Summary
Coronaire stroomreserve (CFR), wordt gedefinieerd als de verhouding van de maximale coronaire bloedtoevoer naar de rust coronaire bloedstroom. We presenteren een protocol voor het evalueren van CFR bij ratten via echografie, die de mogelijkheid biedt om cardiovasculaire risicofactoren te voorspellen bij afwezigheid van obstructieve coronaire ziekte.
Abstract
Coronaire hartziekte is de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd. Na een acuut myocardinfarct is vroege en succesvolle myocardiale interventie via rekanalisatie van de coronaire slagader de meest effectieve strategie voor het verminderen van de grootte van ischemisch myocardium. De coronaire Microvasculatuur kan niet worden gevisualiseerd en afgebeeld in vivo, maar er zijn verschillende invasieve en niet-invasieve technieken die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van parameters die rechtstreeks afhankelijk zijn van coronaire microvasculaire functie. De endotheliale functie na ischemie reperfusie kan ook worden beoordeeld op het niveau van de coronaire circulatie via de coronaire stroomreserve (CFR). In deze studie werd de pieksnelheid van linker anterieure aflopende (LAD) coronaire slagaders gemeten bij ratten in vivo via Transthoracische Doppler echocardiografie tijdens rust-en stress-uitdaging (geïnduceerd door dobutamine). Een normaal hart kan zijn coronaire bloedstroom tot vier keer boven de rust waarden verhogen tijdens stress-inductie. Na ischemie reperfusie, we vonden een significant verminderde CFR, die kan worden gebruikt als een marker van coronaire microvasculaire dysfunctie. CFR heeft een venster geopend over het belang van microvasculaire disfunctie en is aangetoond dat het cardiovasculaire risico voorspelt, onafhankelijk van de vraag of de ernstige obstructieve aandoening aanwezig is.
Introduction
Myocardiale ischemie reperfusie (IR) is een aandoening waarbij de bloedtoevoer beperkt is tot het hart, gevolgd door de restauratie van perfusie en gelijktijdige reoxygenatie1. Occlusie van coronaire slagaders kan worden veroorzaakt door een embolus of cholesterol plaque ruptuur, wat resulteert in een ernstige onbalans van metabole vraag en aanbod, waardoor weefselhypoxie. Berging van het in gevaar gebracht myocardium, verbetering van de linker ventriculaire functie, en verbetering van de overleving bij patiënten met acuut myocardinfarct zijn waargenomen door de reperfusie therapie. Echter, na rekanalisatie van de coronaire slagader, functionele afwijkingen van kleine coronaire vaten kunnen optreden2,3,4,5. Een aanzienlijk deel van de patiënten, misschien wel 40%, niet herwinnen microvasculaire en myocardiale perfusie ondanks het herstel van coronaire stroming. Visualisatie en evaluatie van de coronaire Microvasculatuur kan moeilijk zijn in vivo, maar er zijn een aantal invasieve en niet-invasieve technieken die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van parameters direct afhankelijk van de coronaire microvasculaire functie6 ,7. Ook kan de endotheliale functie worden beoordeeld op het niveau van de coronaire circulatie via het CFR5.
Transthoracic Doppler echocardiografie is een niet-invasief hulpmiddel dat ons toelaat om coronaire stromingssnelheid en CFR5te bestuderen. CFR vertegenwoordigt de verhouding van maximale coronaire bloedtoevoer naar de rust coronaire bloedstroom8. Tijdens de stress-uitdaging, een normaal hart verhoogt de coronaire bloedstroom tot vier keer boven de rust waarde. Cardiovasculair risico neemt toe wanneer CFR wordt verminderd9. Ishihara et al toonde aan dat het CFR onmiddellijk na de coronaire angioplastie5ernstig werd aangetast. Bij afwezigheid van coronaire arteriestenose neemt CFR af tijdens de coronaire microvasculaire disfunctie en is aanwezig bij ongeveer de helft van de patiënten met stabiele coronaire hartziekte10.
