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Chemistry

Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Wir haben ein mikrophysiologisches System (MPS) mit Darm- und Leberorganoiden Acetaminophen (APAP) ausgesetzt. Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Organoidproduktion und APAP pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaftenbewertungen im MPS. Es beschreibt auch die Gewebefunktionsanalysen, die notwendig sind, um die Ergebnisse zu validieren.

Abstract

Die kürzlich eingeführten mikrophysiologischen Systeme (MPS), die humane Organoide kultivieren, sollen in der präklinischen Testphase des Arzneimittelentwicklungsprozesses besser abschneiden als Tiere, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. In dieser Studie wurden die menschliche Darmbarriere (emuliert durch eine Kokultur von Caco-2- und HT-29-Zellen) und das Leberäquivalent (emuliert durch Sphäroide aus differenzierten HepaRG-Zellen und humanen Hepatic Stellate-Zellen) in einen Zwei-Organ-Chip (2-OC) mikrofluidischen Gerät integriert, um einige Acetaminophen (APAP) pharmakokinetische (PK) und toxische Eigenschaften zu bewerten. Die MPS hatte drei Baugruppen: Darm nur 2-OC, Leber nur 2-OC, und Darm/Leber 2-OC mit dem gleichen Medium durchdringen beide Organoide. Für PK-Bewertungen dosierten wir das APAP in den Medien zu voreingestellten Zeitpunkten, nachdem wir es entweder über die Darmbarriere (Emulierung des oralen Weges) oder in den Medien (Emulierung des intravenösen Weges) verabreicht hatten, auf 12 m bzw. 2 m. Die Medienproben wurden mittels umgekehrter Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Organoide wurden auf Genexpression, für TEER-Werte, auf Proteinexpression und -aktivität analysiert und dann gesammelt, fixiert und einer Reihe morphologischer Auswertungen unterzogen. Die MTT-Technik schnitt bei der Beurteilung der Organoid-Lebensfähigkeit gut ab, aber die Hochgehaltsanalysen (HCA) konnten sehr frühe toxische Ereignisse als Reaktion auf die APAP-Behandlung erkennen. Wir haben überprüft, dass der Medienfluss die APAP-Absorption nicht signifikant beeinflusst, während er die Leberäquivalentfunktionalität erheblich verbessert. Die aPAP menschliche Darmabsorption und Leberstoffwechsel könnte im MPS emuliert werden. Die Verbindung zwischen MPS-Daten und der Silico-Modellierung hat ein großes Potenzial, die Vorhersehbarkeit der In-vitro-Methoden zu verbessern und eine bessere Genauigkeit als Tiermodelle in pharmakokinetischen und toxikologischen Studien zu bieten.

Introduction

Aufgrund genomischer und proteomischer Unterschiede haben Tiermodelle einen begrenzten Vorhersagewert für mehrere menschliche Ergebnisse. Darüber hinaus sind sie zeitaufwändig, teuer und ethisch fragwürdig1. MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und zeitaufwand für präklinische Tests zu reduzieren. Sie sind mikrofluidische Geräte, die Organoide (künstliche Mimetik-Funktionseinheiten von Organen) unter Medienfluss kultivieren, die organoid-organoide Kommunikation fördert. Organoide aus menschlichen Zellen erhöhen die translationale Relevanz2,3,4. Es wird erwartet, dass MPS besser abschneidet als die Tierversuche, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. Wenn das MPS voll funktionsfähig ist, liefert es aussagekräftigere Ergebnisse bei höherer Geschwindigkeit und niedrigeren Kosten und Risiken4. Viele Gruppen entwickeln MPS für mehrere Zwecke, vor allem Krankheitsmodelle, um die Wirksamkeit des Medikaments zu testen.

Expositionsniveau ist einer der kritischsten Parameter für die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln5,6,7,8,9,10,11,12. MPS ermöglicht eine organoide Integration, die eine systemische Exposition emuliert und eine bessere Leistung als die traditionelle 2D-Gewebekultur erwartet. Diese Technologie kann die Vorhersage der zusammengesetzten Darmabsorption und Desleberstoffwechsel deutlich verbessern4.

Ein MPS, das menschlicheäquivalente Modell von Darm und Leber integriert, ist ein guter Ausgangspunkt, wenn man die zentrale Rolle dieser beiden Organe bei der Bioverfügbarkeit von Medikamenten und der systemischen Exposition13,14,15betrachtet. APAP ist ein attraktives Medikament für das Studium eines MPS ohne Nierenäquivalent, weil seine Metabolisierung vor allem von der Leber16,17erfolgt.

