Summary
Præsenteret her er en protokol til at udføre tid-og rum-begrænset gen knock-out i Axolotler rygmarvs ledninger ved at injicere CAS9-gRNA kompleks i rygmarven central kanalen efterfulgt af elektro poration.
Abstract
Axolotler har den unikke evne til at regenerere rygmarven fuldt ud. Dette skyldes i høj grad de ependymale celler forbliver som neurale stamceller (NSCs) gennem hele livet, som formere sig til at reformere ependymal røret og differentiere i tabte neuroner efter rygmarvsskade. Dechifrere hvordan disse NSCs bevarer pluristyrke efter udvikling og formere sig på rygmarvsskade at reformere den nøjagtige præ-skade struktur kan give værdifuld indsigt i, hvordan pattedyrs rygmarv kan regenerere samt potentielle behandlingsmuligheder. Udførelse af gen-Knock-outs i specifikke undergrupper af nscs inden for en begrænset tidsperiode vil gøre det muligt at studere de molekylære mekanismer bag disse regenerativ processer uden at blive forvirret af udviklingsmæssige forstyrrelser. Beskrevet her er en metode til at udføre gen knock-out i Axolotler rygmarven NSCs ved hjælp af CRISPR-Cas9 systemet. Ved at injicere CAS9-gRNA-komplekset ind i rygmarven central kanalen efterfulgt af elektroporation, er målgener slået ud i NSCs inden for specifikke områder af rygmarven på et ønsket tidspunkt, hvilket giver mulighed for molekylære undersøgelser af rygmarvs NSCs under Regenerering.
Introduction
Rygmarven fra de fleste hvirveldyr er ikke i stand til at regenerere efter skade, hvilket fører til permanent invaliditet. Flere salamanders, såsom Axolotl, er bemærkelsesværdige undtagelser. Axolotler kan helt regenerere en strukturelt identisk rygmarv og helt genoprette rygmarv funktion. Meget af den regenerativ evne af Axolotler rygmarven skyldes ependymale celler. Disse celler linje den centrale kanal, og i modsætning til dem i pattedyr, Axolotler ependymale celler forbliver som neurale stamceller (NSCs) post-embryonale udvikling. Efter rygmarvsskade (f. eks. fra en hale amputation), disse nscs formere sig at regrow ependymal røret og differentiere for at erstatte tabte neuroner1,2,3. Afdækning af, hvordan Axolotler rygmarven NSCs forbliver pluripotente og aktiveres efter skade kan give værdifulde oplysninger om udvikling af nye terapeutiske strategier for humane patienter.
På grund af fremskridt i crispr-Cas9-genet knock-out-teknikken er det blevet lettere at udføre Knock-outs for at dechifrere genfunktionen, og det har vist sig at have bred anvendelighed i forskellige arter, herunder kendt4,5, 6 , 7 , 8. den nylige frigivelse af det fulde Axolotler genom og transkriptomet gør det nu muligt at målrette en eventuel genomlocus og for bedre at kunne vurdere de off-Target effekter9,10,11,12 , 13 , 14. optimerede protokoller er udviklet til knock-out og Knock-in i kendt ved hjælp af crispr-Cas9 system15. Levering af crispr-Cas9 maskiner i form af Cas9 protein-grna ribonucleoprotein (RNP) har vist sig at være mere effektiv end at bruge Cas9 og grna-kodning plasmider4. Dette skyldes sandsynligvis, at RNP er mindre i størrelse end plasmid vektorer, dens evne til at skabe DNA bryder straks, og beskyttelse af gRNA fra RNA nedbrydning. Desuden ved hjælp af RNPs omgår transskription og oversættelse; således, det undgår spørgsmål som promotor styrke og optimal codon skik, når plasmid elementer er afledt af en anden art.
