Summary
احتياطي التدفق التاجي (CFR)، ويعرف بأنه نسبة تدفق الدم التاجي القصوى إلى تدفق الدم التاجي يستريح. نقدم بروتوكول لتقييم CFR في الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية، والذي يوفر الفرصة للتنبؤ بعوامل خطر القلب والأوعية الدموية في غياب مرض الشريان التاجي الانسدادي.
Abstract
مرض الشريان التاجي هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. بعد احتشاء عضلة القلب الحاد، التدخل المبكر والناجح في عضلة القلب عن طريق إعادة قناة الشريان التاجي هو الاستراتيجية الأكثر فعالية للحد من حجم عضلة القلب الإقفارية. لا يمكن تصور الميكروسكول التاجيوصورة في الجسم الحي، ولكن هناك العديد من التقنيات الغازية وغير الغازية التي يمكن استخدامها لتقييم المعلمات التي تعتمد مباشرة على وظيفة الأوعية الدموية التاجية. وظيفة بطانة الرحم بعد إعادة ضخ نقص التروية يمكن تقييمها أيضا على مستوى الدورة الدموية التاجية عن طريق احتياطي التدفق التاجي (CFR). في هذه الدراسة، تم قياس سرعة الذروة من الشرايين التاجية الأمامية اليسرى (LAD) في الفئران في الجسم الحي عن طريق تخطيط صدى القلب دوبلر عبر الصدر أثناء الراحة والإجهاد التحدي (الناجمة عن دوبوتامين). يمكن للقلب الطبيعي زيادة تدفق الدم التاجي تصل إلى أربع مرات فوق قيم الراحة أثناء الحث الإجهاد. بعد إعادة ضخ نقص التروية، وجدنا CFR تقلصت بشكل ملحوظ، والتي يمكن استخدامها كعلامة على خلل الأوعية الدموية الدقيقة التاجية. وقد فتحت CFR نافذة على أهمية خلل الأوعية الدموية الدقيقة، وقد ثبت أن التنبؤ خطر القلب والأوعية الدموية مستقلة عن ما إذا كان مرض الانسداد الشديد موجود.
Introduction
إعادة ضخ نقص التروية عضلة القلب (IR) هو شرط حيث يقتصر إمدادات الدم على القلب تليها استعادة التسريب وإعادة الأوكسجين في وقت واحد1. يمكن أن يحدث انسداد الشرايين التاجية بسبب تمزق الانسداد أو الكولسترول، مما يؤدي إلى اختلال حاد في العرض والطلب الأيضي، مما يسبب نقص الأكسجة في الأنسجة. إنقاذ عضلة القلب المعرضة للخطر، وتحسين وظيفة البطين الأيسر، وتعزيز البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب الحاد وقد لوحظ من قبل العلاج التسريب. ومع ذلك ، بعد إعادة قناة الشريان التاجي ، قد تحدث تشوهات وظيفية للأوعية التاجية الصغيرة2،3،4،5. نسبة كبيرة من المرضى، وربما ما يصل إلى 40٪، لا تستعيد الأوعية الدموية الدقيقة وضخ عضلة القلب على الرغم من استعادة تدفق التاجي. التصور وتقييم microvasculature التاجية يمكن أن يكون من الصعب في الجسم الحي، ولكن هناك عدد من التقنيات الغازية وغير الغازية التي يمكن استخدامها لتقييم المعلمات مباشرة اعتمادا على وظيفة الأوعية الدموية التاجية6 ،7. أيضا ، يمكن تقييم وظيفة البطانة على مستوى الدورة الدموية التاجية عن طريق CFR5.
تخطيط صدى القلب دوبلر عبر الصدر هو أداة غير الغازية التي تسمح لنا لدراسة سرعة تدفق الشريان التاجي وCFR5. CFR يمثل نسبة تدفق الدم التاجي القصوىإلى تدفق الدم التاجي يستريح 8. خلال تحدي الإجهاد، يزيد القلب الطبيعي من تدفق الدم التاجي حتى أربع مرات فوق قيمة الراحة. يزيد خطر القلب والأوعية الدموية عندما يتم تقليل CFR9. أظهر إيشيهارا وآخرون أن CFR كان يعاني من ضعف شديد مباشرة بعد رأب الأوعية التاجية5. في غياب تضيق الشريان التاجي ، ينخفض CFR خلال خلل الأوعية الدموية الدقيقة التاجية وموجود في حوالي نصف المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي المستقر10.