Het algemene doel van deze methode is niet-invasieve visualisatie van linker anterieure aflopende coronaire slagader (LAD) functie bij ratten via echocardiografie, die kan worden gebruikt om CFR te berekenen. Dit biedt een belangrijk beoordelings instrument voor het diagnosticeren van microvasculaire disfunctie en het evalueren van mogelijke therapeutische behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen goedgekeurd door de Universiteit van Louisville institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC-goedgekeurd protocol 18223) en de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren11.
1. dieren
- Gebruik 4 maanden oude vrouwelijke Fisher 344 ratten (BW ~ 150-180 g) voor de studie.
2. ultrasone beeldvorming vóór IR-chirurgie
- Anesthetiseer de rat met Isofluraan-inductie kamer bij 5% met 1,5 – 2,0 l/min O2 stroom, gevolgd door 1,5 – 2,0% met 1,5 – 2,0 L/min O2 -stroom. Deze anesthesie wordt gehandhaafd gedurende het experiment, tijdens de rust en stress stadia.
- Plaats het dier in rugligging en Scheer de thorax. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37-38 °C met behulp van het ingebouwde verwarmende platform. Bewaak de hartslag met behulp van de software.
Opmerking: juiste anesthesie is cruciaal voor het handhaven van de hartslag tegen normale fysiologische tarieven (tussen 295-350 beats/min). - Breng oftalmische dierenarts zalf om de droogheid van de ogen voorafgaand aan de beeldvorming te voorkomen.
- Voer een echocardiografie uit met een lineaire sonde van 13 – 24 MHz (bijv. MS250) (Figuur 1a).
- Plaats het dier in de liggende positie op het verwarmde platform. Zorg ervoor dat de anesthesie wordt bestuurd via de neuskegel. Plaats vervolgens de sonde om de parasternal Short Axis View (PSAX) te verkrijgen met behulp van het railsysteem (Figuur 1b).
- Als u de sonde in de rostrale migratoire richting van de PSAX beweegt, lokaliseert u de longslagader (Figuur 1b).
- Beweeg de sonde lichtjes in de richting caudal van de longslagader om de jongen te bekijken en de afbeelding op te slaan.
Opmerking: de LAD is moeilijk te vinden zonder kleur Doppler, dus B-mode beelden van de LAD zijn niet altijd mogelijk. - Wanneer individuele verschillen het moeilijk maken om de LAD coronaire slagader te lokaliseren, volg dan de onderstaande techniek:
- Beweeg de sonde laterale naar de longslagader.
- Hoek van het platform, zodat het dier is geneigd, omgekeerd, of iets naar de rechterkant, zodat de linker ventrikel is gemakkelijker zichtbaar met de sonde.
- Zodra het beeld in B-modus is vastgelegd of Cine-opgeslagen, klikt u op de kleur Doppler op het aanraakscherm (afbeelding 1c). Visualiseer de coronaire slagader (witte pijl geeft LAD aan) in de korte as (figuur 1c). De rode kleur, zoals te zien in real time, is indicatief voor de richting van de stroming (d.w.z., de bloedstroom is naar de sonde).
- Na het visualiseren van LAD op een Color-Doppler-modus, verander de modus in de pulse wave (PW)-modus. Zoek naar de aanwezigheid van een gele-indicator lijn op de coronaire slagader (Figuur 2a).
- Plaats de gele PW-lijn in het midden van de coronaire slagader. Zorg ervoor dat de hoek evenwijdig is aan de richting van de stroming.
Opmerking: snelheid van de stroom is sterk afhankelijk van de hoek van de PW-lijn, dus zorg ervoor dat u de hoek van de on-screen sonde met de hoek van de jongen. Gebruik het aanraakscherm om de hoek aan te passen; De PW-hoek moet kleiner zijn dan 60 °. - Gebruik Cine Store om de snelheid van de rust Lad coronaire stroming op de piek diastole als golfvormen (Figuur 2b) vast te leggen.