Tab af funktionsundersøgelser er en af de generelle tilgange til at undersøge potentielle funktioner af gener af interesse. For at studere gen funktion under regenerering, en knock-out bør ideelt set udføres lige før en skade for at undgå virkninger på udviklingen. Desuden bør knock-out være begrænset til både NSCs og region for regenerering. En knock-out af målgenet i alle NSCs (herunder dem i hjernen, som er tilfældet i CRE-LoxP-systemer), kan producere effekter ikke relateret til regenerering, der kan tolerere fortolkningen af resultater. Heldigvis giver strukturen af Axolotler rygmarven en unik mulighed for tid-og plads begrænset knock-out i NSCs. De fleste af rygmarven nscs er i kontakt med den centrale kanal og udgør langt størstedelen af cellerne i kontakt med den centrale kanal16,17. Derfor, en injektion af CAS9-grna kompleks i den centrale kanal, efterfulgt af elektro poration, giver mulighed for levering til rygmarvs nscs i en ønsket region på et bestemt tidspunkt4,18,19. Denne protokol viser, hvordan dette udføres, hvilket fører til stærkt penetrateret knock-out i de målrettede rygmarvs NSCs. efterfølgende analyse udføres derefter for at studere virkningerne på regenerering og NSC adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg skal gennemføres i overensstemmelse med lokale og nationale bestemmelser om dyreforsøg og med godkendelse fra det relevante institutions revisionsudvalg.
1. klargøring af CAS9-gRNA RNP mix
- Design og syntetisere gRNAs.
Bemærk: Se andre publikationer for at designe og syntetisere grnas, herunder en udelukkende vedrørende kendt15,20,21,22. - Få CAS9-NLS protein ved at forberede in-House eller købe det kommercielt.
- Forbered CAS9-gRNA mix ved at blande 5 μg CAS9-NLS protein, 4 μg gRNA, 0,9 μL 10x CAS9 buffer, og fyldvolumen op til 10 μL med nuclease-fri H2O. aliquot blandingen og opbevar ved-80 °c, hvis den ikke anvendes med det samme.
2. klargøring af agrose plader til elektro portering
- Forbered 200 mL af 2% (WT/vol) agopstået opløsning i 1x DPBS. Opløses ved opvarmning af opløsningen i en mikrobølgeovn og hældes den på 10 cm Petri skåle til en dybde på ca. 10 mm (dyb nok til at dække hele dyret).
- Lad pladerne størkne ved stuetemperatur. Opbevar pladerne ved 4 °C, hvis de ikke anvendes med det samme.
- Ved hjælp af kirurgiske Scalpels, skær agstaden pladen for at gøre en slids for at holde halen lige, en brønd til montering i dyrets krop og to ekstra brønde til anbringelse af elektroderne (figur 1E).
- Placer pladen på is og fyld den op til randen med iskold 1x DPBS. Brug den samme DPBS-løsning til at lave pladerne for at sikre ensartet elektrisk ledning i set-up.
3. Konfigurering af elektro poratoren
- Konfigurér elektro poratoren. Indstil Poring Pulse til at bestå af en bipolær puls på 70 V, med en varighed på 5 MS, interval på 50 MS, og ingen spænding forfald. Indstil overførsels pulsen til at have fire bipolære impulser på 40 V, med en varighed på 50 MS, interval på 999 MS og 10% spændings forfald.
- Tilslut elektroderne til elektro poratoren og Juster pincet til at være 7 mm fra hinanden. Under Sænk elektroderne i et bæger af DPBS før og i mellem elektroporation.
4. klargøring og lastning mikroinjektion glas kapillærer
- Udfør en rampe test på en flammende/brun mikropipette aftrækker som pr. fabrikantens anvisninger til bestemmelse af varmeværdien.
- Pull injektion kapillærer med koniske ender ved hjælp af følgende parametre: Heat = rampe test værdi, pull = 100, Velocity = 100, tid = 100.
- Overhold nålen under et stereomicroskop. Brug fine pincet, bryd kapillær i en vinkel, så det har en skrå spids. Bryd i en position, hvor den er tynd nok til at målrette den centrale kanal, samtidig med at den er stærk nok til at gennembore huden.
Bemærk: det punkt, hvor diameteren er på omkring 20 μm eller omkring 50% af diameteren af rygmarven er et godt udgangspunkt. Der kan være behov for flere forsøg for at opnå optimal brydning. - Tilsæt hurtig grøn FCF-opløsning til RNP-blandingen i et forhold på 1:30, og Indlæs ca. 5 μL injektions blanding i kapillar med en pipettespids til Mikrolæsser.
- Monter kapillær på pneumatisk pumpe, med skrå spids vendt nedad.
5. Konfigurering af pneumatisk pumpe
- Indstil pneumatisk pumpe. Indstil hold til 0,5 pounds per kvadrat inch (PSI), skubbe til 2 PSI hold, og varighed til gated.
- Test kapillær og pneumatisk pumpe indstillinger ved at dyppe kapillær i en dråbe vand og trykke på fodpedalen for at injicere. Sørg for, at injektions blandingen kommer ud i en langsom, men stabil strøm.