الهدف العام لهذه الطريقة هو التصور غير الغازية من وظائف الشريان التاجي الأمامي الأيسر (LAD) في الفئران عن طريق تخطيط صدى القلب، والتي يمكن استخدامها لحساب CFR. وهذا يوفر أداة تقييم هامة لتشخيص الخلل في الأوعية الدموية الدقيقة وتقييم العلاجات العلاجية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها جامعة لويزفيل المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC المعتمدة من البروتوكول 18223) ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية11.
1- الحيوانات
- استخدام 4 أشهر من العمر فيشر 344 الفئران (BW ~ 150-180 غرام) للدراسة.
2. التصوير بالموجات فوق الصوتية قبل جراحة الأشعة تحت الحمراء
- التخدير الفئران مع isoflurane - غرفة التعريفي في 5٪ مع 1.5-2.0 L / دقيقة O2 تدفق تليها 1.5-2.0٪ مع 1.5-2.0 L / دقيقة O2 تدفق. يتم الحفاظ على هذا التخدير طوال التجربة، خلال مراحل الراحة والإجهاد.
- وضع الحيوان في موقف supine وقص الصدر. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37-38 درجة مئوية باستخدام منصة الاحترار المدمجة. مراقبة معدل ضربات القلب باستخدام البرنامج.
ملاحظة: التخدير السليم أمر بالغ الأهمية للحفاظ على معدل ضربات القلب بمعدلات فسيولوجية طبيعية (بين 295-350 نبضة / دقيقة). - تطبيق مرهم الطبيب البيطري للعيون لمنع جفاف العينين قبل التصوير.
- إجراء تخطيط صدى القلب باستخدام مسبار خطي 13-24 ميغاهرتز (على سبيل المثال، MS250) (الشكل1A).
- وضع الحيوان في موقف supine على منصة ساخنة. تأكد من التحكم في التخدير عن طريق مخروط الأنف. ثم ضع المسبار للحصول على عرض المحور القصير parasternal (PSAX) باستخدام نظام السكك الحديدية (الشكل1B).
- نقل التحقيق في الاتجاه rostral من PSAX، وتحديد موقع الشريان الرئوي (الشكل1B).
- نقل التحقيق قليلا في اتجاه caudal من الشريان الرئوي لعرض LAD وتخزين الصورة.
ملاحظة: LAD من الصعب العثور على دون دوبلر اللون، لذلك الصور B-الوضع من LAD ليست دائماً ممكنة. - عندما تجعل الاختلافات الفردية من الصعب تحديد موقع الشريان التاجي LAD، اتبع التقنية المذكورة أدناه:
- نقل التحقيق الجانبي إلى الشريان الرئوي.
- زاوية المنصة بحيث يميل الحيوان، مقلوب، أو قليلا نحو الجانب الأيمن بحيث البطين الأيسر هو أكثر سهولة مرئية مع التحقيق.
- بمجرد التقاط الصورة في وضع B أو تخزينها في السينما، انقر فوق دوبلر اللون على الشاشة التي تعمل باللمس (الشكل1C). تصور الشريان التاجي (السهم الأبيض يشير LAD) في المحور القصير (الشكل1C). اللون الأحمر، كما رأينا في الوقت الحقيقي، يدل على اتجاه التدفق (أي، تدفق الدم نحو التحقيق).
- بعد تصور LAD على وضع دوبلر اللون، تغيير الوضع إلى موجة النبض (PW)-الوضع. ابحث عن وجود خط مؤشر أصفر على الشريان التاجي (الشكل2A).
- ضع خط PW الأصفر في منتصف الشريان التاجي. تأكد من أن الزاوية موازية لاتجاه التدفق.
ملاحظة: سرعة التدفق تعتمد بشكل كبير على زاوية خط PW، لذا تأكد من مطابقة زاوية المسبار على الشاشة مع زاوية LAD. استخدام الشاشة التي تعمل باللمس لضبط الزاوية؛ يجب أن تكون زاوية PW أقل من 60 درجة. - استخدام مخزن السينما لالتقاط سرعة تدفق الشريان التاجي LAD يستريح في ذروة diastole كما أشكال موجة (الشكل2B).