- Na het verkrijgen van rust LAD stroomsnelheid, meet de maximale stromingssnelheid van LAD tijdens de stress te berekenen CFR. Om de maximale stromingssnelheid tijdens de stress te meten, dobutamine bezielen in een dosis van 20 μg/kg/min via de staart ader8 (figuur 2c).
Opmerking: dobutamine infusie mag niet meer dan 8 min. gebruik een infusiepomp en stel de diameter van de infusiepomp in op 14,43 voor BD 10 mL spuit.- Gebruik 25-G infusievlinder set voor de cannulatie van de staart ader. Om de infusie naald te plaatsen, plaats een kleine strook gaas rond de onderkant van de staart van de rat, pak dan met hemostatica en draai de tourniquet om druk toe te passen en de ader te vergroten.
- Plaats de naald in de directe verbinding met de dobutamine spuit.
Opmerking: Neem extra zorg niet per ongeluk introduceren drug bij het opstellen van bloed om de juiste plaatsing van de naald in de staart ader. Zorg er ook voor dat u geen luchtbel in de ader invoert, omdat een embolie dodelijk kan zijn voor het dier. - Zodra de naald is geplaatst, stabiliseren met een lijm en een stuk van de chirurgische tape, het veiligstellen van de infusielijn aan de staart.
- Verwijder de hemostats en tourniquet om de stroom te herstellen.
- Plaats de dobutamine spuit in de infusiepomp en stel deze in om 20 μg/kg/min te injecteren.
- Tijdens de infusie met dobutamine, zorgvuldig controleren de LAD piek en hartslag. Neem periodiek LAD PW-pieken op in de Doppler-modus, vooral wanneer deze toeneemt als reactie op dobutamine.
Opmerking: de stress Challenge geïnduceerd door dobutamine zorgt ervoor dat het hart harder werkt; Dit resulteert vaak in de beweging van het hart en de jongen. Wees voorbereid om het dier, de sonde of beide te verplaatsen om de jongen in beeld te houden. - Nadat LAD pieken en hartslag tijdens de Challenge zijn vastgesteld, stopt u de infusie met dobutamine, verwijdert u de infusieset van de staart ader en verwijdert u het dier uit het platform. Laat het dier in zijn huis kooi herstellen.
- Selecteer Peak vel tool om de piek diastolische snelheden te verkrijgen uit de afbeeldingen getoond in Figuur 2b en C.
- Bereken de CFR index als de verhouding van de LAD stress (dobutamine) piek diastolische stromingssnelheid naar de rust LAD piek diastolische stromingssnelheid (Figuur 2a).
3. ischemie reperfusie letsel
- Anesthetize rat met Isofluraan-inductie kamer bij 5% met 1,5 – 2,0 l/min O2 stroom gevolgd door 1,5 – 2,0% met 1,5 – 2,0 L/min O2 stroom.
- Bevestig de diepte van de anesthesie door het ontbreken van de pedaal terugtrekking reflex. Gebruik oftalmische dierenarts zalf op de ogen om droogheid te voorkomen. Handhaaf de juiste lichaamstemperatuur van 37-38 °C met behulp van een verwarmingskussen of een dier temperatuurregelaar.
- Dien pre-chirurgische Meloxicam, 5 mg/kg intramusculair, 15 minuten voor de operatie, gevolgd door 2 mL subcutane bolus van 0,9% zoutoplossing om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen. Er werden steriele handschoenen en instrumenten gebruikt en er werden aseptische technieken toegepast. Met behulp van de Fiber-Optic lichtbron, intuberen rat met behulp van 18-gauge IV katheter en aansluiten op de ventilator.
