Summary
Koronar flow reserve (CFR), er defineret som forholdet mellem maksimal koronar blodgennemstrømning til den hvilende koronare blodgennemstrømning. Vi præsenterer en protokol til evaluering af CFR i rotter via ultralyd, som giver mulighed for at forudsige kardiovaskulære risikofaktorer i fravær af obstruktiv koronar sygdom.
Abstract
Koronararteriesygdom er den førende dødsårsag på verdensplan. Efter en akut myokardieinfarkt, tidlig og vellykket myokardial intervention via en af de koronararterie, er den mest effektive strategi for at reducere størrelsen af iskæmisk myokardidium. Koronarmikrovaskulaturen kan ikke visualiseres og afbildet in vivo, men der er flere invasive og ikke-invasive teknikker, der kan bruges til at vurdere parametre, der afhænger direkte af koronar microvaskulær funktion. Endotelfunktionen efter iskæmi reperfusion kan også vurderes på niveauet af koronar cirkulation via koronar flow reserve (CFR). I denne undersøgelse, Peak hastighed af venstre forreste faldende (Lad) koronararterier blev målt i rotter in vivo via transthoracic Doppler ekkokardiografi under hvile og stress Challenge (induceret af Dobutamin). Et normalt hjerte kan øge dets koronare blodgennemstrømning op til fire gange over hvile værdierne under stress induktion. Efter iskæmi reperfusion, vi fandt en signifikant formindsket CFR, som kan bruges som en markør for koronar microvaskulær dysfunktion. CFR har åbnet et vindue om betydningen af microvaskulær dysfunktion og har vist sig at forudsige kardiovaskulær risiko uafhængigt af, om den svære obstruktive sygdom er til stede.
Introduction
Myokardieiskæmi reperfusion (IR) er en tilstand, hvor blodforsyningen er begrænset til hjertet efterfulgt af genoprettelsen af perfusion og samtidig reoxygenation1. Okklusion af koronararterie kan være forårsaget af en emboll eller kolesterol plaque ruptur, hvilket resulterer i en alvorlig ubalance i metaboliske udbud og efterspørgsel, forårsager vævs hypoksi. Bjærgning af truet myokardiet, forbedre venstre ventrikelfunktion, og øge overlevelsen hos patienter med akut myokardieinfarkt er blevet observeret af reperfusion terapi. Men, efter at have trukket koronararterie, kan funktionelle abnormiteter af små koronarkar forekomme2,3,4,5. En betydelig andel af patienter, måske så mange som 40%, ikke genvinde microvaskulære og myokardieperfusion på trods af genoprettelsen af koronar flow. Visualisering og evaluering af koronare mikrovaskulaturen kan være svært in vivo, men der er en række invasive og ikke-invasive teknikker, der kan anvendes til at vurdere parametre direkte afhængigt af koronar microvaskulær funktion6 ,7. Endotel funktionen kan også vurderes på niveauet af koronar cirkulation via CFR5.
Transthoracic Doppler ekkokardiografi er et noninvasivt værktøj, der giver os mulighed for at studere koronararterie flowhastighed og CFR5. CFR repræsenterer forholdet mellem maksimal koronar blodgennemstrømning og den hvilende koronare blodgennemstrømning8. Under stress Challenge, et normalt hjerte øger koronar blodgennemstrømning op til fire gange over hvile værdien. Kardiovaskulær risiko øges, når CFR er formindsket9. Ishihara et al viste, at CFR var alvorligt svækket umiddelbart efter Koronar angioplastik5. I fravær af koronararterie stenose, CFR falder under koronar microvaskulær dysfunktion og er til stede i omkring halvdelen af patienterne med stabil koronararteriesygdom10.
Det overordnede mål med denne metode er ikke-invasiv visualisering af venstre forreste faldende koronararterie (Lad) funktion i rotter via ekkokardiografi, som kan anvendes til at beregne CFR. Dette giver et vigtigt vurderingsværktøj til diagnosticering af microvaskulær dysfunktion og evaluering af potentielle terapeutiske behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af University of Louisville institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC-godkendt protokol 18223) og NIH guide til pleje og brug af forsøgsdyr11.
1. dyr
- Brug 4-måneders gamle kvindelige Fisher 344 rotter (BW ~ 150-180 g) til studiet.
2. ultralyd Imaging før IR kirurgi
- Bedøvelses rotten med isofluran-induktions kammeret ved 5% med 1,5 – 2,0 l/min o2 flow efterfulgt af 1,5 – 2,0% med 1,5 – 2,0 l/min o2 flow. Denne anæstesi opretholdes i hele eksperimentet, under hvile og stress faser.
