Summary
Представлено здесь протокол для выполнения времени и пространства ограниченного гена нокаут в аксолотль спинного мозга путем введения CAS9-gRNA комплекса в спинной мозг центрального канала с последующим электропорированием.
Abstract
Аксолотль обладает уникальной способностью полностью регенерировать спинной мозг. Это в значительной степени из-за эпендимальных клеток, оставшихся в качестве нервных стволовых клеток (НСК) на протяжении всей жизни, которые распространяются на реформу эпендимальной трубки и дифференцироваться в потерянные нейроны после травмы спинного мозга. Расшифровка, как эти NSCs сохранить плюрипотентность после развития и размножаться на повреждение спинного мозга для реформирования точной структуры до травмы может обеспечить ценную информацию о том, как млекопитающих спинного мозга может регенерировать, а также потенциальные варианты лечения. Выполнение генных нокаутов в конкретных подмножествах НСК в течение ограниченного периода времени позволит изучать молекулярные механизмы, стоящие за этими регенеративными процессами, не будучи сбит с толку эффектами, возмущающимися развитием. Описано здесь метод для выполнения гена нокаут в аксолоттный спинной мозг NSCs с помощью системы CRISPR-Cas9. Путем впрыскивать комплекс CAS9-gRNA в центральный канал спинного мозга последованного за электропорированием, гены цели постучаны вне в NSCs внутри специфически зоны спинного мозга на познаваемое timepoint, позволяющ для молекулярных изучений NSCs спинного мозга во время Регенерации.
Introduction
Спинной мозг большинства позвоночных не может регенерировать после травмы, что приводит к постоянной инвалидности. Некоторые саламандры, такие как аксолотль, являются заметными исключениями. Аксолотл может полностью регенерировать структурно идентичный спинной мозг и полностью восстановить функцию спинного мозга. Большая часть регенеративной способности аксолотов огорожения обусловлена эпендимальными клетками. Эти клетки выстраивались в линию центрального канала, и в отличие от клеток млекопитающих, аксолотальные эпендимальные клетки остаются в виде нервных стволовых клеток (НСК) после эмбрионального развития. После травмы спинного мозга (например, от ампутации хвоста), эти NSCs размножаться, чтобы вырастить эпендимальной трубки и дифференцировать, чтобы заменить потерянные нейроны1,2,3. Раскрытие того, как аксолотл спинного мозга NSCs остаются плюрипотентными и активировать после травмы может предоставить ценную информацию о разработке новых терапевтических стратегий для пациентов.
В связи с достижениями в CRISPR-Cas9 ген нокаут техники, выполнение нокаутов, чтобы расшифровать функцию гена стало легче и было показано, что широкое применимость в различных видах, в том числе аксолотлы4,5, 6 , 7 (г. , 8. Недавний выпуск полного генома аксолоцла и транскриптома теперь позволяет любой геномный локус быть мишенью и для лучшей оценки вне целевых эффектов9,10,11,12 , 13 Год , 14. Разработаны оптимизированные протоколы для нокаута и стука в аксолотах с использованием системы CRISPR-Cas915. Доставка оборудования CRISPR-Cas9 в виде циноворенного рибонуклеопротеина CAS9 (РНП) оказалась более эффективной, чем использование плазмид Cas9 и gRNA-encoding4. Это, вероятно, из-за RNP быть меньше по размеру, чем плазмидные векторы, его способность создавать ДНК перерывы немедленно, и защита гРНК от деградации РНК. Кроме того, использование RNPs обходит транскрипцию и перевод; Таким образом, он избегает таких вопросов, как прочность промотора и оптимальное использование кодона, когда плазмидные элементы являются производными от различных видов.
