  17. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
  18. Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
  19. Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
  20. Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
  21. Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
  22. Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
  23. DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
  24. SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
  25. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
  26. Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
  27. Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).

Tags

أبحاث السرطان، 143 قضية، تيروزين كيناز مثبطات، سرطان الدم النقوي المزمن، الأمراض المتبقية ضئيلة، تيروزين كيناز، ليوكيميك الخلايا الجذعية، وإدمان السرطاني، مقاومة العلاج، زرع نخاع العظم، ونماذج الماوس
أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kesarwani, M., Kincaid, Z., Azam, M. … More

Kesarwani, M., Kincaid, Z., Azam, M. Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (143), e58194, doi:10.3791/58194 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter