Summary
Vi utsatt ett microphysiological system (MPS) med tarmen och lever organoider till paracetamol (APAP). Den här artikeln beskriver metoderna för organoid produktion och APAP farmakokinetiska och toxikologiska egendom bedömningar i MPS. Den beskriver också de vävnadsfunktionsanalyser som är nödvändiga för att validera resultaten.
Abstract
De nyligen introducerade mikrofysiologiska system (MPS) odla mänskliga organoider förväntas prestera bättre än djur i prekliniska tester fasen av läkemedel utveckla processen eftersom de är genetiskt mänskliga och rekapitulera samspelet mellan vävnader. I denna studie, den mänskliga intestinal barriär (emuleras av en co-kultur av Caco-2 och HT-29 celler) och levern motsvarande (emuleras av sfäroider gjorda av differentierade HepaRG celler och mänskliga hepatic stellate celler) integrerades i en två-organ chip (2-OC) mikrofluidisk enhet för att bedöma vissa paracetamol (APAP) farmakokinetiska (PK) och toxiska egenskaper. MPS hade tre församlingar: Tarmen endast 2-OC, Lever endast 2-OC, och Tarmen/Levern 2-OC med samma media perfusing båda organoider. För PK bedömningar doserade vi APAP i media vid förinställda tidpunkter efter att ha administrerat den antingen över tarmbarriären (efterlikna den orala vägen) eller i media (efterlikna intravenös väg), vid 12 μM och 2 μM respektive. Medierna prover analyserades av reversed-fas högtrycks vätskekromatografi (HPLC). Organoider analyserades för genuttryck, för TEER-värden, för proteinuttryck och aktivitet och samlades sedan in, fixade och skickades till en uppsättning morfologiska utvärderingar. MTT-tekniken presterade väl vid bedömningen av den organoida livskraften, men analyserna med högt innehåll (HCA) kunde upptäcka mycket tidiga toxiska händelser som svar på APAP-behandling. Vi kontrollerade att medieflödet inte väsentligt påverkar APAP absorptionen medan det avsevärt förbättrar levern motsvarande funktionalitet. APAP mänskliga intestinal absorption och levermetabolism kan efterliknas i MPS. Associationen mellan MPS-data och in silico-modellering har stor potential att förbättra förutsägbarheten för in vitro-metoderna och ge bättre noggrannhet än djurmodeller i farmakokinetiska och toxikologiska studier.
Introduction
På grund av genomiska och proteomiska skillnader har djurmodeller begränsat prediktivt värde för flera mänskliga resultat. Dessutom är de tidskrävande, dyra och etiskt tvivelaktiga1. MPS är en relativt ny teknik som syftar till att förbättra den prediktiva kraften och minska kostnaderna och tiden med prekliniska tester. De är mikrofluidiska enheter odla organoider (artificiella mimetics funktionella enheter av organ) under media flöde som främjar organoid-organoid kommunikation. Organoider gjorda av mänskliga celler ökar translationell relevans2,3,4. MPS förväntas prestera bättre än djurförsöken eftersom de är genetiskt mänskliga och rekapitulera samspelet mellan vävnader. När det är fullt fungerande kommer MPS att ge mer meningsfulla resultat, med högre hastighet och lägre kostnader och risker4. Många grupper utvecklar MPS för flera ändamål, särskilt sjukdomsmodeller för att pröva läkemedlets effekt.
Exponeringsnivån är en av de mest kritiska parametrarna för utvärdering av läkemedelseffekt och toxicitet5,6,7,8,9,10,11,12. MPS tillåter organoid integration som emulerar systemisk exponering och förväntas prestera bättre än den traditionella 2D mänskliga vävnaden kultur. Denna teknik kan avsevärt förbättra förutsägelsen av sammansatta intestinal absorption och levermetabolism4.
En MPS integrera mänskliga motsvarande modell av tarmen och levern är en bra utgångspunkt, med tanke på den centrala roll som dessa två organ i läkemedelsbiotillgänglighet och systemisk exponering13,14,15. APAP är ett attraktivt läkemedel för att studera en MPS utan en njure motsvarande eftersom dess metabolisering sker främst avlevern 16,17.
Den 2-OC är en två-kammare mikrofluidisk enhet som lämpar sig för kultur av två olika mänskliga motsvarande vävnader / organoider sammankopplade med mikrokanaler16. För att efterlikna en in vitro human oral/intravenös administrering av ett läkemedel och bedöma effekterna av korspratet mellan tarm- och leverekvivalenter på APAP-farmakokinetik, förutom de organoider funktionalitet och livskraft, tre olika MPS församlingar utfördes: (1) en "Tarmen 2-OC MPS" som består av en tarmen motsvarande baserad i en kultur infoga innehåller en Caco-2 + HT-29 celler kokultur, integreras i 2-OC enheten; (2) en "Lever 2-OC MPS" som består av lever sfäroider gjorda av HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) integrerade i 2-OC enheten; och (3) en "Inälva/Lever 2-OC MPS" som består av tarmen motsvarande i en enhet fack kommunicera med levern motsvarande i den andra av media flödet genom mikrofluidiska kanaler.
Alla analyser utfördes under statiska (inget flöde) och dynamiska (med flöde) förhållanden på grund av inverkan av de mekaniska stimuli (kompression, sträckning, och skjuvning) på cellen livskraftoch funktionaliteter 18,19,20. Den föreliggande artikeln beskriver protokollet för APAP oral/intravenös administreringsemulering och respektive absorption/metabolism och toxikologiska analyser i 2-OC MPS som innehåller humana tarm- och leverekvivalenter modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av vävnadsekvivalenter för odling i 2-OC
- Tunntarmen barriärekvivalent produktion
- Underhålla Caco-2 och HT-29 celler med hjälp av tarmen motsvarande medium: DMEM kompletteras med 10% FBS, 1% penicillin och streptomycin, och 1% icke-essentiella aminosyror, som heter "DMEM S" i detta manuskript.
- Ta bort mediet, tvätta två gånger med 1x DPBS och tillsätt 8 mL av 0,25% Trypsin/EDTA för att dissociate Caco-2 celler som odlas i cellodlingskolvar (175 cm2). Inkubera i 5 min vid 37 °C och stoppa reaktionen genom att tillsätta åtminstone den dubbla volymen trypsinhämmare. Utför samma procedur för HT-29-celler, justera reagensvolymerna eftersom en mindre mängd av dessa celler behövs och de bibehålls i mindre kolvar (75 cm2).
- Centrifugera vid 250 x g i 5 min, ta bort supernatanten från båda rören, och resuspend cellen pellets i 10 mL dmem S. Räkna celler, vilket garanterar en cell livskraft högre än 80%. Aseptiskt integrera cellodling skär i en 24-brunns platta tidigare fylld med 400 μL DMEM S per brunn i den basolaterala sidan (som representerar den mänskliga blodomloppet).
- Samodla Caco-2- och HT-29-celler vid förhållandet 9:121. Använd 2,25 x 105 Caco-2 och 2,5 x 104 HT-29 celler till varje tarmekvivalent i en slutvolym på 200 μL DMEM S. Justera celltal och volym enligt önskat antal organoider. Blanda försiktigt.
- Pipett 200 μL celllösning i varje skärs apikala sida (som representerar den humana tarmlumensidan), sådd 250 000 celler per insats. Samodlar cellerna i skären i tre veckor22. Byt medium minst tre gånger i veckan, aspirera det från både apikala och basolaterala sidor med en steril Pasteur pipett, var noga med att inte skada intakt cellbarriären.
OBS: Fortsätt med aspirationen på den apikala sidan, för att inte röra cellbarriären (aspirera genom att stödja Pasteurpipetten på cellinsatsens plastfälg). - Kontrollera den snäva monolayerbildningen genom att mäta TEER (transepithelial elektriskt motstånd) var tredje dag med hjälp av en voltmeter23, enligt tillverkarens anvisningar.
- Utför ett blankt, mäta motståndet över en cellodling infoga utan celler, men med samma cell medium och vid samma cellplatta.
- Beräkna vävnadsresistens genom att subtrahera blindresistansen från den vävnadsekvivalenta resistensen, och multiplicera med filtermembranens effektiva yta (0,6 cm2). En bra tarmen barriärbeständighet är i en rad 150 till 400 Ω∙cm2.
OBS: Efter 21 dagar cellerna måste vara helt differentierade och tarmbarriären bildas, så tarmen motsvarigheter är redo att integreras i MPS.
- Leverekvivalenter produktion
- Underhåll HepaRG-celler med hjälp av leverns ekvivalenta medium, som är Williams Medium E kompletterat med 10% fetalt bovinsserum, 2 mM L-glutamin, 100 enheter/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 5 μg/mL humant insulin och 5 x 10-5 M hydrokortison, och heter "Williams E S" i detta manuskript. Förnya HepaRG media var 2-3 dagar och upprätthålla cellkultur i två veckor för att initiera differentiering i hepatocyter och konlangiocyter.
- Efter de första två veckorna, lägg 2% DMSO till HepaRG: s medium för ytterligare två veckor för att slutföra celldifferentieringen24,25. Odla HHSTeC i Stellate Cell Media (SteC CM), med hjälp av poly-L-lysinbelagda cellodlingskolvar, byta media varannan eller var tredje dag.
