Summary
É apresentado aqui um protocolo para executar a batida-para fora do gene tempo-e espaço-restrito em cordas espinais do Axolotl injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation.
Abstract
O Axolotl tem a habilidade original de regenerar inteiramente sua medula espinal. Isto é pela maior parte devido às pilhas ependymal permanecendo como pilhas de haste neural (NSCS) durante todo a vida, que proliferar para reformar o tubo ependymal e para diferenciar-se em neurônios perdidos após ferimento da medula espinal. Deciphering como estes NSCS mantêm o borne-desenvolvimento do pluripotência e proliferar em cima da lesão da medula espinal para reformar a estrutura exata do pre-ferimento pode fornecer a introspecção valiosa em como os cabos espinais mamíferos podem regenerar assim como opções potenciais do tratamento. Executar knock-outs do gene em subconjuntos específicos de NSCS dentro de um período de tempo restrito permitirá o estudo dos mecanismos moleculars atrás destes processos regenerativa, sem ser confundidos pelo desenvolvimento que perturbam efeitos. Descrito aqui é um método para realizar o knock-out do gene no NSCs da medula espinal de Axolotl usando o sistema de CRISPR-Cas9. Injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation, os genes do alvo são nocauteados para fora em NSCs dentro das regiões específicas da medula espinal em um timepoint desejado, permitindo estudos moleculars de NSCs da medula espinal durante Regeneração.
Introduction
A medula espinal da maioria de vertebrados é incapaz de regenerar depois da lesão, conduzindo à inabilidade permanente. Várias salamandras, como o Axolotl, são exceções notáveis. O Axolotl pode regenerar inteiramente uma medula espinal estruturalmente idêntica e restaurar completamente a função da medula espinal. Grande parte da capacidade regenerativa da medula espinhal Axolotl é devida a células ependímicas. Estas células alinham o canal central, e ao contrário daquelas em mamíferos, as pilhas ependymal de Axolotl permanecem como pilhas de haste neural (NSCs) desenvolvimento borne-Embryonic. Após ferimento da medula espinal (por exemplo, de uma amputação da cauda), estes NSCS proliferar para Regrow o tubo ependymal e para diferenciar-se para substituir os neurônios perdidos1,2,3. Descobrindo como Axolotl medula espinhal NSCs permanecem pluripotentes e tornam-se ativados após a lesão pode fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para pacientes humanos.
Devido aos avanços na técnica de knock-out do gene crispr-Cas9, a realização de knock-outs para decifrar a função gênica tornou-se mais fácil e demonstrou ter ampla aplicabilidade em várias espécies, incluindo axolotls4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. a liberação recente do genoma completo do Axolotl e do transcriptoma agora permite que qualquer Locus genómico seja direcionado e para melhor avaliar os efeitos fora do alvo9,10,11,12 , 13 anos de , 14. protocolos otimizados foram desenvolvidos para knock-out e knock-in em axolotls usando o sistema Crispr-Cas915. A entrega da maquinaria de crispr-CAS9 a forma do ribonucleoprotein de proteína-grna de CAS9 (RNP) foi mostrada para ser mais eficiente do que usando plasmídeos da codificação de CAS9 e de grna-4. Isto é provável devido ao RNP que é menor no tamanho do que vetores do plasmídeo, sua habilidade de criar rupturas do ADN imediatamente, e protegendo do gRNA da degradação do RNA. Além disso, o uso de RNPs ignora a transcrição e a tradução; assim, evita edições tais como a força do promotor e o uso óptimo do Codon quando os elementos do plasmídeo são derivados de uma espécie diferente.
Os estudos da perda--função são uma das aproximações gerais a investigar funções potenciais dos genes do interesse. A fim estudar a função do gene durante a regeneração, um knock-out deve idealmente ser executado apenas antes de um ferimento para evitar efeitos no desenvolvimento. Além disso, o knock-out deve ser restrito às NSCs e região de regeneração. Um knock-out do gene alvo em todos os NSCs (incluindo aqueles no cérebro, que é o caso em sistemas CRE-LoxP), pode produzir efeitos não relacionados com a regeneração que pode confundir a interpretação dos resultados. Felizmente, a estrutura da medula espinhal Axolotl fornece uma oportunidade única para o tempo e espaço restrito knock-out em NSCs. A maioria das NSCS da medula espinhal estão em contato com o canal central e constituem a grande maioria das células em contato com o canal central16,17. Portanto, uma injeção do complexo CAS9-grna no canal central, seguida de eletroporação, permite a entrega às NSCS da medula espinhal em uma região desejada em um tempo específico4,18,19. Este protocolo demonstra como isto é executado, conduzindo ao knock-out altamente penetrante nos NSCs alvejados da medula espinal. posteriormente, são realizadas análises subsequentes para estudar os efeitos sobre a regeneração e o comportamento do NSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais devem ser realizados de acordo com as regulamentações locais e nacionais sobre experimentação animal e com a aprovação do quadro de revisão institucional pertinente.