- Placer dyret i liggende stilling og barberer thorax. Hold kropstemperaturen ved 37-38 °C ved hjælp af den indbyggede opvarmnings platform. Overvåg puls ved hjælp af softwaren.
Bemærk: ordentlig anæstesi er afgørende for at opretholde hjertefrekvensen ved normale fysiologiske rater (mellem 295-350 beats/min). - Påfør oftalmisk dyrlæge salve for at forhindre tørhed af øjne forud for billeddannelse.
- Udfør ekkokardiografi ved hjælp af 13 – 24 MHz lineær sonde (f. eks. MS250) (figur 1a).
- Anbring dyret i liggende position på den opvarmede platform. Sørg for, at anæstesi styres via næse keglen. Placer derefter sonden for at opnå den parasteri kort akse visning (PSAX) ved hjælp af skinnesystemet (figur 1b).
- Ved at flytte sonden i den rostrale retning fra PSAX, lokalisere lungearterien (figur 1b).
- Bevæg sonden lidt i retningen caudal fra lungearterien for at se drengen og gemme billedet.
Bemærk: drengen er svært at finde uden farve Doppler, så B-mode billeder af drengen er ikke altid muligt. - Når individuelle forskelle gør det vanskeligt at finde drengen koronararterie, Følg den teknik, der er nævnt nedenfor:
- Flyt sonden lateral til lungearterien.
- Vinkel platformen, så dyret er tilbøjelig, inverteret, eller lidt mod højre side, så den venstre ventrikel er mere let synlig med sonden.
- Når billedet i B-tilstand er fanget eller Cine-lagret, klik på farve Doppler på den berøringsfølsomme skærm (figur 1c). Visualiser koronararterie (hvid pil indikerer dreng) på den korte akse (figur 1c). Den røde farve, som det ses i realtid, indikerer retningen af strømmen (dvs. blodgennemstrømningen er mod sonden).
- Når du har visualiserer LAD i en farve-Doppler-tilstand, skal du ændre tilstanden til Pulse Wave -tilstanden (PW). Se efter tilstedeværelsen af en gul-indikatorlinje på koronararterie (figur 2a).
- Placer den gule PW-linje i midten af koronararterie. Sørg for, at vinklen er parallel med strømningsretningen.
Bemærk: hastigheden af flowet er meget afhængig af vinklen på PW-linjen, så sørg for at matche vinklen på skærmen sonde med vinklen af drengen. Brug den berøringsfølsomme skærm til at justere vinklen. PW-vinklen skal være mindre end 60 °. - Brug Cine store til at fange hastigheden af hvile Lad koronar flow på Peak diastole som bølgeformer (figur 2b).
- Efter opnåelse af hvile LAD flowhastighed, måle den maksimale flowhastighed af dreng under stress at beregne CFR. For at måle den maksimale strømningshastighed under stress, indgyde Dobutamin i en dosis på 20 μg/kg/min via hale vene8 (figur 2c).
Bemærk: Dobutamininfusion bør ikke være mere end 8 min. Brug en infusionspumpe, og Indstil diameteren af infusionspumpen til 14,43 for BD 10 mL-sprøjten.- Brug 25-G infusion Butterfly sæt til hale vene kanylering. For at placere infusions nålen skal du placere en lille stribe gaze rundt om bunden af rotte halen, derefter grab med produkter og sno tourniquet for at anvende tryk og få venen til at forstørre.
- Placer nålen, mens den er direkte forbundet med Dobutaminsprøjten.
Bemærk: Vær ekstra forsigtig med ikke utilsigtet at introducere lægemiddel, når du udarbejder blod for at sikre korrekt placering af nålen i halen vene. Sørg også for at undgå at introducere en luftboble i venen, da en emboli kan være dødelig for dyret. - Når nålen er placeret, stabilisere det med en lim og et stykke kirurgisk tape, sikring af infusions linjen til halen.
- Fjern produkter og tourniquet at inddrive strømmen.
- Anbring Dobutamin-sprøjten i infusionspumpen, og sæt den til at injicere 20 μg/kg/min.
- Under infusion af Dobutamin, nøje overvåge dreng peak og puls. Periodisk rekord LAD PW toppe i Doppler mode, især når det stiger som reaktion på Dobutamin.