- Ta bort mediet, tvätta två gånger med 1x DPBS och tillsätt 8 mL av 0,05% Trypsin/EDTA, för att dissociate HepaRG celler som odlas i cellodlingskolvar (175 cm2). Inkubera i 5 till 10 min vid 37 °C och stoppa reaktionen genom att tillsätta minst dubbla volymen trypsinhämmare. Utför samma för HHSTeC, anpassning av reagensvolymen eftersom en mindre mängd av dessa celler behövs och de kan bibehållas i mindre kolvar (75 cm2).
- Centrifugera både vid 250 x g i 5 min, ta bort supernatanten och resuspend cellen pellets i Williams E S medium. Räkna celler, säkerställa en cell livskraft högre än 80%.
- Generera levern sfäroider kombinera HepaRG och HHSTeC celler vid ett förhållande av 24:1, respektive, i Williams E S medium16. Tillsätt 4,8 x 104 differentierade HepaRG och 0,2 x 104 HHSTeC för att komponera varje leversfäroid på 50 000 celler, i en volym på 80 μL. Justera cellnummer och volym enligt önskat antal sfäroider. Blanda försiktigt.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett, dispensera 80 μL av den kombinerade cellpoolen i varje brunn av 384 sfäroida mikroplattor, som har rund brunnsbottensgeometri.
OBS: Efter fyra dagar bildas sfäroider på ca 300 μm. - Med hjälp av breda borrspetsar, överföra leverspheroids till ultra-låg-fastsättning 6 brunnsplattor, vilket gör att den nödvändiga "en efter en" räkna.
2. Integrering av tarm- och leverekvivalenter i en 2-OC MPS
-
Tarmen 2-OC MPS församling för absorption assay
- Pipett 500 μL dmem S in i det större fack på 2-OC och 300 μL i den mindre. Aspirera de basolaterala och apikala medierna i varje tarmbarriären motsvarande i de 24 brunnsplattor. Med hjälp av sterila tcets, integrera ett skär per 2-OC krets, specifikt i det större facket. Applicera 200 μL av tarmmediet vid den apikala sidan.
OBS: Undvik bildning av bubblor när de integrerar organoiderna i MPS. - Anslut MPS till styrenheten, som måste anslutas till en trycksatt lufttillförsel. Ställ in parametrarna: ett tryck på, ungefär, ±300 bar och en pumpfrekvens på 0,3 Hz. Starta flödet 24 h före administrering av testämnet. Nästa dag, utför APAP-behandlingen.
- Pipett 500 μL dmem S in i det större fack på 2-OC och 300 μL i den mindre. Aspirera de basolaterala och apikala medierna i varje tarmbarriären motsvarande i de 24 brunnsplattor. Med hjälp av sterila tcets, integrera ett skär per 2-OC krets, specifikt i det större facket. Applicera 200 μL av tarmmediet vid den apikala sidan.
-
Lever 2-OC MPS församling för metabolism assay
- Pipett 650 μL av Williams E S i det stora facket och 350 μL i det mindre facket, som kommer att få sfäroiderna. I ultra-låg-fastsättning 6 brunnsplattor, räkna sfäroiderna med bredborrade spetsar. Varje lever motsvarande består av tjugo sfäroider26. Integrera tjugo leverekvivalenter per krets, med hjälp av bredborrade spetsar, som tillåter överföring av organoider endast, i det mindre facket i en 2-OC.
- Anslut MPS till styrenheten, som måste anslutas till en trycksatt lufttillförsel. Ställ in parametrarna: ett tryck på, ungefär, ±300 bar och en pumpfrekvens på 0,3 Hz. Starta flödet 24 h före administrering av testämnet. Nästa dag, utför APAP-behandlingen.
-
Tarm/Lever 2-OC MPS-montering för absorption och metabolism assay
- Kombinera de två medierna (tarmen och levern) i en 1:4-proportion, vilket innebär 200 μL DMEM S i tarmen apikal sida och 800 μL av Williams E S i basolateralsidan. Integrera tarm och lever ekvivalenter, samtidigt, i 2-OC.
- Anslut MPS till styrenheten, som måste anslutas till en trycksatt lufttillförsel. Ställ in parametrarna: ett tryck på, ungefär, ±300 bar och en pumpfrekvens på 0,3 Hz. Starta flödet 24 h före administrering av testämnet. Nästa dag, utför APAP-behandlingen.
OBS: För alla experiment, utför varje tidpunkt i tre exemplar, vilket innebär tre separerade 2-OC-kretsar (dvs. 1 och 1/2 2-OC-enheter). Den totala volymen för varje 2-OC-kretsar är 1 mL.
3. Beredning av acetaminofen (APAP)
- Förbered APAP-stamlösningen, upplösa APAP i absolut etanol. På dagen för försöket, späd APAP i respektive medium (APAP-lösning), till en koncentration på 12 μM för "oral administrering" och 2 μM för "intravenös administrering".
- Se till att den slutliga koncentrationen av etanol i fordonets kontroll- och behandlingslösning är 0,5 % för båda förvaltningarna. För den positiva kontrollen (100 mM APAP) är etanolkoncentrationen 2%.
4. Testämnesadministration och provtagning av medier
- APAP "muntlig" administration och media provtagning
- Aspirera det basolaterala och apikala mediet för varje tarmbarriärekvivalent i 2-OC. Pipette 500 μL av lämpligt odlingsmedium in i det stora kupén vid den organoida basolaterala sidan och 300 μL in i det lilla kupén.
- Kontrollera om det finns bubblor och fortsätt med tarmbarriären motsvarande behandling med testämnet i den apikala sidan, efterlikna oral administrering. Emulera APAP "oral" administrering genom att tillsätta 200 μL av en 12 μM APAP-lösning på den apikala sidan av tarmkulturskär, som representerar tarmens "lumensida" (Figur 1B). Anslut MPS till styrenheten.
- Samla den totala volymen från apikala och från basolaterala sidor vid följande tidpunkter: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, och 24 h15,27. Utför alla experiment i tre exemplar, vid statiska och dynamiska förhållanden, och samla varje prov, av varje tre exemplar, i ett separat mikrorör. Analysera proverna med hjälp av HPLC/UV.
OBS: Separata apikala och basolaterala prover.
- APAP "intravenös" administration och mediaprovtagning
- Emulera den "intravenösa" vägen genom att administrera 2 μM APAP-lösning direkt i leverutrymmet. Aspirera alla 2-OC medium innehåll. Pipett 650 μL av Williams E S som innehåller testämnet i det stora fack och 350 μL av samma medium in i det mindre fack som innehåller de 20 sfäroiderna. Samla alla volymer vid följande tidpunkter: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h, och 24 h27,28.
- Utför alla experiment i tre exemplar, vid statiska och dynamiska förhållanden. Samla varje prov, av varje tre exemplar, i en separat microtube. Analysera proverna med hjälp av HPLC/UV.
5. Instrumentering och kromatografiska förhållanden
- HPLC-analys
- Ange alla relevanta parametrar för HPLC-analysen enligt tabell 1.
- Filtrera den mobila fasen genom ett 0,45 μm membranfilter under vakuum. Filtrera proverna genom ett PVDF-sprutfilter med 0,22 μm porstorlek (diameter 13 mm) och förvara dem i en injektionsflaska. Starta mätningen.
- Stamlösningar, kalibreringsstandarder och kvalitetskontroll (QC) prover
- Förbered 10 mM APAP-lagerlösningar i ammoniumacetatbuffert (100 mM, pH 6,8) och späd ytterligare med DMEM S och Williams E S cellodlingsmedier utspädda med ammoniumacetatbuffert (1:1, v/v) för att uppnå de arbetslösningar som sträcker sig från 0,25 till 100,00 μM.
- Inkludera en uppsättning kalibreringsprover i tre exemplar samt kvalitetskontrollprover på fyra nivåer i tre exemplar. Förbered dessa standarder genom serieutspädning.
- Skapa kalibreringskurvor av APAP-toppområden kontra APAP nominella standardkoncentrationer. Bestäm den linjära regressionen som passar för varje kalibreringskurva. Utvärdera godheten-of-fit av olika kalibreringsmodeller genom visuell inspektion, korrelationskoefficient, intra- och inter-run noggrannhet och precisionsvärden.
- Injicera blankprov av DMEM S och Williams E S media utspädd i ammoniumacetatbuffert (1:1, v/v) i sextuplicat. Förbered tre exemplar av kvalitetskontrollprover i DMEM S och Williams E S media utspädda med ammoniumacetatbuffert (1:1, v/v) för APAP-koncentrationerna på 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 och 90,00 μM.
- Se till att kvalitetskontrollproverna bereds från en ny stamlösning, som skiljer sig från den som används för att generera en standardkurva. Använd kvalitetskontrollprover för att undersöka intra- och inter-run-variationer.
- Valideringsprocedurer
- Utför den bioanalytiska metodvalideringen enligt de tidigare rapporteradeprocedurerna 29,30. Utför de kromatografiska körningarna vid fem eller sex olika tillfällen, med tanke på Williams E S respektive DMEM S cellkulturmedier.