- بعد الحصول على سرعة تدفق LAD يستريح، وقياس سرعة التدفق القصوى من LAD أثناء الإجهاد لحساب CFR. لقياس سرعة التدفق القصوى أثناء الإجهاد، يغرس دوبوتامين بجرعة 20 ميكروغرام/كغ/دقيقة عبر الوريد الذيل8 (الشكل2C).
ملاحظة: لا ينبغي أن يكون ضخ الدوبوتامين أكثر من 8 دقائق. استخدام مضخة ضخ وتعيين قطر مضخة التسريب إلى 14.43 لحقنة BD 10 مل.- استخدام 25-G فراشة التسريب مجموعة لكانوأيشن الوريد الذيل. لوضع إبرة التسريب، وضع شريط صغير من الشاش حول قاعدة ذيل الفئران، ثم الاستيلاء مع hemostats والتواء tourniquet لتطبيق الضغط وتسبب الوريد للتكبير.
- ضع الإبرة أثناء اتصالها مباشرة بحقنة دوبوتامين.
ملاحظة: اتخاذ مزيد من العناية بعدم إدخال المخدرات عن طريق الخطأ عند رسم الدم لضمان وضع السليم للإبرة في الوريد الذيل. أيضا، تأكد من تجنب إدخال فقاعة الهواء في الوريد، كما قد يكون الانسداد قاتلة للحيواني. - بمجرد وضع الإبرة، وتحقيق الاستقرار مع الغراء وقطعة من الشريط الجراحي، وتأمين خط التسريب إلى الذيل.
- إزالة hemostats وtourniquet لاسترداد التدفق.
- ضع حقنة دوبوتامين في مضخة التسريب ووضعها لحقن 20 ميكروغرام/كغ/دقيقة.
- خلال ضخ دوبوتامين، مراقبة بعناية الذروة LAD ومعدل ضربات القلب. سجل بشكل دوري القمم PW LAD في وضع دوبلر، خاصة كلما يزيد استجابة لDobutamine.
ملاحظة: التحدي الإجهاد الناجمعن دوبوتامين يسبب القلب للعمل بجد; هذا غالبا ما يؤدي إلى حركة القلب وLAD. تكون على استعداد لتحريك الحيوان، والتحقيق، أو كليهما من أجل الحفاظ على LAD في العرض. - بعد أن استقرت قمم LAD ومعدل ضربات القلب خلال التحدي، ووقف ضخ دوبوتامين، وإزالة مجموعة ضخ الوريد الذيل وإزالة الحيوان من المنصة. السماح للحيواني للتعافي في قفصمنزله.
- حدد أداة Peak Vel للحصول على سرعات البساطي القصوى من الصور الموضحة في الشكلين 2B وC.
- حساب مؤشر CFR كنسبة من الإجهاد LAD (دوبوتامين) ذروة سرعة التدفق الانبساطي إلى سرعة تدفق الانبساطي الذروة LAD يستريح (الشكل2A).
3. إصابة نقص التروية
- التخدير الفئران مع isoflurane - غرفة التعريفي في 5٪ مع 1.5-2.0 L / دقيقة O2 تدفق تليها 1.5-2.0٪ مع 1.5-2.0 L / دقيقة O2 تدفق.
- تأكيد عمق التخدير بسبب عدم وجود رد الفعل انسحاب دواسة. استخدام مرهم الطبيب البيطري للعيون على العينين لمنع الجفاف. الحفاظ على درجة حرارة الجسم المناسبة من 37-38 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة أو وحدة تحكم في درجة حرارة الحيوان.
- إدارة ميلوكسيكام قبل الجراحة، 5 ملغ / كغ العضل، 15 دقيقة قبل الجراحة، تليها 2 مل تحت الجلد بولوس من 0.9٪ المالحة لمنع الجفاف أثناء الجراحة. واستخدمت قفازات وأدوات معقمة، واستخدمت تقنيات العقيم. باستخدام مصدر ضوء الألياف البصرية، تبيب الفئران باستخدام 18 قياس القسطرة الرابع والاتصال بجهاز التنفس الصناعي.