Bemærk: stress udfordringen induceret af Dobutamin får hjertet til at arbejde hårdere; Dette resulterer ofte i bevægelsen af hjertet og drengen. Vær forberedt på at flytte dyret, sonden, eller begge dele for at holde drengen i betragtning. - Efter dreng toppe og hjertefrekvens har plateaued under udfordringen, stoppe Dobutamin infusion, fjerne hale vene infusion sæt og fjerne dyret fra platformen. Lad dyret komme sig i sit hjem bur.
- Vælg peak vel Tool for at opnå peak diastoliske hastigheden fra billederne vist i figur 2b og C.
- Beregn CFR-indekset som forholdet mellem LAD stress (Dobutamin) peak diastolisk strømningshastighed til hvile LAD peak diastoliske strømningshastighed (figur 2a).
3. ischemia reperfusion skade
- Anesthetize rat med isofluran-induktions kammer ved 5% med 1,5-2,0 l/min o2 flow efterfulgt af 1,5 – 2,0% med 1,5 – 2,0 l/min o2 flow.
- Bekræft dybden af anæstesi ved manglende pedal tilbagetræknings refleks. Brug oftalmisk dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed. Oprethold den korrekte kropstemperatur på 37-38 °C ved hjælp af en varmepude eller en dyre temperaturregulator.
- Prækirurgisk meloxicam, 5 mg/kg intramuskulært, 15 min før operationen, efterfulgt af 2 mL subkutan bolt på 0,9% saltvand for at forhindre dehydrering under operationen. Sterile handsker og instrumenter blev brugt, og der blev anvendt aseptiske teknikker. Ved hjælp af fiber-optisk lyskilde, intubate rotte ved hjælp af 18-gauge IV kateter og Tilslut til ventilatoren.
- Ligate LAD ved hjælp af 8-0 Monofilament sutur gennem 15 mm åbning på 5th interkostale rum. Binde en almindelig knude og lad i 30 min. visuelt bekræfte iskæmi i alle rotter via misfarvning af hjerte overfladen12. Slip ligatur efter 30 min og bekræft reperfusion ved rødmen af det tidligere misfarvede område af hjertemusklen i 1-2 min12.
- Luk ribburet med 4-0 absorberbare sutur med et afbrudt sutur mønster, og luk derefter huden med 5-0 ikke-absorberbare silke sutur med kontinuerlig sutur mønster.
- Tag dyret ud af anæstesi. Lad dyret komme sig i hjem buret. 5mg/kg meloxicam blev injiceret intramuskulær i hver 24 timer før euthanizing dyret (72timer efter operationen).
4. ultralyd Imaging efter IR kirurgi
- 72 h efter IR-kirurgi måles koronarflowet og CFR igen. Sammenlign målingerne med de infrarøde målinger. Gentag trin 2,1 til 2,15 som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til denne undersøgelse, vi brugte 12 kvindelige Fisher 344 rotter. Vi udførte en stresstest med Dobutamin og målte LAD koronararterie hastigheden før og 72 timer efter den infrarøde kirurgi. Før den infrarøde operation blev hvile LAD koronararterie hastighed målt som 423 ± 59 mm/s, hvilket blev forøget efter infusion af Dobutamin (1005 ± 77mm/s) (figur 3a). Efter 72 h af iskæmi reperfusion, hvilende Lad koronararterie hastighed var signifikant højere sammenlignet med hvile dreng koronararterie hastighed før IR kirurgi (743 ± 40mm/s vs 423 ± 59 mm/s) (figur 3a). Stress respons på Dobutamin-testen efter den infrarøde operation blev signifikant reduceret sammenlignet med respons før IR-kirurgi (937 ± 67ms/s vs 1005 ± 77mm/s) (figur 3a).
CFR beregnes som forholdet mellem spids strømningshastigheden under stress (Dobutamin) og hvile strømningshastigheden (målt før infusion af Dobutamin)8. CFR var 2,1 ± 0,35 hos unge rotter før den infrarøde operation (figur 3b), men signifikant reduceret (1,1 ± 0,25) efter 72 h af den infrarøde operation, selv om hvile drengen koronararterie hastighed var højere i disse rotter sammenlignet med data opnået før IR kirurgi ( Figur 3C). Desuden var der ingen signifikante ændringer i den systoliske funktion af venstre ventrikel i rotter efter 72 h af den infrarøde operation (figur 3c).