- Se till att kalibreringspunkter som sträcker sig från 0,25 till 100,00 μM APAP, i DMEM S eller Williams E S cellkulturmedia utspädda i ammoniumcenatbuffert (1:1, v/v), ritas upp utifrån topp-områdena apap (axel y) mot respektive nominella koncentrationer (axel x). Jämför sluttningarna av dessa standardkalibreringskurvor med sluttningar av kalibreringskurva förberedd i ammoniumacetatbuffert. Se till att alla kalibreringskurvor har ett korrelationsvärde på minst 0,998.
- Bestäm precision och noggrannhet (intra och inter-run) för analyten i surrogatmatrisen med hjälp av replikat på fyra olika nivåer LLOQ, låg, mitten och högkvalitativ kontroll på fem eller sex olika dagar. Utför mätningar med precision och noggrannhet vid intrakörning samma dag i DMEM S eller Williams E S cellodlingsmedier utspädda i ammoniumacetatbuffert (1:1, v/v) som innehåller 0,50, 4,50, 45,00 och 90,00 μM APAP-koncentrationer (n= 3).
- Utvärdera varje uppsättning kvalitetskontrollprover som innehåller APAP-koncentrationerna från nyligen erhållna kalibreringskurvor. Testa analyserna selektivitet genom graden av avskiljning av föreningen av intresse och eventuella andra kromatografiska toppar orsakade av störande komponenter.
- Nedre gräns för kvantifiering (LLOQ) och gräns för detektion (LOD)
- Bestäm den nedre kvantifieringsgränsen (LLOQ) utifrån standardsvikelsen för svaret och lutningsbetoningen. Beräkna med hjälp av formeln 10α/S, där α är standardavvikelsen för y-intercept och S är lutningen på rät linje som erhålls genom plottningav kalibreringskurvor 29,30. Uppskatta gränsen för detektion (LOD) med beaktande 3,3 gånger blankvars standardavvikelse, dividerat medlutningen på kalibreringskurvan 29,30.
6. Vävnadsekvivalenter bärkraft/funktionalitet
- Mtt
- Utför en MTT-analys för att bedöma organoid livskraft i alla tidspunkter i MPS-analysen. Som den negativa kontrollen, använd cell media plus fordon. Som den positiva kontrollen, behandla organoiderna med 100 mM APAP och 1% NaOH utspädd i cellmedium.
- Överför de 20 sfäroiderna av varje replikat för enskilda brunnar i en 96 brunnsplatta, och cellodlingsinsatserna, som innehåller tarmekvivalenterna, till 24 brunnscellplattor, vilket placerar en tarmekvivalent per brunn. Tvätta vävnadsekvivalenterna tre gånger med 1x DPBS.
- Tillsätt 300 μL av en 1 mg/mL MTT-lösning, utspädd i respektive cellmedium, per brunn. Inkubera plattorna i 3 h vid standard cellodlingsförhållanden.
- Ta bort MTT-lösningen från varje brunn försiktigt genom pipettering. Extrahera MTT formazan från tarmen och levern ekvivalenter med hjälp av 200 μL isopropanol per brunn över natten vid 4 °C.
OBS: Förslut locket för att förhindra avdunstning. - Överför 200 μL av varje supernatant till respektive föridentifierade brunn i en 96 brunns mikrotestplatta. Använd isopropanol som blindprov.
- Läs formazanabsorbansen i en tallriksläsare vid 570 nm. Beräkna cellernas relativa förmåga att minska MTT (%) med hjälp av den genomsnittliga optiska densiteten för varje tidpunkt, jämfört med den negativa kontrollen, betraktas som 100% cellens livskraft.
- Cytokemi/Histologi
- Fixera tarmen och lever ekvivalenter, för 25 min vid rumstemperatur, med hjälp av 4% (w / v) paraformaldehyd i 0,1 M fosfat-saltlösning buffert, pH 7,4. Tvätta organoiderna 5 gånger i PBS-buffert i 10 minuter varje gång. Fläcka tarmen och levern motsvarigheter med tetrametylrhodamine isothiocyanate-phalloidin eller Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 i PBS31.
- Överför dem till OCT frysmedium i några minuter för att acklimatisera sig vid RT innan de överförs till flytande kväve tills den fullständiga frysningen. Utför lever sfäroider cryosections ca 10-12 μm tjock, med hjälp av en kryostat.
- Montera vävnaderna sektioner i monteringsmedium med DAPI. Undersök dem genom confocal fluorescens mikroskopi.
- Frys organoiderna efter fixering för att utföra hematoxylin & eosinfärgning enligt de fastställda protokollen. Montera objektglasen med monteringsmedium efter att vävnaden skivats enligt ovan och ta histologiska bilder med hjälp av ett optiskt mikroskop.
- Analys med högt innehåll
- Mitokondriell och nukleär färgning av cellerna
- Rekonstruera det lyofilaterade pulvret i DMSO för att göra en 1 mM mitokondriell infärgningslagerlösning (t.ex., MitoTracker Deep Red FM). Förvaras alikvoterad stamlösning vid -20 °C skyddad mot ljus. Späd ut 1 mM mM mitokondriell infärgningsstamlösningen till den slutliga koncentrationen (200 nM) i förvärmd (37 °C) vävnadsodlingsmedium utan serum.
- Ta bort cellkulturmediet. Tillsätt mitokondriell färgningslösning för att helt täcka provet och inkubera celler i 15-45 min vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5% CO2.
- Ta försiktigt bort den mitokondriella färgning arbetslösningen och ersätta den med 2-4% paraformaldehyd fixativ i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj de fasta cellerna försiktigt med PBS i 5 minuter. Upprepa tvättprocessen två gånger.
- Bered en 10 mg/mL (16,23 M) nukleinsyrafärgningslagerlösning genom att lösa upp 100 mg Hoechst 33342-färgämne i 10 mL ultrarent vatten.
OBS: Stamlösningen ska alikvotas och förvaras skyddad från ljus vid -20 °C. - Förbered en 0,2-2,0 μg/mL nukleinsyrafärgning arbetslösning i PBS och inkubera de fixerade cellerna med nukleinsyra färgning arbetslösning i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort nukleinsyrafärgning arbetslösning och skölj cellerna försiktigt med PBS i 5 minuter tre gånger. Celler ska hållas i PBS vid 4 °C, skyddas mot ljus.
- Mitokondriell och nukleär färgningsanalys
- Analysera celler med hjälp av fluorescensmikroskop med filteruppsättningar som är lämpliga för nukleinsyrafläcken (λEx/ λEm: 361/497 nm) och den mitokondriefläcken (λEx/ λEm: 644/665 nm). Hitta celler genom nukleinsyra positiv färgning och kvantifiera cellnummer. Kvantifiera mitokondriell fläck fluorescens intensitet i mitokondrierna.
- Mitokondriell och nukleär färgning av cellerna
- Morfometriska mätningar (sfäroider beräkningar) i ImageJ
- Exportera HCA-bilder (High Content Analysis) som *.flex-filer från Columbus-programvaran. Importera .flex-filer som en gråskala i ImageJ med hjälp av Bio-Formats plugin32: Arkiv > Importera > Bio-Format.
- I fönstret Importalternativ väljer du Hyperstack-visning och aktiverar Dela kanaler under Dela upp i separata fönster. Detta alternativ kommer att möjliggöra åtkomst av alla filer i en viss kanal (t.ex., DAPI, mitotracker, etc.). Välj inte Använd virtuell stack under Minneshantering.
OBS: Det är att föredra att använda DAPI-kanal som "damm" i bilder då odlingsmediet reduceras i UV-våglängd (t.ex. 405 nm). - Justera pixelstorlek (Analysera > Ange skala) om den inte har lästs in enligt inbäddade värden i .flex-filen. Applicera ett Gaussisk oskärpa filter för att avlägsna överskottet av buller och undvika ojämnheter i formkontur. Process > Filter > Gaussisk oskärpa. Ett högt värde av Sigma (radie) mellan 2,0 och 3,0 är idealiskt för de flesta fall. Om stacken har flera bilder, gäller för alla dem (välj Ja i processstack-fönstret).
- Generera en binär bild för att separera bakgrund och organoider (objekt) med hjälp av ett tröskelvärde. Klicka på Bild > Justera > Tröskelvärde. Använd den röda masken för att justera värdena efter intensiteten i bilden, för att passa organoid formen, hålla morfologin intakt. Inaktivera Mörk bakgrund om bilden har en vit bakgrund. Klicka på Verkställ.
- Välj Threshold-metoden i fönstret Konvertera stack till binärt. Vanligtvis är Default eller Triangle att föredra i denna typ av bildbehandling. Håll bakgrunden som Mörk. Välj Beräkna tröskelvärde för varje bild om det finns flera bilder i stapeln.
- Välj Process > Binärt > Fyll hål. Ta eventuellt bort hål från bakgrunden. I Process > Binärt > Alternativs väljer du Svart bakgrund och utför Fyll hål igen. Inaktivera Black-bakgrundsalternativet innan du fortsätter till nästa steg.
- Separata objekt. För organoider är vattendelaremetoden ett bra val. Klicka på Process > Binär > Vattendelare. Utför formanalysen.
- Välj Analysera > Ange mått. Flera alternativ finns tillgängliga (detaljer i https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). För organoider väljer du Område, Medelvärdet av gråttvärde , Min & max gråvärde och Shape-deskriptorer. Välj valfritt, Visa etikett för att identifiera objekt i bilden och Vetenskaplig notation. Klicka på OK.