Исследования потери функций являются одним из общих подходов к изучению потенциальных функций генов, представляющих интерес. Для того, чтобы изучить функцию генов во время регенерации, нокаут в идеале должны быть выполнены непосредственно перед травмой, чтобы избежать воздействия на развитие. Кроме того, выбивка должна быть ограничена как НСК, так и областью регенерации. Выбив из целевого гена во всех NSCs (в том числе в головном мозге, что имеет место в системах Cre-LoxP), может производить эффекты, не связанные с регенерацией, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. К счастью, структура аксолотового спинного мозга предоставляет уникальную возможность для времени и ограниченного пространства нокаутом в НСК. Большинство спинного мозга NSCs находятся в контакте с центральным каналом и составляют подавляющее большинство клеток в контакте с центральным каналом16,17. Таким образом, инъекция комплекса CAS9-gRNA в центральный канал, за которым следует электропорация, позволяет доставлять в спинной мозг НСК в нужном регионе в определенное время4,18,19. Этот протокол демонстрирует, как это выполняется, что приводит к весьма проникающим нокаутом в целевом спинном мозге NSCs. Последующий анализ затем проводится для изучения влияния на регенерацию и поведение НСК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с местными и национальными правилами по экспериментам на животных и с одобрения соответствующего институционального совета по обзору.
1. Подготовка смеси CAS9-gRNA RNP
- Дизайн и синтез гРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к другим публикациям для проектирования и синтеза gRNA, в том числе один исключительно в отношении акстолотлов15,20,21,22. - Получить белок CAS9-NLS, готовя в доме или приобретая его на коммерческой основе.
- Подготовка смесь CAS9-gRNA путем смешивания 5 мкг белка CAS9-NLS, 4 мкг гРНК, 0,9 л 10x буфера CAS9, и заполнить объем до 10 qL с нуклеазой без H2O. Аликот смеси и хранить при -80 градусов по Цельсию, если не использовать сразу.
2. Подготовка агарозных пластин для электропорации
- Приготовьте 200 мл 2% (wt/vol) агарозного раствора в 1x DPBS. Растворите, нагревая раствор в микроволновой печи и вылейте его на 10 см посуды Петри на глубину около 10 мм (достаточно глубоко, чтобы покрыть все животное).
- Разрешить пластины затвердеть при комнатной температуре. Храните тарелки при 4 градусах По цельсию, если они не используются немедленно.
- Используя хирургические скальпели, вырезать агарозную пластину, чтобы сделать щель для проведения хвост прямо, хорошо для установки в теле животного, и два дополнительных скважин для размещения электродов (Рисунок 1E).
- Поместите тарелку на лед и заполните ее до краев ледяной 1x DPBS. Используйте тот же dPBS решение для изготовления пластин для обеспечения последовательной электрической проводимости в настройке.
3. Настройка электропортора
- Нареживаните электропоратор. Настройка пульса для того чтобы consist up одного биполярного пульса 70 V, с продолжительностью 5 ms, интервалом 50 ms, и никаком распаде напряжения. Настройка импульса передачи иметь четыре биполярных импульсов 40 В, с продолжительностью 50 мс, интервал 999 мс, и 10% распада напряжения.
- Подключите электроды к электропореру и отрегулируйте пинцет на части на 7 мм. Погрузите электроды в стакан DPBS до и между электропорированием.
4. Подготовка и загрузка микроинъекционных стеклянных капилляров
- Выполните тест рампы на пылающий / коричневый микропайпот шкив в зависимости от инструкций производителя, чтобы определить тепловую стоимость.
- Вытяните инъекционные капилляры с конические концы, используя следующие параметры: тепло - рампа тестное значение, тянуть 100, скорость - 100, время - 100.
- Наблюдайте за иглой под стереомикроскопом. Используя тонкие щипцы, разорвать капилляр под углом, так что он имеет наклонный кончик. Перерыв в положении, где он достаточно тонкий, чтобы цель центрального канала, будучи достаточно сильным, чтобы проколоть кожу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точка, в которой диаметр составляет около 20 мкм или около 50% от диаметра спинного мозга является хорошей отправной точкой. Несколько попыток могут быть необходимы для получения оптимального нарушения. - Добавьте раствор Fast Green FCF в смесь RNP в соотношении 1:30 и загрузите около 5 кЛ смеси инъекций в капилляр с наконечником пипетки Microloader.
- Установите капилляр на пневматический насос, с наклонной кончик лицом вниз.
5. Настройка пневматического насоса
- Наверстрими пневматический насос. Установите трюм до 0,5 фунтов на квадратный дюйм (пси), выбрасывать до 2 пси провести, и продолжительность закрытого.
- Испытать капиллярные и пневматические настройки насоса путем погружения капилляра в каплю воды и нажатия педали ноги, чтобы впрыснуть. Убедитесь, что инъекционная смесь выходит в медленном, но устойчивом потоке.