- Juster hold trykket, hvis injektions blandingen begynder at lække spontant, eller der suges vand op i kapillær. Forøg udslyngning tryk eller bryde mere af kapillær hvis injektion mix kommer ud for langsomt. Reducer udslyngning, hvis injektionen kommer for hurtigt ud.
6. injektion af RNP blandes i rygmarven
- Anesthetize kendt i 0,03% benzocain opløsning i mindst 10 min. Kontroller, at dyrene ikke reagerer ved at vende dem på hovedet i vandet.
- Afhente et dyr med ring tang og lægge det på en seng af silicium, med den venstre side af dyret vender opad og halen peger mod højre. Placer injektionsstedet midt i synsfeltet for stereomikroskopet (figur 1A).
- Juster micromanipulatoren, så kapillær kommer ind ved 60 ° fra højre side af synsfeltet (figur 1B).
- Identificer rygmarven og central kanalen (figur 1C).
Bemærk: rygmarven er den rørformede struktur over notochord. - Sigter mod den centrale kanal, flytte kapillar frem til forsigtigt gennembore huden og muskler i den centrale kanal af rygmarven. Begræns bevægelsen af kapillar til små trin, da rygmarven er lige under hale musklerne.
- Tryk på fodpedalen, og hold den nede for at injicere blandingen ind i den centrale kanal. Bemærk, om RNP-blandingen spredes langs den centrale kanal som en blå linje i begge retninger, hvilket viser, at kapillær er korrekt placeret (figur 1D).
- Hvis dette ikke sker, skal du holde fodpedalen trykket ned, mens du flytter kapillar en anelse ind og ud, indtil RNP-blandingen begynder at gå i gang. Hvis kapillær bliver tilstoppet af væv, klare det ved at skubbe i vand ved højere tryk.
- Juster udslyngning pres, så det er lige nok til at forårsage RNP mix til at sprede sig i den centrale kanal, men ikke så meget, at det blæser op strukturen.
- Fortsæt med at holde fodpedalen nede, så injektions blandingen spredes yderligere langs den centrale kanal, indtil den når Terminal vesikelprotein for enden af rygmarven og ventriklerne i hjernen.
Bemærk: Dette kan tage op til 2 min afhængigt af dyrets størrelse. Det kan være nødvendigt at øge trykket efter et stykke tid at forårsage RNP mix at komme ind i hjernens ventrikler. - Fortsæt så hurtigt som muligt til elektro portering efter en vellykket injektion.
7. Elektro portering
- Dyret overføres med en ring Tang på den forberedte elektroporationplade (figur 1E) på is. Placer halen inde i slids, så det er klemt af agopstået (figur 1F).
- Placer elektroderne i brøndene på begge sider af halen. Sørg for, at hele dyret og elektroderne er dækket af iskold PBS.
- Tryk på fodkontakten for at starte elektroporationen.
- Når elektro portering er gennemført, returneres dyret til vand.
- Fortsæt med at injicere flere dyr, hvis det er nødvendigt.
- Kontroller, at de elektro porterede dyr er sunde efter anæstesi slidt og at der ikke er nogen skade på halen.
8. vurdering af knock-out effektivitet
- Fastgør halen af det elektro porterede dyr. Lav tværsnit af halen efterfulgt af immun Histokemisk farvning for at vurdere effektiviteten af knock-out på Proteinniveau.
Bemærk: Hvis der skal udføres en amputation af halen efter elektroporation, kan den afskårne hale anvendes til dette formål. Dyr, der er elektroporeret med gRNAs mod Gfp eller tyrosinase, kan for eksempel anvendes som en negativ kontrol4. - Alternativt kan den elektro porterede rygmarv ekstraheres og lyseres for DNA. Udfør genotypebestemmelse PCR efterfulgt af sanger sekvensering eller næste generations sekvensering for at vurdere procentdelen af redigeret genetisk loci15.