- Välj Analys > Analysera partiklar. Välj gränsvärdena Storlek och Cirkuläritet. Behåll 0-oändlighet respektive 0,00-1,00 för att mäta alla objekt i bilden. Välj Kontureri Visa så att objekten kommer att identifieras. Aktivera Visningsresultat till utdataresultat; Uteslut på kanter för att utesluta objekt som rör vid kantlinjer; Inkludera hål så eventuella inre hål i objekten betraktas som en del av huvudformen.
- Upprepa Shape Analysis för varje bildstapel och resultaten kommer att läggas till i en enda tabell. Exportera resultattabell i Arkiv > Spara som... som Comma Separated Values (.csv) fil.
- Realtid PCR
- Extrahera RNA från vävnadsekvivalenter med hjälp av en monofasisk lösning av fenol och guanidinisotiocyanat, efter tillverkarens anvisningar.
- Utför cDNA-syntesen genom omvänd transkription av 1 – 2 μg totalt RNA.
- Förstärka alla mål med hjälp av genspecifika primers (tabell 5) för att utföra realtid kvantitativ PCR. Varje qRT-PCR innehåller 30 ng av omvänt transkriberat RNA och 100 nM av varje primer.
- Följ PCR-villkor: 50 °C i 3 minuter (1 cykel); 95 °C i 5 minuter (1 cykel), 95 °C i 30 sekunder, 59 °C i 45 sekunder och 72 °C i 45 sekunder (35 - 40 cykler).
- CYP-analys
- Följ avsnitt 2.2 för lever 2-OC montering. De experimentella grupperna är No-cell control, APAP 2 μM behandlingar för 12 h, 24 h, och fordonets kontroll. Följ avsnitt 3.3 och 4.2 för APAP 2 μM förberedelse och behandling.
OBS: För att säkerställa att alla proverna kommer att vara klara samtidigt för CYP-analys, starta 12 h behandlingen 12 timmar efter att behandlingen med 24 h påbörjats. Behandla no-cellstyrningen av CYP-aktivitet med 0,5% etanollösning, samt fordonets kontroll. - Tina 3 mM luminogenic substrat stamlösning vid rumstemperatur och gör en 1:1000 utspädning i Williams E S. Skydda från ljus.
- Samla sfäroider och överför varje experimentell grupp till en brunn av en 96-brunnsplatta. Ta bort mediet, tvätta två gånger med 100 μL av 1x DPBS och tillsätt 80 μL av 3 μM substratlösning per brunn. Håll no-cell kontrollen i Williams E S medium. Spara en brunn utan sfäroider eller substratlösning för en bakgrundskontroll. Inkubera i 30-60 min vid 37 °C med 5% CO2, skyddad från ljus.
- Jämviktslyofiliserat Luciferin Detection Reagens (LDR) med hjälp av Reconstitution Buffer med esteras. Blanda genom att snurra eller invertera. Förvara den avpassade volymen i rumstemperatur till nästa steg.
OBS: Rekonstituerad LDR kan förvaras i rumstemperatur i 24 timmar eller vid 4 °C i 1 vecka utan aktivitetsförlust. För långtidsförvaring, förvara vid –20 °C. - Överför 25 μL av intakta sfäroiders supernatant i tre olika brunnar av en vit ogenomskinlig 96-brunnsmikroplatta, efter inkubation. Tillsätt 25 μL LDR per brunn och homogenisera.
- Inkubera den vita plattan i rumstemperatur i 20 minuter. Läs luminiensen på en luminometer. Använd inte en fluorometer.
- Beräkna nettosignaler genom att subtrahera värden för bakgrundsluminecence (ingen-cellkontroll) från de testföreningsbehandlade och obehandlade (fordonsstyrnings)värdena. Beräkna procentuell förändring av CYP3A4-aktivitet genom att dividera de nettobehandlade värdena med de obehandlade nettovärdena och multiplicera med 100.
- Följ avsnitt 2.2 för lever 2-OC montering. De experimentella grupperna är No-cell control, APAP 2 μM behandlingar för 12 h, 24 h, och fordonets kontroll. Följ avsnitt 3.3 och 4.2 för APAP 2 μM förberedelse och behandling.
- Västra blotting
- Överför leversfäroiderna till en identifierad 1,5 mL mikrorör. Ta bort mediet och tvätta två gånger med 100 μL av 1x DPBS.
- Lysate leverspheroiderna i 100 μL av celllys RIPA buffert vid 4 °C i 20 min. Centrifugera i 15 min, 4 °C, och 11000 rpm. Överför supernatanten till en annan identifierad 1,5 mL mikrorör.
- Kvantifiera mängden protein som erhålls genom Bradford-metoden. Ladda mellan 10 och 50 μg protein från den kvantifierade cellen lysate per brunn av en gradient polyakrylamid gel 3-15% och utföra en SDS-PAGE.
- Överför det belastade proteinet från gelen till ett 0,22 μm PVDF-membran genom den halvtorra systemutrustningen. Använd en överföringslösning på 50 mM Tris-HCl och 192 mM glycin. Ställ in utrustningsparametrar enligt antalet geler som ska överföras (1 till 2 åt gången).
- Blockera ospecifika interaktioner på PVDF-membran med en 3-5% skummjölkslösning i TBS-T-buffert: Tris-Buffrad Koksaltlösning (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM natriumklorid) kompletterad med 0,1% av Tween 20. Håll membranet under försiktigt konstant skakning i 1 timme i rumstemperatur.
- Tvätta med TBS-T under varsamt konstant skakning i 3-5 min i rumstemperatur. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
- Späd albumin och vinculin primära antikroppar till 1:1000 respektive 1:2000 på TBS-T. Inkubera membranet med primära antikroppar över natten vid 4 °C, under försiktigt konstant skakning.
OBS: Följ alltid tillverkarens anvisningar för att späda ut antikroppar. - Avlägsna den primära antikroppen och tvätta membranet 3 gånger (steg 6.7.6). Späd ECL anti-mus IgG sekundär antikropp till 1:5000 på TBS-T. Inkubera membranet med en sekundär antikropp under försiktigt konstant skakning i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Avlägsna sekundärantikroppen och tvätta membranet (steg 6.7.6). Utför proteindetektering med hjälp av ECL Western Blotting Substrat. Exponera de autoradiografiska filmerna i 30 s till 30 min. Utför detekteringen av immunoblotting i tre exemplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utföra PK APAP-testerna i 2-OC MPS är det första steget att tillverka människans tarm- och leverekvivalenter (organoider). De är integrerade i 2-OC mikrofluidiska enheten (Bild 1A) 24 h före start av PK APAP-analysen. Nästa dag ändras mediet, och modellen utsätts för APAP. Bild 1 illustrerar tarmen och leverekvivalenter som placeras inuti 2-OC-enheten (Bild 1B) och APAP PK-experimenttidskursen (Bild 1C). Vi utförde en MTT-analys, TEER-mätningar, HCA, realtids-PCR, western blotting, histologi och konfokal fluorescensmikroskopi i 2D-odling och 3D-organoider för att kontrollera vävnadens viabilitet och upptäcka möjliga APAP-toxiska effekter. I de konfokala fluorescensmikroskopibilderna presenterades tarmekvivalentproverna som färgats med DAPI och Phalloidin (för atomkärnor respektive aktin) som en sammanhängande barriär för den icke-behandlade (figur 2A) och de 12 μM APAP-behandlade proverna (figur 2B). Som framgår av figur 2C, MTT-analysen visade relativa cellens vibilitetsnivåer över 70%, vilket indikerar frånvaron av relevanta cytotoxiska effekter som svar på APAP-exponering vid 12 μM-koncentration33,34,35,36,37. Den positiva kontrollen (100 mM) inducerade signifikant celldöd (överlevnad under 5%). Caco-2/HT-29-lönsamheten och korrekt differentiering samt tarmens ekvivalenta barriärintegritet verifierades av TEER-evolutionen under differentieringsperioden (Figur 2D). APAP orsakade ingen förändring av TEER-värdena enligt figur 2E. Uttrycket av de aktiva natrium-kopplade glukos transportörer SLC5A1, multidrug resistens transportör MDR1 och natrium-kalium ATPase analyserades, för att kontrollera APAP behandling inverkan över cellbarriärer bildas och basala funktionalitet. Som framgår av figur 2F–Hhar både icke-behandlade och APAP-behandlade tarmekvivalenter visat liknande uttryck för SLC5A1 och NaKATPase. Den orala administreringen av 12 μM APAP inducerad markerade en ökning av MDR1 mRNA-nivåerna i tarmarna ekvivalenter efter 24 h (Figur 2H). Vi utförde också HCA av cell fenotypiska förändringar av en fluorophore färgämne blandning för atomkärnor och mitokondriellt massa innehåll. Positiva kontroller var 100 mM APAP och 1% NaOH.
Dessutom analyserade vi om 12 μM APAP kunde inducera cytotoxicitet till 2D Caco-2/HT-29 samkultur. De tarmceller bilder som förvärvats med fluorescensmikroskopi som visas i figur 2I styrker MTT-data, som har visat att 12 μM APAP inte orsakade signifikant cytotoxicitet i tarmekvivalenterna Caco-2/HT-29.