- ليجيت لاد باستخدام 8-0 خيط حيدة من خلال فتح 15 ملم في الفضاء بين الوكوستال 5. ربط عقدة عادي وترك لمدة 30 دقيقة. الافراج عن الرباط بعد 30 دقيقة والتحقق من التسريب عن طريق احمرار منطقة تغيير لونها سابقا من عضلة القلب لمدة 1-2 دقيقة12.
- أغلق القفص الصدري باستخدام خياطة قابلة للامتصاص 4-0 مع نمط خياطة متقطع، ثم أغلق الجلد باستخدام خياطة حريرية غير قابلة للامتصاص 5-0 مع نمط خياطة مستمر.
- إزالة الحيوان من التخدير. السماح للحيواني للتعافي في القفص المنزلي. تم حقن 5mg/kg ميلوكسيكام العضل في كل 24 ساعة قبل القتل الرحيم الحيوان (72hours بعد الجراحة).
4. التصوير بالموجات فوق الصوتية بعد جراحة الأشعة تحت الحمراء
- 72 ح بعد جراحة الأشعة تحت الحمراء، وقياس تدفق التاجية وCFR مرة أخرى. مقارنة القياسات قبل قياسات الأشعة تحت الحمراء. كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.15 كما هو موضح أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لهذه الدراسة، استخدمنا 12 أنثى فيشر 344 الفئران. لقد قمنا بإجراء اختبار الإجهاد مع دوبوتامين وقياس سرعة الشريان التاجي LAD قبل و 72 ساعة بعد جراحة الأشعة تحت الحمراء. قبل جراحة الأشعة تحت الحمراء، تم قياس سرعة الشريان التاجي يستريح LAD كما 423 ± 59 ملم / ث، والتي زادت بعد ضخ دوبوتامين (1005 ± 77mm / s) (الشكل3A). بعد 72 ساعة من إعادة ضخ نقص التروية، كانت سرعة الشريان التاجي لـ LAD أعلى بكثير مقارنة بسرعة الشريان التاجي لـ LAD قبل جراحة الأشعة تحت الحمراء (743 ± 40 mm/s مقابل 423 ± 59 مم/s) (الشكل3A). تم تخفيض استجابة الإجهاد لاختبار Dobutamine بعد جراحة الأشعة تحت الحمراء بشكل كبير بالمقارنة مع الاستجابات قبل جراحة الأشعة تحت الحمراء (937 ± 67ms / ثانية مقابل 1005 ± 77mm / ثانية) (الشكل3A).
ويحسب CFR كنسبة من سرعة تدفق الذروة أثناء الإجهاد (دوبوتامين) إلى سرعة تدفق يستريح(تقاس قبل ضخ دوبوتامين) 8. كان CFR 2.1 ± 0.35 في الفئران الشباب قبل جراحة الأشعة تحت الحمراء (الشكل3B)ولكن خفضت بشكل ملحوظ (1.1 ± 0.25) بعد 72 ساعة من جراحة الأشعة تحت الحمراء، على الرغم من أن سرعة الشريان التاجي LAD يستريح كان أعلى في هذه الفئران مقارنة مع البيانات التي تم الحصول عليها قبل جراحة الأشعة تحت الحمراء ( الشكل 3جيم). وبالإضافة إلى ذلك، لم تكن هناك تغييرات كبيرة في وظيفة الانقباضي للبطين الأيسر في الفئران بعد 72 ساعة من جراحة الأشعة تحت الحمراء (الشكل3C).
الشكل 1: موقع الشريان التاجي. A. موقف التحقيق على الفئران في حين الحصول على سرعة الشريان التاجي LAD. B. محور قصير التمثيل التشريحي للشريان الرئوي، الشريان الأبهري، والشريان التاجي LAD. C. التصور التشريحي للشريان التاجي LAD على تخطيط صدى القلب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير سرعة موجة النبض للشريان التاجي لـ LAD. A. تمثيل وضع استشعار سرعة موجة النبض على الشريان التاجي LAD. B. LAD الشريان التاجي نبض صورة موجة خلال حالة بقية. C. LAD الشريان التاجي نبض صورة موجة أثناء حالة الإجهاد (دوبوتامين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النتائج الرئيسية من هذه الدراسة هي أن الأشعة تحت الحمراء يزيد من سرعة الشريان التاجي LAD يستريح ويضعف CFR، حتى في غياب أي تضيق الأوعية الدموية المتبقية.