1. preparando a mistura de CAS9-gRNA RNP
- Projetar e sintetizar gRNAs.
Nota: refira outras publicações para projetar e sintetizar grnas, incluindo um exclusivamente a respeito dos axolotls15,20,21,22. - Obtenha proteína CAS9-NLS preparando-se em casa ou comprando-a comercialmente.
- Prepare a mistura de CAS9-gRNA misturando 5 μg de proteína de CAS9-NLS, 4 μg de gRNA, 0,9 μL de tampão de 10x CAS9, e encha acima o volume a 10 μL com H2o. alíquota-livre de nuclease a mistura e armazene em-80 ° c se não for usado imediatamente.
2. preparando placas do agarose para o electroporation
- Prepare 200 mL de solução de agarose a 2% (WT/vol) em 1x DPBS. Dissolva-se aquecendo a solução num microondas e despeje-a em 10 cm de placas de Petri até uma profundidade de cerca de 10 mm (suficientemente profunda para cobrir todo o animal).
- Permita que as placas se solidificem à temperatura ambiente. Guarde as placas a 4 ° c se não forem utilizadas imediatamente.
- Usando Bisturis cirúrgicos, corte a placa de agarose para fazer uma fenda para segurar a cauda reta, um poço para caber no corpo do animal, e dois poços extra para colocar os eletrodos (Figura 1e).
- Coloque a placa no gelo e encha-a até a borda com gelo-frio 1x DPBS. Use a mesma solução de DPBS para fazer as placas para assegurar a condutibilidade elétrica consistente na instalação.
3. Configurando o electroporator
- Configure o electroporator. Configurar o pulso poring para consistir de um pulso bipolar de 70 V, com uma duração de 5 ms, intervalo de 50 ms, e nenhuma deterioração da tensão. Configurar o pulso de transferência para ter quatro pulsos bipolares de 40 V, com uma duração de 50 ms, intervalo de 999 MS, e 10% de deterioração da tensão.
- Conecte os eletrodos ao electroporator e ajuste a pinça para 7 mm de distância. Submergir os eletrodos em uma taça de DPBS antes e entre Electroporation.
4. preparando e carregando capilares de vidro da microinjecção
- Realize um teste de rampa em um extrator de micropipeta flamejante/marrom de acordo com as instruções do fabricante para determinar o valor do calor.
- Puxe capilares de injeção com extremidades cônicas usando os seguintes parâmetros: calor = valor do teste de rampa, puxar = 100, velocidade = 100, tempo = 100.
- Observe a agulha um estereomicroscópio. Usando o fórceps fino, quebre o capilar em um ângulo de modo que tenha uma ponta inclinada. Quebre em uma posição onde é fino bastante para alvejar o canal central, ao ser forte bastante furar a pele.
Nota: o ponto em que o diâmetro é de cerca de 20 μm ou cerca de 50% do diâmetro da medula espinhal é um bom ponto de partida. Várias tentativas podem ser necessárias para obter uma quebra ideal. - Adicione a solução Fast Green FCF à mistura RNP numa proporção de 1:30 e carregue cerca de 5 μL de mistura de injecção no capilar com uma ponteira de pipeta Microloader.
- Monte o capilar na bomba pneumática, com a ponta inclinada voltada para baixo.
5. Configurando a bomba pneumática
- Configurar a bomba pneumática. Ajuste a preensão a 0,5 libras por a polegada quadrada (libra por polegada quadrada), ejetar à preensão de 2 libras por polegada quadrada, e a duração ao gated.
- Teste os ajustes capilares e pneumáticos da bomba mergulhando o capilar em uma gota da água e pressionando o pedal do pé para injetar. Certifique-se de que a mistura de injeção sai em um fluxo lento, mas constante.