Bemærk: den resulterende redigering effektivitet vil undervurdere den faktiske redigering effektivitet for NSCs, på grund af inddragelsen af ikke-elektro porerede celler og neuroner, der mangler apisk kontakt til det centrale lumen og dermed vil ikke modtage RNP mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektion og elektroporation af CAS9-gRNA kompleks mod Sox2 i Axolotler rygmarven central Canal førte til et massivt tab af Sox2 immunoreaktivitet i et flertal af rygmarven nscs, med grna mod tyrosinase (tyr) som en kontrol (figur 2 A). B3-Tubulin (plettet med TUJ1) er en markør for neuroner og blev ikke udtrykt i nscs, og SOX2-TUJ1-celler omkring Central kanalen blev anset for at være celler husly SOX2 sletninger. Kvantificering viste Sox2 knock-out i et betydeligt antal nscs ved CAS9-Sox2-grna elektroporation (figur 2B), hvilket indikerer, at denne metode førte til effektiv og stærkt gennemtrængende gen knock-out i rygmarven nscs.
Efter samtidig injektion og elektroporation, blandingen af to CAS9-grna komplekser mod Sox2 og gfp, henholdsvis til transgene kendt med allestedsnærværende gfp udtryk (caggs-gfp), en høj procentdel af dobbelt knock-out nscs blev observeret (figur 2C, D), hvilket indikerer, at protokollen kan bruges til fleksibelt knock-out flere gener.
Figur 1 : Axolotl rygmarvs injektion og elektroporation. (A) skematisk viser injektion af CAS9-GRNA RNP i Axolotler rygmarven central Canal. B) micromanipulator set-up til injektion. C) Se gennem en stereomicroskop af Axolotler halen, med rygmarven angivet. D) Se gennem et stereomicroskop af Axolotler-halen med en injiceret rygmarv. (E) skematisk af elektroporations pladen. F) skematisk af dyret og elektroderne anbragt inde i elektroporations pladen, klar til elektro portering. Skala stænger = 1 mm. Dette tal er tilpasset fra Albors og Tanaka18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative knock-out resultater i Axolotler rygmarven NSCs. (A) rygmarv injektion og elektroporation af CAS9-Sox2-grna (n = 21) førte til tab af Sox2 i de fleste nscs ved 15 dage efter elektro portering (DPE) ved immun Histokemisk farvning. CAS9-tyr-grna (n = 21) fungerede som en negativ kontrol. Skala stænger = 100 μm. (B) kvantificeringen viste signifikant reduktion i SOX2 + nscs (p < 0,001 af elevens t-test), hvor SOX2-TUJ1-celler omkring Central kanalen blev medregnet, da nscs harkedeligt en SOX2 sletning. Fejllinjer = SD. (C) samtidig injektion og elektroporation af Sox2-grna og gfp-grna koblet til CAS9 (n = 6) førte til tab af Sox2 og Gfp i de fleste nscs ved immun Histokemisk farvning. CAS9-tyr-grna (n = 6) fungerer som negativ kontrol. Skala stænger = 100 μm. D) kvantificeringen viste, at et flertal (94%) blandt alle målrettede nscs, der havde slettet næret dobbelt sletning (gfp − SOX2 −), med kun en lille andel (6%) med enkelt sletning (GFP + SOX-eller GFP-SOX2 +). Dette tal er tilpasset fra Fei et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol giver tid og plads begrænset gen knock-out i NSCs i Axolotler rygmarven. Den nuværende protokol tillader specifik målretning af NSCs på et defineret tidspunkt og sted med høj penetrans. Det undgår potentielle uønskede virkninger fra gen knock-out i NSCs i andre regioner såsom hjernen, der opstår, når du bruger CRE-LoxP-systemet. Det undgår også udviklingsmæssige virkninger, der stammer fra en vedvarende knock-out, så studiet af genfunktion fokuseret på regenerering. Desuden kan denne protokol udføres i vilde-type dyr, undgå den lange ventetid er nødvendig for at generere yderligere transgene axolotls, som er nødvendig for CRE-LoxP-systemet. Det giver også alsidighed til at knock-out flere gener samtidigt og er meget gennemtrængende, så eksperimenter kan udføres på F0 dyr. Det er vigtigt, at proceduren ikke har nogen observerbare virkninger på hale-og rygmarven regenerering4.
Brugen af CAS9 protein-grna RNP komplekser viser også meget højere effektivitet end systemer ved hjælp af CAS9 og grna-udtrykker plasmider4. Dette er sandsynligvis på grund af mindre størrelse af RNP kompleks sammenlignet med plasmider, samt differential codon skik påvirker ekspression af CAS9 protein fra plasmider stammer fra pattedyr systemer. Desuden, da CAS9 protein-gRNA RNP komplekser kan fremkalde pauser straks, knock-out opstår hurtigt. 60%-70% af modificeret genomloci er blevet observeret ved genotypebestemmelse PCR inden for 24 timer af elektro portering (data ikke vist). Der er også en mulighed for at udføre Knock-ins ved hjælp af denne strategi ved co-electroporating en reparation skabelon. Der findes en række afsmittende strategier, hvis detaljer og overvejelser ikke er omfattet af denne publikation, men de er beskrevet i detaljer i en anden publikation15.