Das 2-OC ist ein zweikammeriges mikrofluidisches Gerät, das für die Kultur von zwei verschiedenen menschlichen Äquivalentgeweben/Organoiden geeignet ist, die durch Mikrokanäle16miteinander verbunden sind. Um eine orale/intravenöse Verabreichung eines Arzneimittels beim Menschen in vitro zu emulieren und die Auswirkungen des Kreuzgesprächs zwischen Darm- und Leberäquivalenten auf die APAP-Pharmakokinetik zu bewerten, wurden neben der Funktionalität und Lebensfähigkeit der Organoide drei verschiedene MPS-Baugruppen durchgeführt: (1) ein "Darm 2-OC MPS", das aus einem Darmäquivalent besteht, das in einem Kultureinsatz basiert, der eine Kokultur von Caco-2 + HT-29-Zellen enthält; (2) ein "Liver 2-OC MPS" bestehend aus Lebersphäroiden aus HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells), die in das 2-OC-Gerät integriert sind; und (3) ein "Darm/Leber 2-OC MPS" bestehend aus dem Darmäquivalent in einem Gerätefach, das durch den Medienfluss durch die mikrofluidischen Kanäle mit dem Leberäquivalent im anderen kommuniziert.

Alle Assays wurden unter statischen (keinen Durchfluss) und dynamischen (mit Strömung) Bedingungen aufgrund der Auswirkungen der mechanischen Reize (Kompression, Dehnung und Scherung) auf die Zelllebensfähigkeit und Funktionalitäten18,19,20durchgeführt. Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll für die APAP-Oral-/Intravenous-Verabreichungsemulation und die jeweiligen Absorptions-/Stoffwechsel- und toxikologischen Analysen in der 2-OC-MPS, die menschliche Darm- und Leberäquivalentmodelle enthält.