- Ajuste a pressão de preensão se o começo da mistura da injeção que escapa para fora espontâneamente ou a água sugam acima o capilar. Aumente a pressão de ejeção ou quebre mais do capilar se a mistura da injeção está saindo demasiado lenta. Diminua a pressão de ejeção se a injecção estiver a sair demasiado depressa.
6. injetar RNP misturar na medula espinhal
- Anestesiar axolotls em 0, 3% de solução de benzocaína por pelo menos 10 min. Verifique se os animais não são responsivos lançando-os de cabeça para baixo na água.
- Pegar um animal com fórceps anel e colocá-lo em uma cama de silício, com o lado esquerdo do animal virado para cima ea cauda apontando para a direita. Posicione o local de injeção no meio do campo de visão do estereomicroscópio (Figura 1a).
- Ajuste o micromanipulador para que o capilar esteja chegando a 60 ° do lado direito do campo de visão (Figura 1B).
- Identifique a medula espinhal e o canal central (Figura 1C).
Nota: a medula espinhal é a estrutura tubular acima do Notochord. - Visando o canal central, mova o capilar para a frente para perfurar suavemente a pele e o músculo no canal central da medula espinhal. Limitar o movimento do capilar para pequenos passos, como a medula espinhal está bem abaixo dos músculos da cauda.
- Pressione e segure o pedal do pé para injetar a mistura no canal central. Observe se a mistura RNP se espalha ao longo do canal central como uma linha azul em ambas as direções, o que mostra que o capilar foi posicionado corretamente (Figura 1D).
- Se isso não ocorrer, mantenha o pedal pressionado enquanto move o capilar levemente para dentro e para fora até que a mistura RNP comece a entrar. Se o capilar ficar entupido por tecido, limpe-o ejectando-o em água a pressões mais elevadas.
- Ajuste a pressão de ejeção de modo que seja apenas bastante para fazer com que a mistura de RNP espalhe no canal central, mas não tanto que funde acima a estrutura.
- Continue a segurar o pedal do pé assim que a mistura da injeção se espalha mais ao longo do canal central, até que alcangue o vesícula terminal na extremidade da medula espinal e dos ventrículos no cérebro.
Nota: isto pode demorar até 2 min, dependendo do tamanho do animal. Pode ser necessário aumentar a pressão após algum tempo para causar a mistura de RNP para entrar nos ventrículos cerebrais. - Proceder o mais rapidamente possível ao Electroporation após a injeção bem sucedida.
7. electroporação
- Transfira o animal com o fórceps do anel na placa preparada do Electroporation do agarose (Figura 1E) no gelo. Coloque a cauda dentro da fenda por isso é colada por agarose (Figura 1F).
- Coloque os eletrodos nos poços de ambos os lados da cauda. Assegure-se de que o animal e os eléctrodos inteiros estejam cobertos por PBS gelado.
- Pressione o interruptor do pé para começar o electroporation.
- Depois que o electroporation é completo, retorne o animal à água.
- Proceder para injetar mais animais, se necessário.
- Verifique se os animais electroporados são saudáveis após a anestesia desaparece e que não há nenhum dano causado à cauda.
8. avaliando a eficiência de knock-out
- Fixar a cauda do animal em. Faça secções transversais da cauda seguidas de coloração imuno-histoquímica para avaliar a eficiência do knock-out no nível da proteína.
Nota: se uma amputação da cauda deve ser executada após o electroporation, a cauda cortada poderia ser usada para esta finalidade. Animais eletroporados com gRNAs contra GFP ou tirosinase, por exemplo, podem ser usados como um controle negativo4. - Alternativamente, a medula espinal em podia ser extraída e lysed para o ADN. Realize a PCR genotipagem seguida de sequenciamento de Sanger ou sequenciamento de próxima geração para avaliar a porcentagem de loci genético editado15.
Nota: a eficiência de edição resultante irá subestimar a eficiência de edição real para as NSCs, devido à inclusão de células não eletroporadas e neurônios que não têm contato apical com o lúmen central e, portanto, não receberão a mistura de RNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A injeção e o electroporation do complexo de CAS9-gRNA de encontro a Sox2 no canal central da medula espinal do Axolotl conduziram a uma perda maciça de immunoreactivity Sox2 em uma maioria de NSCS da medula espinal, com o grna de encontro ao tyrosinase (Tyr) como um controle (Figura 2 A). B3-tubulin (manchado com TUJ1) é um marcador para neurônios e não foi expressa em NSCS, e SOX2-TUJ1-células que cercam o canal central foram consideradas células abrigando SOX2 deleções. A quantificação mostrou Sox2 knock-out em um número significativo de NSCS pelo Electroporation de CAS9-Sox2-grna (Figura 2B), indicando que este método conduziu à batida-para fora eficiente e altamente penetrante do gene em NSCS da medula espinal.