- Отрегулируйте давление удержания если смешивание впрыска начинает протекать вне самопроизвольно или вода всасывается вверх по капилляру. Увеличьте давление выброса или сломать больше капилляров, если инъекция смесь выходит слишком медленно. Снижение давления выброса, если инъекция выходит слишком быстро.
6. Инъекция смеси RNP в спинной мозг
- Анестезия аксолотлов в 0,03% бензокаин раствор, по крайней мере 10 мин. Проверьте, что животные не реагируют, переворачивая их вверх дном в воде.
- Возьмите животное с кольцом щипцы и положите его на кровать из кремния, с левой стороны животного вверх и хвост, указывая вправо. Расположите место инъекции в середине поля зрения стереомикроскопа(рисунок 1А).
- Отрегулируйте микроманипулятор так, чтобы капилляр витупил на 60 градусов с правой стороны поля зрения(рисунок 1B).
- Определите спинной мозг и центральный канал(рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг трубчатой структуры выше notochord. - Стремясь к центральному каналу, переместите капилляр вперед, чтобы мягко проколоть кожу и мышцу в центральный канал спинного мозга. Ограничьте движение капилляра небольшими шагами, так как спинной мозг находится прямо под хвостовыми мышцами.
- Нажмите и удерживайте педаль ноги, чтобы придать смесь в центральный канал. Обратите внимание, распространяется ли смесь RNP вдоль центрального канала в виде синей линии в обоих направлениях, что показывает, что капилляр был правильно расположен(рисунок 1D).
- Если этого не происходит, держать педаль ноги нажата при перемещении капилляра немного в и до RNP смесь начинает происходит дюйма Если капилляр засоряется тканью, очистите его, выбрасывая в воду при более высоком давлении.
- Отрегулируйте давление выброса так, чтобы это было достаточно, чтобы вызвать RNP смесь распространяться в центральном канале, но не так много, что он взрывает структуру.
- Продолжайте удерживать педаль ноги, чтобы инъекционная смесь распространяется дальше вдоль центрального канала, пока не достигнет терминала везикулы в конце спинного мозга и желудочков в головном мозге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять до 2 минут в зависимости от размера животного. Это может быть необходимо, чтобы увеличить давление через некоторое время, чтобы вызвать RNP смесь войти в желудочки мозга. - Приступить как можно скорее к электропорации после успешной инъекции.
7. Электропорация
- Перенесите животное с щипцов кольцами на подготовленную агарозную электропорацию пластины(рисунок 1E) на льду. Поместите хвост внутри щели, чтобы он зажат агарозой(рисунок 1F).
- Поместите электроды в колодцы по обе стороны хвоста. Убедитесь, что все животное и электроды покрыты ледяной PBS.
- Нажмите на выключатель ноги, чтобы начать электропорацию.
- После завершения электропорации верните животное в воду.
- При необходимости приступить к введению большего количества животных.
- Убедитесь, что электропоранные животные здоровы после анестезии и что нет никакого ущерба, нанесенного хвосту.
8. Оценка эффективности нокаута
- Закрепите хвост электропора. Сделайте поперечные сечения хвоста с последующим иммуногистохимическим окрашиванием для оценки эффективности нокаута на уровне белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ампутация хвоста должна быть выполнена после электропорации, отрезанный хвост может быть использован для этой цели. В качестве отрицательного контроля4можно использовать животных с помощью гРНК против Gfp или tyrosinase. - Кроме того, электропоранный спинной мозг может быть извлечен и лисичен для ДНК. Выполните генотипирование ПЦР с последующим секвенированием Sanger или секвенированием следующего поколения для оценки процента отредактированных генетических локутов15.