فهم علم وظائف الأعضاء التاجية هو جزء أساسي من صنع القرار السريري لأطباء القلب لعلاج مرض الشريان التاجي. CFR هي واحدة من المعلمات الوظيفية الهامة في فهم الفيزيولوجيا المرضية للدورة الميكرودية التاجية7،13. CFR هو طريقة غير الغازية لتقييم كل من تضيق الشريان التاجي والدورة الدموية الأوعية الدموية التاجية الدقيقة وهو مؤشر على إمدادات الدم عضلة القلب، وصراحة قدرة الإكليل على زيادة تدفق الدم تحت ظروف الإجهاد7. في كثير من الأحيان يعكس CFR العادي(>2.0) توقعات جيدة، في حين أن CFR أقل من 1.90 يوفر معلومات تشخيصية إضافية لتحديد مرض الشريان التاجي عالي المخاطر14،15،16.
تظهر نتائجنا أنه على الرغم من الحفاظ على وظيفة الانقباضي بعد إعادة التسريب نقص التروية (الشكل3C)،كان CFR أقل بكثير (الشكل3B). وهكذا، فإن إعادة قناة الشرايين التاجية المنسقة لا يحسن التسريب الأوعية الدموية الدقيقة. انخفاض CFR تمكن من الكشف عن ضعف توسع الأوعية الدموية الدقيقة بعد إعادة ضخ نقص التروية.
توضح هذه الدراسة التقييمات التسلسلية CFR لاستكشاف تأثير مختلف العلاجات الدوائية باستخدام تخطيط صدى القلب دوبلر عبر الصدر غير الغازية. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتقييم الوظيفي التاجي في البحوث الحيوانية الصغيرة كأداة تشخيص سريرية مجدية وقابلة للتطبيق. وهذا سيؤدي إلى التقليل إلى أدنى حد من متطلبات استخدام الحيوانات، القتل الرحيم، أو necropsy في النماذج الحيوانية الصغيرة. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول تصور الشريان التاجي والحصول على صور سرعة PW ذات نوعية جيدة. خطوة حاسمة أخرى هي الحفاظ على التصور LAD أثناء حالة الإجهاد. خلال تحدي دوبوتامين، يزيد معدل ضربات القلب وLAD قد تتحرك من مجال الرؤية. يجب أن يكون الباحثون على استعداد لتحريك الميدان من أجل اتباع الشريان التاجي. وتشمل القيود في الدراسة الحالية حجم العينة الصغيرة نسبيا، وعدم وجود ارتباط بين CFR وقطر تجويف الشريان التاجي في الجسم الحي في الفئران، وذلك بسبب صعوبة في الحصول على تصور دقيق لقياس حجم الشريان التاجي. ومع ذلك، فإن الأساليب الموصوفة هنا يمكن الاعتماد عليها، واستنساخها، وتقدم معلومات ثاقبة عن الأضرار التي لحقت microvasculature القلب بعد إعادة التسريب نقص التروية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه
Acknowledgments
نود أن نشكر مؤسسة هيلمسلي على توفير معدات الموجات فوق الصوتية لإجراء تجاربنا. تم دعم هذا العمل بمنحة NIA R01 053585.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion. Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).
- Marzilli, M., Mariani, M. Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size. Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, 40s-42s (2001).
- Prasad, A., Gersh, B. J. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).
- Ishihara, M., et al. Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction. British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).
- Camici, P. G., d'Amati, G., Rimoldi, O. Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment. Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).
- Chung, K. S., Nguyen, P. K. Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic. Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).
- Kelm, N. Q., et al. Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age. PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).
- Pan, M., et al. Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure. Revista Española de Cardiología. 56 (5), 459-464 (2003).
- Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction. Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health (2011).
- Ciuffreda, M. C., et al. Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain. PloS one. 9 (4), e95913-e95913 (2014).
- van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure. European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).
- Naya, M., et al. Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).
- Cortigiani, L., et al. Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery. Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease. Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).