Após a injeção simultânea e o electroporation, a mistura de dois complexos de CAS9-grna de encontro a Sox2 e a GFP, respectivamente, em axolotls transgênicas com expressão onipresente do GFP (caggs-GFP), uma porcentagem elevada de NSCS dobro do knock-out foram observados (Figura 2C, D), indicando que o protocolo pode ser utilizado para o knock-out flexìvel de múltiplos genes.
Figura 1 : Injeção e Electroporation da medula espinal de Axolotl. (A) esquema que mostra A injeção de CAS9-GRNA RNP no canal central da medula espinal do Axolotl. (B) a micromanipuladora configurada para a injecção. (C) ver através de um estereomicroscópio da cauda Axolotl, com a medula espinhal indicada. (D) ver através de um estereomicroscópio da cauda Axolotl com uma medula espinhal injetada. (E) esquemático da placa de electroporação. (F) esquemático do animal e eletrodos colocados dentro da placa de eletroporação, prontos para eletroporação. Barras de escala = 1 mm. Este número é adaptado de albors e Tanaka18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Os resultados representativos do knock-out na medula espinal Axolotl NSCs. (A) a injeção da medula espinal e o ELECTROPORATION de CAS9-Sox2-grna (n = 21) conduziram à perda de Sox2 na maioria de NSCS em 15 dias borne-Electroporation (dpE) pela mancha immunohistochemical. CAS9-Tyr-grna (n = 21) serviu como controle negativo. Barras de escala = 100 μm. (B) a quantificação mostrou redução significativa em SOX2 + NSCS (p < 0, 1 pelo teste t de Student), contando SOX2-TUJ1-células que cercam o canal central como NSCS abrigando uma deleção SOX2 . Barras de erro = SD. (C) a injeção simultânea e o electroporation de Sox2-grna e GFP-grna acoplados a CAS9 (n = 6) conduziram à perda de Sox2 e de GFP na maioria de NSCS pela mancha immunohistochemical. CAS9-Tyr-grna (n = 6) serve como controle negativo. Barras de escala = 100 μm. (D) a quantificação demonstrou que, entre todos os NSCS visados com qualquer supressão, a maioria (94%) apagamento dobro abrigou (GFP − SOX2 −), com somente uma proporção pequena (6%) tendo um único apagamento (GFP + SOX-ou GFP-SOX2 +). Este número é adaptado de Fei et al.4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo descrito permite que o tempo e o espaço restringidos o gene knock-out nos NSCs na medula espinal do Axolotl. O protocolo atual permite direcionamento específico de NSCs em um tempo definido e local com alta penetrância. Evita potenciais efeitos indesejáveis originários de nocaute genético em NSCs em outras regiões, como o cérebro que ocorrem ao usar o sistema CRE-LoxP. Também evita efeitos de desenvolvimento originados de um knock-out persistente, permitindo o estudo da função gênica focada na regeneração. Além disso, este protocolo pode ser realizado em animais de tipo selvagem, evitando o longo tempo de espera necessário para gerar axolotls transgênicos adicionais, o que é necessário para o sistema CRE-LoxP. Ele também oferece a versatilidade para derrubar múltiplos genes simultaneamente e é altamente penetrante, permitindo que experimentos sejam realizados em animais F0. Importante, o procedimento é mostrado para não ter nenhum efeito observável na regeneração da cauda e da medula espinal4.
O uso de complexos de proteína-grna de CAS9 RNP também apresenta uma eficiência muito maior do que os sistemas que utilizam plasmídeos de expressões de CAS9 e grna4. Isto é provável devido ao tamanho menor do complexo de RNP comparado aos plasmídeos, assim como o uso diferencial do Codon que afeta a expressão da proteína CAS9 dos plasmídeos derivados dos sistemas mamíferos. Além, desde que os complexos de proteína-gRNA de CAS9 RNP podem induzir rupturas imediatamente, o knock-out ocorre rapidamente. 60%-70% dos Locos genóricos modificados foram observados por genotipagem PCR dentro de 24 h de eletroporação (dados não mostrados). Há também a possibilidade de realizar Knock-ins usando esta estratégia por co-electroporating um modelo de reparação. Uma série de estratégias de Knock-in estão disponíveis, os detalhes e considerações de que estão fora do escopo para esta publicação, mas eles são descritos em detalhes em outra publicação15.