- Ligate LAD met 8-0 Monofilament hecht tot 15 mm opening op de 5ste intercostale ruimte. Bind een gewone knoop en laat voor 30 min. visueel bevestigen ischemie in alle ratten via verkleuring van het hart oppervlak12. Laat de ligatuur na 30 minuten los en verifieer reperfusie door de roodheid van het eerder verkleurde gebied van de hartspier voor 1-2 min12.
- Sluit de ribbenkast met 4-0 absorbabel hechtmiddel met een onderbroken hecht patroon en sluit vervolgens de huid met behulp van 5-0 niet-absorbabel zijde hechtmiddel met continu hecht patroon.
- Verwijder het dier van de anesthesie. Laat het dier in de huis kooi herstellen. 5mg/kg Meloxicam werd elke 24 uur intramusculair geïnjecteerd alvorens het dier te euthanatatie (72uur na de operatie).
4. ultrasone beeldvorming na IR-chirurgie
- 72 h na IR chirurgie, meet de coronaire stroming en CFR opnieuw. Vergelijk de metingen tot vóór IR-metingen. Herhaal de stappen 2,1 tot en met 2,15 zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor deze studie gebruikten we 12 vrouwelijke Fisher 344 ratten. We voerden een stresstest uit met dobutamine en gemeten LAD coronaire slagsnelheid vóór en 72 uur na de IR-operatie. Vóór de IR-operatie werd de rust LAD coronaire slagader snelheid gemeten als 423 ± 59 mm/s, die werd verhoogd na infusie met dobutamine (1005 ± 77mm/s) (Figuur 3a). Na 72 h van ischemie reperfusie, rust LAD coronaire snelheid was significant hoger in vergelijking met de rust LAD coronaire slagader snelheid voor de IR chirurgie (743 ± 40mm/s VS 423 ± 59 mm/s) (Figuur 3a). De stress respons op de dobutamine test na de IR-operatie werd significant verlaagd in vergelijking met de respons voor IR-chirurgie (937 ± 67ms/s versus 1005 ± 77mm/s) (Figuur 3a).
CFR wordt berekend als de verhouding van de piekstroom snelheid tijdens stress (dobutamine) tot de ruststroom snelheid (gemeten vóór de infusie van dobutamine)8. CFR was 2,1 ± 0,35 bij jonge ratten vóór de IR chirurgie (Figuur 3b) maar significant verlaagd (1,1 ± 0,25) na 72 h van de IR chirurgie, hoewel de rust Lad coronaire slagsnelheid hoger was bij deze ratten vergeleken met gegevens verkregen vóór IR chirurgie ( Figuur 3C). Daarnaast waren er geen significante veranderingen in de systolische functie van de linker ventrikel bij ratten na 72 h van de IR chirurgie (figuur 3c).
Figuur 1: coronaire slagader locatie. A. sonde positie op de rat tijdens het verkrijgen van Lad coronaire slagader snelheid. B. korte as anatomische representatie van de longslagader, aorta, en Lad coronaire slagader. C. anatomische visualisatie van Lad coronaire slagader op echocardiografie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de Pulsgolfsnelheid beeldvorming van de Lad coronaire slagader. A. weergave van de puls Wave Velocity sensor plaatsing op Lad coronaire slagader. B. Lad coronaire slagader puls Wave beeld tijdens de rusttoestand. C. Lad coronaire hartslag puls Wave beeld tijdens de stress (dobutamine) voorwaarde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Meting van de coronaire stroming met behulp van Doppler echocardiografie. A. puls Golf snelheid gemeten in controle tijdens de rest (CONT b) en tijdens dobutamine infusie (CONT D) en bij dieren na 72 h van de IR chirurgie tijdens de rest (IR B) en tijdens de dobutamine Challenge (IR D), p ≪ 0,05 CONT b vs. ischemie reperfusie B (*). B. CFR werd berekend op basis van Pulse Wave in de proefdieren (n = 9), p ≪ 0,05 CONT versus IR (*). C. Fractioneel inkorten beoordeling van de experimentele groepen (n = 9). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD, geanalyseerd met one-way ANOVA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste bevindingen van de huidige studie zijn dat IR verhoogt de rust Lad coronaire slagader snelheid en schaadt CFR, zelfs bij afwezigheid van eventuele residuele angiografische stenose.