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Protocol

1. Herstellung von Gewebeäquivalenten für den Anbau im 2-OC

  1. Dünndarmbarriere äquivalente Produktion
    1. Erhalten Sie Caco-2- und HT-29-Zellen mit dem Darmäquivalentmedium: DMEM ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin und Streptomycin und 1% nicht essentiellen Aminosäuren, die in diesem Manuskript als "DMEM S" bezeichnet werden.
    2. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie zweimal mit 1x DPBS und fügen Sie 8 ml 0,25% Trypsin/EDTA hinzu, um Caco-2-Zellen, die in Zellkulturkolben angebaut werden, zu dissoziieren (175 cm2). Inkubieren Sie für 5 min bei 37 °C und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie mindestens das doppelte Volumen des Trypsin-Inhibitors hinzufügen. Führen Sie das gleiche Verfahren für HT-29-Zellen durch, indem Sie die Reagenzvolumina anpassen, da eine kleinere Menge dieser Zellen benötigt wird und sie in kleineren Kolben (75 cm2)gehalten werden.
    3. Zentrifugieren Sie bei 250 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen und setzen Sie die Zellpellets in 10 ml DMEM S. Count-Zellen wieder auf, wodurch eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 80 % erreicht wird. Aseptisch integrieren Zellkultureinsätze in einer 24-Well-Platte, die zuvor mit 400 l DMEM S pro Brunnen in der basolateralen Seite gefüllt war (die den menschlichen Blutkreislauf darstellt).
    4. Kokultivieren Sie Caco-2- und HT-29-Zellen im Verhältnis 9:121. Verwenden Sie 2,25 x 105 Caco-2 und 2,5 x 104 HT-29 Zellen zu jedem Darmäquivalent in einem Endvolumen von 200 l DMEM S. Passen Sie die Zellzahlen und das Volumen an die gewünschte Anzahl von Organoiden an. Mischen Sie sorgfältig.
    5. Pipette 200 l Zelllösung in die apikale Seite jedes Inserts (die die menschliche Darmlumenseite darstellt), sät 250.000 Zellen pro Einsatz. Die Zellen in den Einsätzen drei Wochen lang mitkultivieren22. Wechseln Sie das Medium mindestens dreimal pro Woche, indem Sie es sowohl von der apikalen als auch von der basolateralen Seite mit einer sterilen Pasteur-Pipette ansiedeln und darauf achten, die intakte Zellbarriere nicht zu beschädigen.
      HINWEIS: Fahren Sie mit der Aspiration auf der apikalen Seite fort, um die Zellbarriere nicht zu berühren (Aspirat durch Unterstützung der Pasteur-Pipette am Kunststoffrand des Zelleinsatzes).
    6. Überprüfen Sie die enge Monolayer-Bildung, indem Sie den TEER (transepitheliale elektrischen Widerstand) alle drei Tage mit einem Voltmeter23messen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
      1. Führen Sie einen Rohling aus, indem Sie den Widerstand über einen Zellkultureinsatz ohne Zellen, jedoch mit demselben Zellmedium und an derselben Zellplatte messen.
      2. Berechnen Sie den Gewebewiderstand, indem Sie den Rohlingswiderstand von der gewebeäquivalenten Resistenz subtrahieren, und multiplizieren Sie mit der effektiven Oberfläche der Filtermembran (0,6 cm2). Eine gute Darmbarriereresistenz liegt im Bereich von 150 bis 400 Ω cm2.
        HINWEIS: Nach 21 Tagen müssen die Zellen vollständig differenziert und die Darmbarriere gebildet werden, damit die Darmäquivalente bereit sind, in MPS integriert zu werden.
  2. Leberäquivalente Produktion
    1. Pflegen Sie HepaRG-Zellen mit dem Leberäquivalentmedium, das Williams Medium E ist, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 5 g/ml Humaninsulin und 5 x 10-5 M Hydrocortison und heißt in diesem Manuskript "Williams E S". Erneuern Sie HepaRG-Medien alle 2-3 Tage und pflegen Sie die Zellkultur für zwei Wochen, um die Differenzierung in Hepatozyten und Cholangiozyten einzuleiten.
    2. Nach den ersten zwei Wochen 2% DMSO für weitere zwei Wochen zu HepaRG hinzufügen, um die Zelldifferenzierung24,25zu vervollständigen. Wachsen Sie HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), mit Poly-L-Lysin-beschichteten Zellkulturkolben, die Medien alle zwei oder drei Tage wechseln.
    3. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie zweimal mit 1x DPBS und fügen Sie 8 ml 0,05% Trypsin/EDTA hinzu, um HepaRG-Zellen zu dissoziieren, die in Zellkulturkolben (175 cm2)angebaut werden. Inkubieren Sie für 5 bis 10 min bei 37 °C und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie mindestens das Doppelte des Volumens des Trypsin-Inhibitors hinzufügen. Führen Sie das gleiche für HHSTeC durch, das Reagenzvolumen anzupassen, da eine kleinere Menge dieser Zellen benötigt wird und sie in kleineren Kolben (75 cm2)gehalten werden können.
    4. Zentrifugieren Sie beide bei 250 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellpellets in Williams E S Medium wieder auf. Zählen Sie Zellen, um eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 80 % zu gewährleisten.
    5. Generieren Sie die Lebersphäroide, die HepaRG- und HHSTeC-Zellen im Verhältnis 24:1 bzw. in Williams E S medium16kombinieren. Fügen Sie 4,8 x 104 differenzierte HepaRG und 0,2 x 104 HHSTeC hinzu, um jedes Lebersphäroid von 50.000 Zellen in einem Volumen von 80 l zu komponieren. Mischen Sie sorgfältig.
    6. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 80 l des kombinierten Zellpools in jedem Brunnen von 384 Sphäroid-Mikroplatten aus, die eine runde Bodengeometrie aufweisen.
      HINWEIS: Nach vier Tagen bilden sich Sphäroide von ca. 300 m.
    7. Übertragen Sie die Lebersphäroide mit Weitbohrspitzen auf ultra-low-attachment 6 Well-Platten, was die erforderliche "Eins-für-Eins"-Zählung ermöglicht.