Por outro lado, este protocolo tem algumas limitações. A PCR de coloração ou genotipagem é geralmente necessária para avaliar a extensão do knock-out em cada animal experimental, o que pode ser trabalhoso. Enquanto gene knock-out deste método é largamente restrito aos NSCs em torno do canal central, não pode ser descartada que outros tipos de células também poderiam ser direcionados, porque 1) eles também estão em contato com o canal central, ou 2) a mistura RNP vazou para fora do CEN canal tral antes do Electroporation. Esses fatores devem ser considerados na interpretação dos resultados.
projeto de gRNA
Com o genoma e o transcriptome recentemente publicados de Axolotl, identificar os genes de Axolotl e suas seqüências tornou-se muito mais fácil9,10,11,12,13. Guias detalhados na concepção de gRNAs tem sido descrito em outro lugar, incluindo um que lida exclusivamente com axolotls15. É aconselhável projetar e testar pelo menos três gRNAs para a eficiência de edição de antemão e para escolher o projeto óptimo para o experimento real. A eficiência do gRNA pode ser testada injetando a mistura de CAS9-gRNA em ovos de Axolotl recentemente colocados no estágio de uma célula23. A eficiência de edição pode ser avaliada por genotipagem das larvas eclodidas.
Considerações sobre a injecção
Como o local de injeção da medula espinhal sofre de dano físico causado pela agulha e disseminação da mistura de RNP para tecidos fora do canal central, é importante realizar a injeção em posições afastadas da região de interesse a ser analisada. Por exemplo, se uma amputação de cauda é realizada após o Electroporation para estudar os efeitos de um gene alvejado na regeneração da medula espinal, é necessário executar a injeção onde o local será removido pela amputação.
Entrando no canal central com um capilar de injeção é a etapa mais crítica deste protocolo, e novos usuários são aconselhados a praticar antes do experimento real. A injeção é melhor realizada em animais menores (menos de 2,5 cm de comprimento) na extremidade posterior da medula espinhal, onde é mais fácil posicionar a ponta capilar no canal central. É aconselhável observar de perto a propagação inicial da mistura de cor azul RNP. Há a possibilidade que a mistura de RNP pode ser injetada no espaço meningeal em torno da medula espinal. Uma propagação afiada e rápida como uma linha ao longo do meio da medula espinal indica a injeção bem sucedida no canal central18. Se nada sair ou o spread parar prematuramente, recomenda-se manter o pedal pressionado enquanto move o capilar levemente para dentro e para fora. Se isso falhar, pode ser necessário reposicionar o capilar ou verificar se há uma abertura obstruído. Para que a mistura de RNP espalhe nos ventrículos cerebrais, é frequentemente necessário aumentar a pressão de ejeção para a extremidade. Ter os ventrículos cerebrais preenchidos não é necessário para a eletroporação da medula espinhal, mas é a melhor indicação de que a mistura de RNP foi injetada no canal central.
Considerações sobre electroporação
É aconselhável otimizar os parâmetros de eletroporação de antemão para alcançar a entrega suficiente do RNP para a maioria das NSCs sem causar danos extensos a outros tecidos ou matar o animal. Este protocolo foi otimizado para animais 2,0-2,5 cm de comprimento no tamanho18. Uma redução na tensão do pulso de transferência a 35 V é provável necessário ao trabalhar com os animais menores do que este. Por outro lado, os animais maiores exigirão maior tensão e/ou mais pulsos. Além disso, a distância entre os eletrodos afeta a eficiência. Uma redução da distância a 6 milímetros pode ser necessária para animais maiores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Prof. Elly M. Tanaka pelo seu apoio contínuo e a longo prazo. Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Nacional de ciência natural da China (NSFC) Grant (317716), pesquisa de início de subvenções da Universidade do Sul da China normal (S82111 e 8S0109), e uma China pós-doutorado ciência Fundação Grant (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