Het begrijpen van de coronaire fysiologie is een essentieel onderdeel van de klinische besluitvorming voor cardiologen voor de behandeling van coronaire hartziekte. CFR is een van de belangrijke functionele parameters in het begrijpen van de pathofysiologie van coronaire microcirculatie7,13. CFR is een niet-invasieve methode om zowel coronaire arteriestenose als coronaire microvasculaire circulatie te beoordelen en is een indicator van myocardiale bloedtoevoer, expliciet het vermogen van de coronairs om de bloedtoevoer onder stress condities7te verhogen. Een normaal CFR (>2,0) weerspiegelt vaak een goede prognose, terwijl CFR minder dan 1,90 incrementele diagnostische informatie verschaft voor de identificatie van een hoog-risico coronaire hartziekte14,15,16.
Onze resultaten tonen aan dat, hoewel de systolische functie werd behouden na ischemie reperfusie (figuur 3c), CFR significant lager was (Figuur 3b). Dus, rekanalisatie van stenotische coronaire slagaders verbetert niet microvasculaire perfusie. Verminderde CFR maakt detectie van verminderde microvasculaire vasodilatatie na ischemie reperfusie.
Deze studie demonstreert de seriële CFR-evaluaties om het effect van verschillende farmacologische therapieën te onderzoeken met behulp van niet-invasieve transthoracische Doppler-echocardiografie. Deze methode van coronaire functionele beoordeling kan worden gebruikt in kleine dierlijke onderzoek als een haalbaar en levensvatbaar klinisch diagnostisch hulpmiddel. Dit zal leiden tot het minimaliseren van de eis van dierlijk gebruik, euthanasie, of obductie in de kleine diermodellen. Kritische stappen in dit protocol zijn het visualiseren van de coronaire slagader en het verkrijgen van de PW Velocity beelden van goede kwaliteit. Een andere kritieke stap is het handhaven van LAD visualisatie tijdens de stress status. Tijdens de dobutamine-uitdaging neemt de hartslag toe en kan de jongen zich verplaatsen van het gezichtsveld; onderzoekers moeten bereid zijn om het veld te verplaatsen om de coronaire slagader te volgen. Beperkingen in de huidige studie omvatten de relatief kleine steekproefgrootte, het gebrek aan correlatie tussen CFR en de lumen diameter van de coronaire slagader in vivo bij ratten, vanwege de moeilijkheid om nauwkeurige visualisatie te verkrijgen voor de maat meting van de coronaire slagader. Echter, de hier beschreven methoden zijn betrouwbaar, reproduceerbaar, en bieden inzichtelijke informatie over de schade toegebracht aan de cardiale Microvasculatuur na ischemie reperfusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
We willen de Helmsley Foundation bedanken voor het leveren van ultrasone apparatuur om onze experimenten uit te voeren. Dit werk werd gesteund door NIA R01 053585 Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion. Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).
- Marzilli, M., Mariani, M. Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size. Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, 40s-42s (2001).
- Prasad, A., Gersh, B. J. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).
- Ishihara, M., et al. Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction. British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).
- Camici, P. G., d'Amati, G., Rimoldi, O. Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment. Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).
- Chung, K. S., Nguyen, P. K. Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic. Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).
- Kelm, N. Q., et al. Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age. PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).
- Pan, M., et al. Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure. Revista Española de Cardiología. 56 (5), 459-464 (2003).
- Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction. Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health (2011).
- Ciuffreda, M. C., et al. Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain. PloS one. 9 (4), e95913-e95913 (2014).
- van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure. European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).
- Naya, M., et al. Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).
- Cortigiani, L., et al. Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery. Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease. Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).