Bedömningen av hepatic sfäroider basal livskraft och cytotoxiciteten som svar på 2 μM APAP gjordes av MTT analys och morfologiska analyser av confocal fluorescens mikroskopi, H & E histologi och HCA analyser. Som framgår av figur 3Akunde MTT-analysen inte identifiera någon relevant cytotoxicitet som svar på den 2 μm APA-behandlingen i prover tagna från Lever 2-OC-monteringen under både statiska och dynamiska förhållanden. Cellens livskraft minskade men förblev över 80% för både 12 h och 24 h time-points33,34,35,36,37. De positiva kontrollbehandlingarna (100 mM APAP och 1% NaOH) inducerade betydande vävnadsskador (lönsamhet under 10%). Mikroskopiska konfokala bilder visar frånvaron av ett nekrotiskt centrum i leversfäroiderna i både basala eller APAP behandlingstillstånd, och inga bevis för betydande dödstal (Figur 3B-C). Men när vi analyserade flera cellulära fenotypiska förändringar efter fordonet eller 2 μM APAP administration i 2D HepaRG/HHSteC kokultur genom HCA-analys, med hjälp av 100 mM APAP (C +) som en positiv kontroll, motsägelsefullt till resultaten av MTT-analysen, de hepatiska cellerna visat tidigt cytotoxiska svar på 2 μM APAP behandling (Figur 3D). Efter 24 h, det fanns en minskning av antalet celler, i kärnområdet och en ökning av mitokondriell massa. Dessutom användes en fluoroforefärgande cocktail som innehåller Hoechst 33342 och MitoTracker Deep Red för att fläcka 3D-hepatiska sfäroider (Figur 3J). Fiji programvara användes för att utvärdera 3D sfärisk arkitektur homogenitet bland flera sfäroider (Figur 3E–I). Grafiken som visas i figur 3E visar likheten mellan levern sfäroider totala area. Bildförhållandet (Figur 3F) runt 1 innebär en avsaknad av bias under konditoriprocessen av sfäroiderna. Utvärderingen angav också att majoriteten av sfäroiderna var ungefär avrundade (Figur 3G). Utvärderingen av omkretsen för morfologi och cellfördelning gjordes genom cirkuläritet (figur 3I) och genom soliditetsberäkning (figur 3H), respektive. Vi drog slutsatsen att metoden att konfekt lever sfäroider hade genererat organoids med en smidig omkrets, kompatibel med sfärisk tillväxt, inga fördomar eller nekros under processen.
Som visats i figur 4A-B, visade levern sfäroiderna en relativ basal hög nivå av albumin och GST mRNA uttryck respektive, som anger korrekt basala funktionalitet. Ändå framkallade 2 μM APAP-behandlingen för 24 h en minskning i albumin och GST-mRNA-uttrycksnivåerna, vilket tyder på försämring av leversfäroider funktionellt vid 24 h tidspunkt för APAP-behandling.
Detektion av cyp3a4- och UGT1A1-mRNA-uttrycksnivåerna visar levermotsvarigheterna metabolisk kapacitet. Den cyp3a4 mRNA basal nivå (figur 4C) var förenligt med tidigare rapporter6. APAP-behandlingen framkallade en trend för en minskning av både CYP3A4 mRNA och UGT1A1 uttryck som svar på APAP-behandling (Figur 4C-D) återigen bekräfta hypotesen om nedskrivningar av lever sfäroider funktionellt vid 24 h tidpunkt för APAP behandling.
Dessutom utfördes experiment av västra blotting och in vitro enzymatisk aktivitet i syfte att analysera albumin protein uttryck, liksom, den CYP 3A4 verksamhet i lever motsvarigheter på basala och vid APAP behandling villkor. Vi fann att 2 μM APAP behandling utförs vid levern 2-OC MPS, inducerad en minskning av levern motsvarande totala albumin uttryck på 12 h och 24 h time-points på både statiska (Figur 4E) och dynamiska (Figur 4F) villkor. Å andra sidan visade leverekvivalenter prover från dynamiska förhållanden en trend att presentera högre nivåer av proteinuttryck av albumin vid jämförelse med de statiska förhållandena (Figur 4G). CYP 3A4 in vitro-analys utförd vid leverekvivalenter från Lever 2-OC MPS visade att 2 μM APAP-behandling för 12 h eller 24 h kunde framkalla en robust och betydande försämring av CYP 3A4-aktivitet vid både statiska och dynamiska förhållanden (Figur 4H-I). Mer intressant, förekomsten av media flöde (dynamisk) har framkallat en betydande förbättring av lever ekvivalenter CYP 3A4 aktivitetsnivåer när man jämför med förhållanden där levern motsvarigheter hölls i frånvaro av cirkulerande medium (statiska förhållanden) (Figur 4J).
För att hitta det mest känsliga analystillståndet avseende HPLC-analys undersöktes flera parametrar inklusive sammansättningen av den mobila fasen, typ och koncentration av tillsatser. Det konstaterades att acetonitrile gav bättre kromatogram upplösning och lämplig lagringstid än metanol. Snabb och reproducerbar separation av APAP erhölls med hjälp av en C18 reversed-fas kolumn. APAP retentionstid (Rt) värdet var 9,27 ± 0,19 minuter. Selektivitet för APAP indikeras av formen och symmetrisk upplösning av toppen, liksom av bristen på störande toppar från DMEM och Williams cellkultur media.
APAP standardkoncentrationer i DMEM S och Williams E S cellodlingsmedier utspädda med ammoniumacetatbuffert (1:1, v/v) som sträcker sig från 0,25 till 100,00 μM användes för att bygga kalibreringskurvorna. Metodens linjäritet bestämdes vid nio koncentrationsnivåer. Uppgifterna framgår av tabell 2 och tabell 3. Förhållandet mellan APAP-koncentration och toppområdena beskrevs av de linjära regressionsekvationerna: y = 16106*x + 3579,8 (R2=1, i DMEM medium) och y = 16397*x + 2475,1 (R2=1, i Williams medium), i vilket "x" är APAP nominell koncentration i μM och "y" är kromatogrammet toppområdet för APAP i AU. Vid den övre kvantifieringsgränsen (dvs. 100,00 μM) var den procentuella avvikelsen och mellankörningsvariationerna mindre än 2,50%. Noggrannheten och precisionen för nio koncentrationsnivåer, exklusive 0,50 μM (LLOQ), låg inom ett godtagbart intervall med DEV- och C.V. värden som var mindre än 7,00 % (tabell 2 och tabell 3).
Analysmetoden inter- och intra-run noggrannhet och precision, vid fyra testade koncentrationer, föll inom de allmänt vedertagna kriterierna för bioanalytiska analyser. Reproducerbarheten av metoden utvärderades genom att analysera replikat av APAP kvalitetskontrollprover på 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 och 90,00 μM. De intra-run och inter-run genomsnittliga resultaten rapporteras i tabell 4. Analysens noggrannhet och precision visas av DEV-värden ≤ 15,00 % respektive C.V.-≤ 7,00 %.
LOD bestämdes som det prov vars signal-brusförhållande (S/N) var bara större än 3 och motsvarade en 0,25 μM APAP. Å andra sidan visade LLOQ, som uppskattas med 0,50 μM APAP-prover, S/N-förhållande som var lika med 10. Vidare fann vi noggrannhetsvärden (DEV%) som sträcker sig ≤ 19,00% av de nominella koncentrationsvärdena. Variabilitiesen inom- och inter-run visades av C.V. ≤ 18,77 %, vilket framgår av tabell 2, tabell 3 och tabell 4)29,30.
APAP PK-analyserna utfördes i tre olika 2-OC MPS-sammansättningar: 1) Tarm 2-OC, som innehåller tarmens motsvarighet endast; 2) Lever 2-OC, som innehåller levern sfäroider endast och 3) Tarm/Lever 2-OC med både intestinal barriär och levern sfäroider.
För absorptionsstudier efterliknades den orala vägen genom administrering av 12 μM APAP på tarmens ekvivalenta apikala sida. APAP koncentrationer mättes av HPLC/UV, i medelstora prover, samlas in från apikala och basolateral intestinala motsvarigheter sidor, i både statiska och dynamiska förhållanden. APAP-kinetiken i mediet som samlats in från de apikala och basolaterala sidorna visade att tarmmodellen kunde absorbera APAP. Det fanns en progressiv APAP-koncentration minskning i den apikala sidan (Figur 5A) samtidigt apap koncentration öka vid den intestinala basolateral sidan (Figur 5B). De maximala koncentrationerna (Cmax) i mediet var runt 2 μM för både statiska och dynamiska förhållanden, efter 12 h av administreringen (Tmax).