På den anden side har denne protokol et par begrænsninger. Farvning eller genotypebestemmelse PCR er generelt nødvendig for at vurdere omfanget af knock-out i hvert forsøgsdyr, som kan være omstændelig. Mens gen knock-out fra denne metode er stort set begrænset til NSCs omkring den centrale kanal, kan det ikke udelukkes, at andre celletyper også kunne målrettes, fordi 1) de er også i kontakt med den centrale kanal, eller 2) RNP mix er sluppet ud af CEN mellem kanalen før elektroporation. Disse faktorer bør tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne.
gRNA design
Med den nyligt offentliggjorte Axolotler genom og transcriptome er det blevet meget nemmere at identificere Axolotler gener og deres sekvenser,9, 10,11,12,13. Detaljerede vejledninger i design af grnas er beskrevet andetsteds, herunder en, der udelukkende beskæftiger sig med kendt15. Det tilrådes at designe og teste mindst tre gRNAs til redigering effektivitet på forhånd og at vælge det optimale design for det faktiske eksperiment. Effektiviteten af gRNA kan testes ved at injicere CAS9-gRNA mix i nylagte Axolotler æg i en-celle etape23. Redigering effektivitet kan derefter vurderes ved genotypebestemmelse den udklækkede larver.
Overvejelser ved injektion
Siden injektionsstedet af rygmarven lider af fysiske skader forårsaget af nålen og spredning af RNP mix til væv uden for central kanalen, er det vigtigt at udføre injektionen på positioner væk fra den region af interesse, der skal analyseres. For eksempel, hvis en hale amputation udføres efter elektroporation at studere virkningerne af et målrettet gen i rygmarven regenerering, er det nødvendigt at udføre injektionen, hvor stedet vil blive fjernet ved amputation.
Indtastning af central kanalen med en injektion kapillar er det mest kritiske trin i denne protokol, og nye brugere rådes til at øve før det egentlige eksperiment. Injektion udføres bedst på mindre dyr (mindre end 2,5 cm lang) ved den bageste ende af rygmarven, hvor det er lettest at placere kapillar spidsen i den centrale kanal. Det tilrådes at observere den oprindelige spredning af den blåfarvede RNP mix nøje. Der er mulighed for, at RNP mix kan injiceres i meningeal rummet omkring rygmarven. En skarp og hurtig spredning som en linje langs midten af rygmarven indikerer vellykket injektion i den centrale kanal18. Hvis der ikke er nogen udgange eller spredningen stopper for tidligt, anbefales det at holde fodpedalen trykket ned, mens kapillær flyttes lidt ind og ud. Hvis dette ikke lykkes, kan det være nødvendigt at flytte kapillær igen eller kontrollere, om der er en tilstoppet åbning. For RNP mix til at sprede sig ind i hjernens ventrikler, er det ofte nødvendigt at øge udslyngning pres mod slutningen. At have hjernen ventrikler fyldt op er ikke nødvendigt for elektroporation af rygmarven, men det er den bedste indikation af, at RNP mix er blevet injiceret i den centrale kanal.
Overvejelser i forbindelse med elektro portering
Det tilrådes at optimere elektro portering parametre på forhånd for at opnå tilstrækkelig levering af RNP til et flertal af NSCs uden at forårsage omfattende skader på andre væv eller dræbe dyret. Denne protokol er blevet optimeret til dyr 2,0-2,5 cm lang i størrelse18. En reduktion i overførsels impuls spændingen til 35 V er sandsynligvis nødvendig, når der arbejdes med dyr, der er mindre end dette. På den anden side, større dyr vil kræve højere spænding og/eller flere pulser. Desuden påvirker afstanden mellem elektroderne effektiviteten. Det kan være nødvendigt at reducere afstanden til 6 mm for større dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Elly M. Tanaka for hendes vedvarende og langsigtede støtte. Dette arbejde blev støttet af en National Natural Science Foundation of China (NSFC) Grant (317716), forskning starter tilskud fra South China Normal University (S82111 og 8S0109), og en China postdoc Science Foundation Grant (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