ПРИМЕЧАНИЕ: В результате эффективность редактирования будет недооценивать фактическую эффективность редактирования для NSCs, в связи с включением неэлектропорированных клеток и нейронов, которые не имеют apical контакт с центральным просветом и, таким образом, не будет получать RNP смеси.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инъекции и электропорации комплекса CAS9-gRNA против Sox2 в аксолоттальный спинной мозг центрального канала привело к массовой потере SOX2 иммунореактивности в большинстве спинного мозга NSCs, с гРНК против тиросинезы (Тир) в качестве контроля (Рисунок 2 A).B3-tubulin (окрашенный TUJ1) является маркером для нейронов и не был выражен в NSCs, и SOX2- TUJ1-клетки, окружающие центральный канал, считались клетками, укрывающими удаления Sox2. Количественная оценка показала, что Sox2 нокаутирует значительное количество NSCs по CAS9-Sox2-gRNA электропорации (Рисунок2B), что свидетельствует о том, что этот метод привел к эффективной и высоко проникающей ген нокаут в спинном мозге NSCs.
После одновременных инъекций и электропорации, смесь двух комплексов CAS9-gRNA против Sox2 и Gfp, соответственно, в трансгенные акколоты с вездесущим выражением GFP (CAGGS-GFP), высокий процент двойного нокаута НСК были отмечены(рисунок 2C,D), что указывает на то, что протокол может быть использован для гибкого нокаута нескольких генов.
Рисунок 1 : Инъекция спинного мозга аксолоцирования и электропорация. (A) Схема, показывающая инъекцию CAS9-gRNA RNP в аксолотл спинного мозга центрального канала. (B) Установка микроманипулятора для инъекции. (C) Просмотр через стереомикроскоп аксолоцального хвоста, с спинного мозга указано. (D) Просмотр через стереомикроскоп аксолофлота хвост с вводили спинного мозга. (E) Схема электропорации пластины. (F) Схема животного и электродов, помещенных внутри электропорации пластины, готовыдля к электропорации. Шкала баров 1 мм. Эта цифра адаптирована от Albors и Танака18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Представитель нокаут результаты в аксолотль спинного мозга NSCs. (A) Инъекция спинного мозга и электропорация CAS9-Sox2-gRNA (n No 21) привели к потере SOX2 в большинстве НСК в 15 дней после электропорасации (dpE) иммуногистохимическим окрашиванием. CAS9-Tyr-gRNA (n No 21) служил отрицательным контролем. Шкала баров 100 мкм. (B) Количественная оценка показала значительное снижение SOX2 'NSCs (p qlt; 0.001 по T-тест студента), подсчет SOX2- TUJ1-клетки, окружающие центральный канал, как NSCs укрывательство Sox2 удаления. Ошибки баров SD. (C) Одновременные инъекции и электропорации Sox2-gRNA и Gfp-gRNA в сочетании с CAS9 (n No 6) привело к потере SOX2 и GFP в большинстве НСК иммуногистохимическим окрашиванием. CAS9-Tyr-gRNA (n No 6) служит отрицательным контролем. Шкала баров 100 мкм. (D) Количественная оценка показала, что среди всех целевых НСК, имеющих какое-либо удаление, большинство (94%) укрывал двойное удаление (GFP sOX2), и лишь небольшая доля (6%) одноразового удаления (GFP SOX- или GFP- SOX2). Эта цифра адаптирована из Fei et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол позволяет времени и пространства ограниченного гена нокаут в NSCs в аксолотель спинного мозга. Текущий протокол позволяет конкретно таргетинга НСК в определенное время и место с высоким penetrance. Он позволяет избежать потенциальных нежелательных эффектов, происходящих из гена нокаут в NSCs в других регионах, таких как мозг, которые происходят при использовании системы Cre-LoxP. Он также позволяет избежать эффектов развития, происходящих из стойких нокаут, что позволяет изучение функции генов сосредоточены на регенерации. Кроме того, этот протокол может быть выполнен у диких животных, избегая длительного времени ожидания, необходимого для создания дополнительных трансгенных аксолотлов, что необходимо для системы Cre-LoxP. Он также предлагает универсальность выбить несколько генов одновременно и очень проникает, что позволяет проводить эксперименты на F0 животных. Важно отметить, что процедура, как показано, не оказывает заметного влияния на регенерацию хвоста и спинного мозга4.