För metabolismstudier efterliknades den intravenösa administreringen genom applicering av 2 μM APAP i leverutrymmets medium. APAP-koncentrationskinetiken i media under både statiska och dynamiska förhållanden indikerade att endast vid de dynamiska förhållandena kunde minskningarna i APAP-koncentrationen upptäckas och nådde 0,87 μM APAP 12 h efter 2 μM APAP-administrering (T1/2 = 12 h). Leverekvivalenterna visade minimal metabolisk effektivitet under statiska förhållanden( Figur 5C). APAP-koncentrationen nådde 1,7 μM 12 h efter APAP-administrering. Den integrerade, systemiska som APAP absorption och metabolism utvärdering utfördes i den Inälvan/Lever 2-OC modell. APAP administrerades över den apikala sidan av tarmen motsvarande, efterlikna den orala vägen. Medelstora prover samlades in från båda Tarmsidorna och även från leverutrymmet. Bild 5D visar apapkoncentrationens progressiva sönderfall vid den apikala sidan i både statiska och dynamiska förhållanden.
Bild 5E visar urskiljbara absorptions- och metabolismfaser. Flödet påverkade också i tarmabsorptionen. APAP Cmax i mediet ändrades från 2 μM på "Tarmen 2-OC" (Figur 5B) montering till 1,7 μM för den dynamiska "Tarm/Lever 2-OC" (Bild 5E). Figur 5F visar en direkt jämförelse mellan apaps koncentration–tidsprofil i vårt dynamiska "Intestine/Liver 2-OC" mikrofysiologiska system (röd kurva och y-axel) och en representativ profil som erhålls hos människa efter en enda oral dos på 1000 mg (svart kurva och y axel).
Bild 1: Schematisk stegkompilering för PK-studier i 2-OC MPS. A) Schematisk ritning av 2-OC MPS, som visar tarm och lever mänskliga vävnad motsvarigheter i bottom-up vy. B) 2-OC MPS fotografi med tarm- och leverekvivalenter integrerade i enheten i nedifrån-och-upp-vy, med representativa optiska mikroskopibilder. C) Tidslinje för vävnadsekvivalenter beredning, APAP behandling, och kultur medium samlingar faser för organoid tillverkning, och farmakokinetiska och toxikologiska bedömningar. Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Bärkraft och toxikologisk bedömning av tarmekvivalenterna. A) Representativa confocal fluorescensmikroskopibilder av icke-behandlade Caco-2/HT-29 celler som färgas med cellkärnor och aktinglödtrådar fluorescerande färgämne (DAPI respektive Phalloidin); 63x Förstoring, zoom 2,6. B) Representativa confocal fluorescensmikroskopibilder av Caco-2/HT-29 celler behandlade med 12 μM APAP för 24 h, färgas med kärnor och aktin glödtrådar fluorescerande färgämne (DAPI och Phalloidin respektive); 63x Förstoring, zoom 2,6. C) Tarmen motsvarigheter viabilitet utvärdering av MTT analys i både statiska och dynamiska förhållanden. De värden som representeras av staplarna i diagrammet är procent beräknade i förhållande till fordonskontroll (tidspunkt som heter 0)*P<0,05 0 vs behandling. D) TEER evolution under de 21 dagarna av differentiering. *P<0,05 dag 1 vs andra dagar. E) TEER-värden efter APAP-administrering in i Tarmen 2-OC MPS under dynamiska förhållanden. Genuttryck i tarmar motsvarigheter. Tarmbarriärens absorptionspotential och möjliga effekter av 12 μM APAP för 24 h under dynamiskt tillstånd kontrollerades av SLC5A1 (F), Na-K-ATPase (G) och MDR1 (H) uttryck. Värden representerar medelvärdet ± SEM av tre oberoende experiment. Resultatet uttrycks som ett förhållande till hushållning GAPDH. *P<0,05 fordon vs APAP. I) Operett bildbaserade HCA utförs av Columbus® 2.4.0. Programvara. Representativa bilder av 2D-tarmen kokultur i olika tidspunkter efter 12 μM APAP behandling. Negativa kontroller var medelhöga (0 h) eller fordon (0,5% etanol). Positiva kontroller som visas här är 100 mM APAP. Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Genom- och toxikologisk bedömning av leverekvivalenter. A) Lever motsvarigheter viabilitet utvärdering av MTT analys i både statiska och dynamiska förhållanden. De värden som representeras av staplarna i diagrammet är procent beräknade i förhållande till fordonskontroll (tidspunkt som heter 0) *P<0,05 0 vs behandling. B) Representanter confocal bilder tagna från fordonet och 2 μM APAP 24 h behandlade lever sfäroider från en inre sektion. C) Representanter H&E (hematoxylin och eosinfärgning) bilder tagna från fordonet och 2 μM APAP 24 h behandlade leversfäroider från en inre sektion. Skala bar = 50 μm. D) Representativa bilder av 2D lever co-kultur i olika tidspunkter efter 2 μM APAP behandling. Prover som behandlades med fordon och med 2 μM APAP övervägdes i dessa analyser. Fluoroforfärgblandningen inkluderar Hoechst för nukleär färgning och Mitotracker Deep Red för mitokondrierna massfärgning. Negativa kontroller var medelhöga (0 h) eller fordon (0,5% etanol). Positiva kontroller var 100 mM APAP. Mätningar av hela sfäroider bilder tagna utfördes med hjälp av Fiji programvara. E) Frekvensfördelningar av området F ) bildförhållande, G) rundhet, H) soliditet, I) cirkuläritet. N = 85. *p < 0,05. J) Representativa bilder av 3D lever sfäroider förvärvats av Operett med hjälp av LWD 10x objektiv. Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Leverns viabilitet/funktionalitet och möjliga effekter av 2 μM APAP under statiska och dynamiska förhållanden över den verifierades genom gen- och proteinuttryck och genom enzymatisk aktivitet. A) albumin genuttryck. B) GSTA2 genuttryck. Lever förmåga att utföra fas I och fas II metabolism och möjliga effekter av 2 μM APAP för 24 h under dynamiskt tillstånd över det kontrollerades genom genuttryck av CYP3A4 (C) och genom UGT1A1 (D) respektive. E) Totalt albuminproteinuttryck under statiskt tillstånd. F) Totalt albuminproteinuttryck under dynamiska förhållanden. Villkor. G) Jämförande graf som illustrerar skillnaden i totalt albuminuttryck i leverekvivalenter som odlas och behandlas under statiska eller dynamiska förhållanden. H) CYP 3A4 in vitro enzymatisk aktivitet under statiska förhållanden. I) CYP 3A4 in vitro enzymatisk aktivitet under dynamiska förhållanden. J) Jämförande graf som illustrerar skillnaden i CYP 3A4-aktivitet i leverekvivalenter som odlas och behandlas under statiska eller dynamiska förhållanden. Värden representerar medelvärdet ± SEM av tre oberoende experiment. Datan av genuttryck uttrycks som ett förhållande till hushållning GAPDH. Datan av proteinuttryck uttrycks som ett förhållande till vinculinprotein. *P<0,05 fordon vs APAP-behandling. Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Analyser av APAP-farmakokinetik i 2-OC MPS. APAP-absorptionsprofil efter 12 μM APAP-administrering vid den apikala sidan av tarmen 2-OC MPS-preparatet. Tarmbarriären gjordes av en kokultur av Caco-2/HT-29 cellinjer (A) Statiska och dynamiska APAP-koncentrationer i mediet från den apikala sidan (som representerar den mänskliga intestinala lumensidan). (B) Statiska och dynamiska APAP-koncentrationer i mediet från den basolaterala sidan (som representerar den humana tarmblodströmsidan). *P<0,05 statiska vs dynamiska förhållanden. C) APAP metabolism profil i levern 2-OC MPS av HepaRG/HHSTeC lever sfäroider. Jämförelse av statiska och dynamiska förhållanden efter en 2 μM APAP-administrering i mediet. *P<0,05 0h mot 6 h, 12 h och 24 h APAP-behandling. APAP absorption och metabolism profil efter 12 μM administration på tarmbarriären apikala sidan av tarm/lever 2-OC MPS preparatet. Detta emulerar den muntliga vägen. Tarmbarriären gjordes av Caco-2/HT-29 cellinjer och lever motsvarande gjorda av sfäroider av HepaRG/HHSTeC cellinjer. (D) Tarm/Lever 2-OC APAP koncentrationer i den apikala sidan av tarmbarriären under statiska och dynamiska förhållanden. (E) Tarm/Lever 2-OC APAP koncentrationer i mediet under statiska och dynamiska förhållanden. *P<0,05 statiska vs dynamiska förhållanden. (F) Jämförelse mellan apap-enhetens koncentration–tidsprofil i vårt mikrofysiologiska system (röd kurva och y-axel) och en representativ profil som erhålls på människor efter en oral engångsdos på 1000 mg (svart kurva och y-axel). Data extraherades från tomter med hjälp av WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| HPLC-systemet | Waters Alliance 2695 (Milford, MA, USA), utrustad med kvartärpump, provansvarig och degasser | ||
| Detektor | Vatten 2996 Uv-Vis som i 210-400 nm räckvidd | ||
| Systemkontroll, datainsamling och bearbetning | Waters Empower 2002 kromatografi programvara | ||
| Kolumn | Omvänd-fas Luna C18 | ||
| (150 x 4,6 mm I.D.; 5mm partikelstorlek) | |||
| Phenomenex | |||
| Vakt kolumn | Omvänt-fas Luna C18 (4 x 3 mm) | ||
| Phenomenex | |||
| Mobil fas | Lösningsmedel A- Acetonitril | ||
| Lösningsmedel B- 0,10 M ammoniumacetat, pH 6,8 | |||
| Isokratiska förhållanden | Tid | A (%) | B (%) |
| (min.) | |||
| 15 | 5 | 95 | |
| Flöde | 1,0 mL/min | ||
| Injektionsvolym | 25 μL | ||
| Temperatur | 25 °C | ||
| APAP-identifiering | UV @ 243 och 254 nm | ||
| Körtid | 15 minuter | ||
Tabell 1: Förhållanden och parametrar som skall användas för HPLC-UV analyser av APAP i odlingsmediet matriser.