Figur 1: placering af koronararterie. A. Probe position på rotter, mens opnåelse af Lad koronararterie hastighed. B. kort akse anatomisk repræsentation af lungearterien, aorta, og lad koronararterie. C. anatomisk VISUALISERING af Lad koronararterie på ekkokardiografi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: puls bølge hastighed billeddannelse af drengen koronararterie. A. repræsentation af puls bølge hastighedssensor placering på dreng koronararterie. B. Lad koronararterie puls bølge billede under hviletilstand. C. Lad koronararterie puls bølge billede under stress (Dobutamin) tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Måling af koronar strømmen ved hjælp af Doppler ekkokardiografi. A. impuls bølge hastighed målt i kontrol under resten (fortsat) og under dobutamininfusion (fortsat) og i dyr efter 72 h af IR kirurgi i resten (IR B) og under Dobutamin Challenge (IR D), p < 0,05 CONT b vs. iskæmi reperfusion B (*). B. CFR blev beregnet ud fra puls bølge i forsøgsdyr (n = 9), p ≪ 0,05 CONT vs. IR (*). C. vurdering af fraktioneret forkortelse fra forsøgsgrupperne (n = 9). Data præsenteres som Mean ± SD, analyseret med envejs-ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vigtigste resultater fra denne undersøgelse er, at IR øger hvile LAD koronararterie hastighed og svækker CFR, selv i fravær af nogen resterende Angiografisk stenose.
Forståelse af koronar fysiologi er en væsentlig del af den kliniske beslutningstagning for kardiologer til behandling af koronararteriesygdom. CFR er en af de vigtige funktionelle parametre i forståelsen af patofysiologien af koronar mikrocirkulationen7,13. CFR er en ikke-invasiv metode til at vurdere både koronararterie stenose og koronar microvaskulær cirkulation og er en indikator for myokardial blodtilførsel, eksplicit evnen af kronerne til at øge blodgennemstrømningen under stress betingelser7. En normal CFR (>2,0) afspejler ofte en god prognose, mens CFR mindre end 1,90 giver trinvis diagnostisk information til identifikation af højrisiko koronararteriesygdom14,15,16.
Vores resultater viser, at selv om den systoliske funktion blev bevaret efter iskæmi reperfusion (figur 3c), var CFR signifikant lavere (figur 3b). Således,, at de stenotiske koronararterier ikke forbedrer mikrovaskulær perfusion. Nedsat CFR muliggør påvisning af nedsat mikrovaskulær vasodilatation efter iskæmi reperfusion.
Denne undersøgelse viser de serielle CFR evalueringer til at undersøge effekten af forskellige farmakologiske behandlinger ved hjælp af ikke-invasiv transthoracic Doppler ekkokardiografi. Denne metode til koronar funktionel vurdering kan anvendes i små dyr forskning som en gennemførlig og levedygtig klinisk diagnostisk værktøj. Dette vil føre til minimering af kravet om anvendelse af dyr, eutanasi eller nekropsy i de små dyremodeller. Kritiske trin i denne protokol er at visualisere koronararterie og opnå PW Velocity billeder af god kvalitet. Et andet kritisk skridt er at opretholde LAD visualisering under stress tilstand. Under Dobutamin Challenge, pulsen stiger og drengen kan bevæge sig fra synsfeltet; Forskerne bør være parat til at flytte feltet for at følge koronararterie. Begrænsningerne i den nuværende undersøgelse omfatter den relativt lille stikprøvestørrelse, den manglende korrelation mellem CFR og koronararterie lumen diameter in vivo hos rotter, på grund af vanskeligheden med at opnå nøjagtig visualisering til størrelses måling af Koronararterie. Men de metoder, der er beskrevet her, er pålidelige, reproducerbare, og giver indsigtsfulde oplysninger om skaden påført hjertets mikrovaskulatur efter iskæmi reperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Helmsley Foundation for at levere ultralyd udstyr til at udføre vores eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af NIA R01 053585 Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion. Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).
- Marzilli, M., Mariani, M. Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size. Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, 40s-42s (2001).
- Prasad, A., Gersh, B. J. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).
- Ishihara, M., et al. Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction. British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).
- Camici, P. G., d'Amati, G., Rimoldi, O. Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment. Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).
- Chung, K. S., Nguyen, P. K. Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic. Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).
- Kelm, N. Q., et al. Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age. PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).
- Pan, M., et al. Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure. Revista Española de Cardiología. 56 (5), 459-464 (2003).
- Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction. Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health (2011).
- Ciuffreda, M. C., et al. Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain. PloS one. 9 (4), e95913-e95913 (2014).
- van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure. European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).
- Naya, M., et al. Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).
- Cortigiani, L., et al. Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery. Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease. Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).