Использование комплексов CAS9 protein-gRNA RNP также показывает гораздо более высокую эффективность, чем системы, использующие cas9 и gRNA-expressing плазмиды4. Это, вероятно, связано с меньшим размером комплекса RNP по сравнению с плазмидов, а также дифференциального использования кодона, влияющих на экспрессию белка CAS9 из плазмидов, полученных из систем млекопитающих. Кроме того, поскольку комплексы CAS9 protein-gRNA RNP могут сразу же вызывать разрывы, нокаут происходит быстро. 60%-70% модифицированных геномных локусов наблюдались генотипированием ПЦР в пределах 24 ч электропорации (данные не показаны). Существует также возможность выполнения стук-вс с помощью этой стратегии путем совместного электропопования шаблона ремонта. Ряд стратегий стук в доступны, детали и соображения, которые вне сферы для этой публикации, но они подробно описаны в другой публикации15.
С другой стороны, этот протокол имеет несколько ограничений. Окрашивание или генотипирование ПЦР, как правило, необходимо для оценки степени нокаута в каждом экспериментальном животном, которое может быть трудоемким. Хотя ген нокаут из этого метода в значительной степени ограничивается NSCs окружающих центральный канал, нельзя исключать, что другие типы клеток также могут быть направлены, потому что 1) они также находятся в контакте с центральным каналом, или 2) RNP смесь просочилась из cen тральный канал до электропорации. Эти факторы следует учитывать при интерпретации результатов.
gRNA дизайн
С недавно опубликованным генома аксолотла и транскриптома, выявление аксолотль генов и их последовательности стало гораздо проще9,10,11,12,13. Подробные руководства при проектировании gRNA были описаны в другом месте, в том числе тот, который занимается исключительно акстолотлы15. Рекомендуется заранее разработать и протестировать не менее трех ГРН для редактирования и выбрать оптимальный дизайн для реального эксперимента. Эффективность гРНК может быть проверена путем введения смеси CAS9-gRNA в свежеотложенные аксолотловые яйца на одноклеточной стадии23. Эффективность редактирования можно затем оценить путем генотипирования вылупившихся личинок.
Соображения инъекций
Так как место инъекции спинного мозга страдает от физического повреждения, вызванного иглой и распространение множества RNP к тканям за пределами центрального канала, важно, чтобы выполнить инъекции в позициях вдали от региона, представляющих интерес для анализа. Например, если ампутация хвоста выполняется после электропорации для изучения влияния целевого гена на регенерацию спинного мозга, необходимо провести инъекцию, где участок будет удален путем ампутации.
Ввод центрального канала с инъекционным капилляром является наиболее важным шагом этого протокола, и новым пользователям рекомендуется практиковать сярприза до фактического эксперимента. Инъекции лучше всего выполнять на мелких животных (менее 2,5 см в длину) на задней части спинного мозга, где легче всего позиционировать капиллярный наконечник в центральный канал. Рекомендуется внимательно наблюдать за первоначальным распространением смеси RNP синего цвета. Существует вероятность того, что смесь RNP может быть введена в менингеальном пространстве вокруг спинного мозга. Резкое и быстрое распространение в виде линии вдоль середины спинного мозга указывает на успешную инъекцию в центральный канал18. Если ничего не выходит или спред останавливается преждевременно, рекомендуется держать педаль ноги нажата при перемещении капилляра немного в и из. Если это не удается, может потребоваться повторное положение капилляра или проверить на засорение открытия. Для RNP смесь распространяться в желудочки мозга, часто необходимо увеличить давление выброса к концу. Наличие желудочков головного мозга заполнены не является необходимым для электропорации спинного мозга, но это лучший признак того, что rnP смесь была введена в центральный канал.
Соображения электропорации
Рекомендуется оптимизировать параметры электропорации заранее, чтобы достичь достаточной доставки РНП в большинство НСК, не причиняя значительных повреждений другим тканям или убивая животное. Этот протокол был оптимизирован для животных 2,0-2,5 см в длину в размере18. Снижение напряжения переноса импульса до 35 В, вероятно, необходимо при работе с животными меньше, чем это. С другой стороны, более крупные животные потребуют более высокого напряжения и/или большего количества импульсов. Кроме того, расстояние между электродами влияет на эффективность. Для крупных животных может потребоваться уменьшение расстояния до 6 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Элли М. Танаку за ее постоянную и долгосрочную поддержку. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) Грант (317716), исследования Начиная гранты от южнокитайского университета нормальный (S82111 и 8S0109), и Китай постдокторской науки Фонд Грант (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