| Nominell koncentration | Beräknad APAP-koncentration (μM) | Medelvärde (μM) | S.D.b | C.v. | Dev | |||||
| (μM) | (Triplicate av varje koncentration) | (μM) | (%)c | (%)d | ||||||
| Analystal | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| 0,25 (LOD) | 0.02 | 0.08 | 0.21 | 0.14 | 0.08 | 0.27 | 0.13 | 0.11 | 84.96 | + 46,05 |
| 0,50 (LLOQ) | 0.31 | 0.36 | 0.29 | 0.47 | 0.42 | 0.65 | 0.41 | 0.05 | 12.72 | + 17,08 |
| 1.00 | 0.87 | 0.87 | 0.80 | 1.04 | 1.02 | 1.01 | 0.93 | 0.04 | 3.76 | + 6,65 |
| 2.50 | 2.44 | 2.61 | 2.52 | 2.42 | 2.56 | 2.54 | 2.52 | 0.04 | 1.54 | -0.62 |
| 5.00 | 5.02 | 4.99 | 5.06 | 5.01 | 5.01 | 5.05 | 5.02 | 0.09 | 1.88 | -0.45 |
| 10.00 | 10.21 | 10.13 | 9.96 | 10.25 | 10.08 | 10.21 | 10.14 | 0.10 | 0.97 | -1.41 |
| 25.00 | 25.33 | 25.28 | 25.20 | 25.13 | 25.14 | 24.92 | 25.17 | 0.36 | 1.45 | -0.67 |
| 50.00 | 50.30 | 50.04 | 50.51 | 49.70 | 49.98 | 49.19 | 49.95 | 0.86 | 1.71 | +0,09 |
| 100.00 | 99.75 | 99.90 | 99.70 | 100.09 | 99.97 | 100.40 | 99.97 | 0.69 | 0.69 | +0,03 |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 0.9999 | 1.00 | 1.00 | 0.9999 | ||||
Tabell 2: Inter-run variation – noggrannhet, precision, och linjäritet av standard kurvan prover framställs i en blandning av DMEM medium med 0,10 M ammoniumacetat buffert (1:1, v / v) från sex separata analyser. ett
ett En linjär kurva monterades på data för ett svar (APAP) kontra teoretisk koncentration enligt beskrivningen i Experimental. Den beräknade koncentrationen härleddes från att avläsa responsen för varje standardprov mot kalibreringskurvan. Varje post (analys 1-6) motsvarar det genomsnittliga värdet av tre exemplar analys.
b SD= Standardavvikelse.
c. C.V. (variationskoefficient. precision).
d. Noggrannhet (DEV %) = avvikelsen för den beräknade koncentrationen från det nominella värdet.
Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).
| Nominell koncentration | Beräknad APAP-koncentration (μM) | Genomsnittliga | S.D.b | C.v. | Dev | ||||
| (μM) | (Triplicate av varje koncentration) | (μM) | (μM) | (%)c | (%)d | ||||
| Analystal | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||
| 0,25 (LOD) | 0.34 | 0.12 | 0.30 | 0.16 | 0.00 | 0.18 | 0.08 | 45.46 | +26,03 |
| 0,50 (LLOQ) | 0.36 | 0.44 | 0.49 | 0.43 | 0.40 | 0.43 | 0.02 | 5.84 | +14,97 |
| 1.00 | 0.87 | 0.98 | 1.04 | 0.94 | 0.83 | 0.93 | 0.04 | 4.67 | +6,85 |
| 2.50 | 2.41 | 2.46 | 2.49 | 2.52 | 2.43 | 2.46 | 0.06 | 2.39 | +1,56 |
| 5.00 | 5.00 | 4.99 | 5.12 | 5.10 | 5.14 | 5.07 | 0.15 | 3.00 | -1.38 |
| 10.00 | 10.08 | 10.01 | 9.93 | 10.10 | 10.29 | 10.08 | 0.18 | 1.80 | -0.81 |
| 25.00 | 25.14 | 25.18 | 24.96 | 25.32 | 25.35 | 25.19 | 0.45 | 1.78 | -0.76 |
| 50.00 | 50.19 | 50.23 | 49.83 | 49.56 | 50.17 | 49.99 | 0.87 | 1.75 | +0,01 |
| 100.00 | 99.87 | 99.84 | 100.10 | 100.13 | 99.80 | 99.95 | 2.12 | 2.12 | +0,05 |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | ||||
Tabell 3: Inter-run variation – noggrannhet, precision, och linjäritet av standard kurvan prover framställs i en blandning av Williams medium med 0,10 M ammoniumacetat buffert (1:1, v / v) från sex separata analyser. ett
ett En linjär kurva monterades på data för ett svar (APAP) kontra teoretisk koncentration enligt beskrivningen i Experimental. Den beräknade koncentrationen härleddes från att avläsa responsen för varje standardprov mot en kalibreringskurva. Varje post (analys 1-5) motsvarar det genomsnittliga värdet av tre exemplar analys.
b SD= Standardavvikelse.
c. C.V. (variationskoefficient. precision).
d. Noggrannhet (DEV %) = avvikelsen för den beräknade koncentrationen från det nominella värdet.
Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).
| Williams medel | Nominell koncentration | Uppmätt koncentration | S.d. | C.v. | Dev |
| (μM) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | |
| Intra-run (n=3) | 0,50 (LLOQ) | 0.49 | 0.08 | 15.55 | +1,77 |
| 4.50 | 4.59 | 0.23 | 5.10 | -2.06 | |
| 45.00 | 41.23 | 0.76 | 1.85 | +8,37 | |
| 90.00 | 82.29 | 1.75 | 2.13 | +8,57 | |
| Inter-run (n=15) | 0,50 (LLOQ) | 0.43 | 0.05 | 10.99 | +14,97 |
| 4.50 | 4.37 | 0.19 | 4.42 | +2,99 | |
| 45.00 | 42.35 | 0.82 | 1.93 | +5,88 | |
| 90.00 | 85.22 | 2.25 | 2.65 | +5,31 | |
| DMEM medel | Nominell koncentration | Uppmätt koncentration | S.d. | C.v. | Dev |
| (μM) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | |
| Intra-run (n=3) | 0,50 (LLOQ) | 0.47 | 0.09 | 18.77 | +6,35 |
| 4.50 | 4.45 | 0.30 | 6.63 | +1,04 | |
| 45.00 | 44.24 | 1.59 | 3.58 | +1,69 | |
| 90.00 | 86.40 | 4.09 | 4.73 | +4.00 | |
| Inter-run (n=12) | 0,50 (LLOQ) | 0.46 | 0.08 | 17.81 | +7,75 |
| 4.50 | 5.16 | 0.27 | 5.31 | -14.68 | |
| 45.00 | 48.99 | 2.10 | 4.29 | -8.86 | |
| 90.00 | 96.18 | 4.47 | 4.65 | -6.86 | |
Tabell 4: Intra- och inter-run precision och noggrannhet för APAP i kvalitetskontrollprover. ett
ett Uppgifterna visas som medelvärden. SD (standardavvikelse). C.V. (variationskoefficient. precision) och noggrannhet (procents avvikelse. DEV%).
Denna siffra har modifierats från Marin et al. Acetaminophen absorption och metabolism i en tarm/lever microphysiological system. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).
| Primer (5' → 3') | |||||
| Vävnad | Gen | Framåt | Omvänd | ||
| Tarmen | SGLT1/SLC5A1 | gAgCCCAgCAACTgTCCCAC | CAggCTCCAACACAgACggT | ||
| NA-K-ATPase | ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC | CAgCggTCATCCCAgTCC | |||
| MDR1 | TggATgTTTCggTTTggAg | TgTgggCTgCTgATATTTTgg | |||
| Lever | Albumin | TgCAAggCTgATAAggAg | TTTAgACAgggTgTTTggCTTTACAC | ||
| GSTA2 | CTgAggAACAAgATgCCAAgC | AgcAgAgggaaggCTggaAATAAg | |||
| CPY3A4 | ggAAggTggACCCAgAAACTgC | TTACggTgCCATCCCTTgAC | |||
| UGT1A1 | ATgCAAAgCgCATggAgAC | ggTCCTTgTgAAAggCTggAg | |||
Tabell 5: QPCR-primers i realtid för att utvärdera gentranskription på mRNA-nivå i 2-OC-kulturerna för tarm- och levervävnader
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den exakta och tillförlitliga bedömningen av de undersökande nya läkemedlens farmakologiska egenskaper är avgörande för att minska risken i följande utvecklingssteg. MPS är en relativt ny teknik, som syftar till att förbättra den prediktiva kraften och minska kostnaderna och tiden med prekliniska tester. Vår grupp avancerar i bedömningen av farmakokinetiska och toxikologiska egenskaper som främst behövs för blyoptimering. Vi arbetade med 2-OC mikrofluidiska enheten, som har två kammare, vilket möjliggör integration av två organoider. APAP valdes eftersom det har gott om högkvalitativa mänskliga data, är mestadels metaboliseras av levern, och visar också hepatoxiska egenskaper. Studieprotokollet syftade till att efterlikna vissa steg i den kliniska studien för humanfas I, där ett läkemedel administreras oralt till frivilliga, och periodiska blodprover dras för att bedöma läkemedlens koncentration för att känna till de farmakokinetiska egenskaperna och biokemiska och kliniska parametrar samlas in för att bedöma säkerheten och tolerabiliteten. Därför, när MPS utvecklas tillräckligt för att ge tillförlitliga förutsägelser, kommer det att avsevärt minska risken för fel i fas I-prövningen. Genom att lägga till sjukdomsmodellerna i framtiden kommer det eventuella samma antagandet att gälla för de kliniska prövningarna av faser II och III.
Alla studier utfördes i tre modeller: Tarmen 2-OC (APAP oral administrering), Lever 2-OC (Intravenös administrering), och Tarm/Lever 2-OC (oral administrering). Den första modellen isolerade absorptionen, den andra metabolismen, och den tredje integrerade båda. Vi producerade först organoiderna och införlivas i den mikrofluidiska enheten, andra administreras APAP och samlade in media prover, och senast utfört en uppsättning tester för att bedöma cellens livskraft och funktionalitet och toxikologiska effekten av APAP exponering. För de farmakokinetiska studierna utvecklade och validerade vi en kromatografisk metod för APAP-kvantifiering i mediet. Valideringen följde riktlinjen om bioanalytisk metod Validering avseende specificitet, linjäritet, kvantifieringsgränsen (LOQ), gränsen för detektion (LOD), matriseffekt, precision och noggrannhet, enligt fda29,30. Specificiteten fastställdes med tomma, poolade och enskilda biologiska prover från två olika källor. Metoden utfördes på ett acceptabilitetssätt under analysen, och data bekräftade förmågan hos en enkel isokratisk mobil fas att separera och kvantifiera APAP.
Livsdugligheten/funktionellt i tarmen och leverorganoider bedömdes med olika tekniker. För tarmekvivalenten kunde man konstatera den konfokala fluorescensmikroskopin (Figur 2A-B), MTT-analysen (Figur 2C), genuttrycksbedömning (figur 2D-F) eller HCA-experiment, inte påvisa någon toxicitet 24 h efter APAP-exponering. Likaså upptäckte MTT analys inte giftiga förolämpningar framkallas av APAP i levern motsvarigheter (Figur 3A). HCA-tekniken lade dock till möjligheten att upptäcka mycket tidiga toxiska händelser (24 h efter APAP-exponering) för leverceller, genom observation av cellens fenotypiska förändringar, med några mekanistiska ledtrådar (Figur 3D). Däremot visade sig den konfokala fluorescensmikroskopin (figur 3B) och histologi (figur 3C) vara ett användbart kompletterande verktyg vid undersökningen av livsduglighetsstatus för den mänskliga vävnadens motsvarigheter. För levercellerna var samtidig användning av olika tekniker mycket fördelaktig. MTT-analysen, som tidigare nämnts, kunde inte upptäcka den APAP-cytotoxicitet som upptäcktes av HCA 24 h efter APAP-exponering. Genuttrycksanalyserna bedömde tarmens funktionalitet (Figur 2D-F) och leverorganoider (Figur 4A-D) vid både basal och 24 h efter APAP-behandling. Under basala förhållanden fanns normala nivåer av intestinala och leverspecifika markörer, vilket tyder på korrekt funktionalitet. Efter 24 h av APAP exponering, det fanns en nedreglering av albumin, GST mRNA nivåer och en tendens att minska cyp3A4 genen uttryck i levern motsvarande vävnader, som anger APAP tidig cytotoxicitet. Styrker dessa resultat, western blotting experiment visade att minskningen av genuttryck var också åtföljs av en robust minskning av levern totala albumin protein uttryck som svar på APAP behandling (Figur 4E-F), bekräftar de giftiga förolämpningar som ålagts levervävnad genom exponering för APAP. Följaktligen visade experiment av in vitro enzymatisk aktivitet en robust och progressiv minskning av CYP 3A4 aktivitetsnivåer framkallas genom APAP behandling, i lever ekvivalenter (Figur 4H-I).
Morfometrisk statistik av organoider utfördes på Bild J (Bild 3E-I). Området avslöjar hur nära 2D-storleken är att alla organoider analyseras, som skulle kunna användas som standardisering i detta protokoll så att ett opartiskt resultat kan produceras. "Formbeskrivare" avslöjar statistik som motsvarar exakt formen morfologi. Bildförhållandet är ett index som använder den stora och mindre axeln, så resultat runt 1 indikerar ingen bias (dvs. förmånstillväxt) under organoidbildning. Värden på Roundness (4 ×[område]/ (π × [större axel]2)) är mycket känsliga för en förmånlig tillväxt, vilket skulle avslöjas som en större axel. Soliditet ([område]/ ([konvext område])) är väsentligt för att visa grov morfologi eftersom den inte påverkas av ojämnheter i gränser eftersom den använder konvext område (=kuvert). Fördelningar centrerade runt 1.0 indikerar putative sfärisk tillväxt. Omvänt, Cirkuläritet (4× π [område]/[perimeter]2) är mycket känslig för en komplex omkrets, så "hålrum" eller "fickor" skulle påverka detta index. Således, circularity runt 1 bekräftar också förmodade sfärisk tillväxt, kompatibel med korrekt organoid funktionalitet.
Analysresultaten visade att mps kunde emulera APAP absorptionen och ämnesomsättningsegenskaperna, både isolerade eller integrerade i en kurva som var jämförbar med den som producerades in vivo (Figur 5F) utan utsöndringsfasen. APAP absorptionen var liknande efter oral administrering både Tarmen MPS eller Tarmen / Lever MPS-modeller, under både statiska och dynamiska förhållanden (Figur 5A-B, Figur 5D-E). I båda, det fanns en APAP koncentration minskar vid apikala sidan samtidigt till dess ökning vid basolateral sidan, med någon signifikant skillnad för statiska och dynamiska förhållanden. Däremot apap hepatic metabolism skilde sig under dessa förhållanden. De cirkulerande medierna i MPS tycktes förbättra den organoida metaboliska förmågan (Figur 5C och figur 5E). det fanns en betydande APAP förfall underflöde inte sett utan flöde. Intressant, in vitro, CYP3A4 aktivitet experiment styrker hypotesen att förekomsten av flöde i systemet ökar funktionaliteten hos mänskliga lever motsvarigheter. Som framgår av grafen i figur 4J, var aktiviteten hos CYP 3A4 signifikant högre hos leverekvivalenter som bibehållits under flöde vid både basala behandlingstillstånd och APAP-behandlingstillstånd. På samma sätt visade leverekvivalenter hålls under flöde (dynamisk) en tendens att öka proteinuttryck av albumin vid jämförelse med de som hålls utan flöde (statisk) både vid baslinjen eller vid APAP behandlade förhållanden (Figur 4G).
Vid jämförelse med profilen för koncentrationstid efter oral administrering av APAP till människa, visar vårt mikrofysiologiska system mycket större t1/2 (halveringstid) (Figur 5F). Detta händer, som tidigare nämnts, eftersom medan vi har ett två-organ system med tarmen och lever ekvivalenter som kan absorbera och metabolisera läkemedlet, det finns ingen njure motsvarande utsöndra APAP och dess metaboliter frånplasmafacket 38. Utöver det visar det mikrofysiologiska systemet mindre Cmax (plasmakoncentration med toppar) och större tmax (tid att nå Cmax) än vad som typiskt observeras för människor (Figur 5F). Detta är en följd av skillnaderna i skalan av in vitro- och in vivo-experimenten. Sammantaget finns det tre huvudsakliga skillnader mellan den koncentration–tidsprofil som erhålls med hjälp av det mikrofysiologiska systemet och profiler som erhållits efter oral administrering av APAP till människa: större t1/2, mindre Cmax och större tmax (Figur 5F). Medan den större t1/2 beror på frånvaron av en njure motsvarande utsöndra APAP och dess metaboliter från plasma motsvarande, mindre Cmax och större tmax är konsekvenserna av den lilla skalan av experimentet när jämfört med den mänskliga kroppen. De bästa skalningsstrategierna för att bygga och driva mikrofysiologiska system är fortfarande ett aktivt forskningsområde och det är osannolikt att ett enda tillvägagångssätt är optimalt för alla system39. Dessutom kan matematisk modellering eller maskininlärning användas för att tillämpa korrigeringar eller lära sig mappningen från mikroskalan till full skala för att extrapolera in vitro-data som erhållits med de mikrofysiologiska systemen till in vivo-beteendet som observerats hos människor40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar till Dr Christie Guguen-Guillouzo, Dr Philippe Gripon på Unit 522 INSERM och till Dr Christian Trepo vid Enhet 271 INSERM för användning av det biologiska materialet (Hepa RG celler) och för att göra sedan tillgängliga för oss för att kunna utföra den akademiska forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R.
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F.
- Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
- Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
- OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