2. Integration von Darm- und Leberäquivalenten in ein 2-OC MPS

  1. Darm 2-OC MPS-Baugruppe für Absorptionstest
    1. Pipette 500 l DMEM S in das größere Fach von 2-OC und 300 l im kleineren. Aspirieren Sie die basolateralen und apikalen Medien jedes Darmbarriereäquivalents in den 24 Brunnenplatten. Integrieren Sie mit sterilen Zangen einen Einsatz pro 2-OC-Schaltung speziell in das größere Fach. Tragen Sie 200 l des Darmmediums an der apikalen Seite auf.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, wenn Sie die Organoide in das MPS integrieren.
    2. Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an, das an eine Druckluftzufuhr angeschlossen werden muss. Stellen Sie die Parameter ein: einen Druck von ca. ±300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hz. Starten Sie den Durchfluss 24 h vor der Verabreichung der Prüfsubstanz. Führen Sie am nächsten Tag die APAP-Behandlung durch.
  2. Leber 2-OC MPS-Baugruppe für Stoffwechsel-Assay
    1. Pipette 650 l von Williams E S in das große Fach und 350 l in das kleinere Fach, das die Sphäroide erhält. In den ultra-low-attachment 6 WellPlatten, zählen Sie die Sphäroide mit Weitbohrspitzen. Jedes Leberäquivalent besteht aus zwanzig Sphäroiden26. Integrieren Sie zwanzig Leberäquivalente pro Kreislauf mit Weitbohrspitzen, die nur den Transfer von Organoiden ermöglichen, in das kleinere Fach eines 2-OC.
    2. Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an, das an eine Druckluftzufuhr angeschlossen werden muss. Stellen Sie die Parameter ein: einen Druck von ca. ±300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hz. Starten Sie den Durchfluss 24 h vor der Verabreichung der Prüfsubstanz. Führen Sie am nächsten Tag die APAP-Behandlung durch.
  3. Darm/Leber 2-OC MPS-Baugruppe für Absorptions- und Stoffwechsel-Assay
    1. Kombinieren Sie die beiden Medien (Darm und Leber) in einem Verhältnis von 1:4, was 200 l DMEM S in der darmen apikalen Seite und 800 l von Williams E S in der basolateralen Seite bedeutet. Integrieren Sie Darm- und Leberäquivalente gleichzeitig im 2-OC.
    2. Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an, das an eine Druckluftzufuhr angeschlossen werden muss. Stellen Sie die Parameter ein: einen Druck von ca. ±300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hz. Starten Sie den Durchfluss 24 h vor der Verabreichung der Prüfsubstanz. Führen Sie am nächsten Tag die APAP-Behandlung durch.
      HINWEIS: Führen Sie für alle Experimente jeden Zeitpunkt in Dreifacharbeit durch, d. h. drei getrennte 2-OC-Schaltungen (d. h. 1 und 1/2 2-OC-Geräte). Das Gesamtvolumen jeder 2-OC-Schaltung beträgt 1 ml.

3. Acetaminophen (APAP) Zubereitung

  1. Bereiten Sie die APAP-Lagerlösung vor und lösen Sie APAP in absolutem Ethanol. Am Tag des Experiments aPAP im jeweiligen Medium (APAP-Lösung) verdünnen, auf eine Konzentration von 12 m für die "orale Verabreichung" und 2 m für die "intravenöse Verabreichung".
  2. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von Ethanol in der Fahrzeugsteuerungs- und Behandlungslösung für beide Verabreichungen 0,5 % beträgt. Für die Positivkontrolle (100 mM APAP) beträgt die Ethanolkonzentration 2%.

4. Stoffverabreichung und Medienprobenahme testen

  1. APAP "orale" Verabreichung und Medien-Sampling
    1. Aspirieren Sie die basolateralen und apikalen Medien jedes Darmbarriereäquivalents im 2-OC. Pipette 500 l des entsprechenden Kulturmediums in das große Fach an der organoiden basolateralen Seite und 300 l in das kleine Fach.
    2. Prüfen Sie auf Blasen und gehen Sie mit der Darmbarriere gleichwertige Behandlung mit der Testsubstanz in der apikalen Seite, emulieren orale Verabreichung. Emulieren Sie die "orale" Verabreichung von APAP, indem Sie 200 L einer 12-M-APAP-Lösung auf der apikalen Seite der Darmkultureinsätze hinzufügen, die die darme "Lumenseite" darstellt (Abbildung 1B). Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an.
    3. Sammeln Sie das Gesamtvolumen von apikalen und von basolateralen Seiten an den folgenden Zeitpunkten: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, und 24 h15,27. Führen Sie alle Experimente in dreifacher, statischer und dynamischer Situation durch und sammeln Sie jede Probe jeder Dreistikalie in einem separaten Mikrorohr. Analysieren Sie die Proben mit HPLC/UV.
      HINWEIS: Separate apikale und basolaterale Proben.
  2. APAP "intravenöse" Verabreichung und Medienproben
    1. Emulieren Sie die "intravenöse" Route, indem Sie 2 M APAP-Lösung direkt in das Leberfach verabreichen. Alle 2-OC-Medium-Inhalte aspirieren. Pipette 650 l von Williams E S, die die Testsubstanz enthält, in das große Fach und 350 l des gleichen Mediums in das kleinere Fach, das die 20 Sphäroide enthält. Sammeln Sie alle Volumina an folgenden Zeitpunkten: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h und 24 h27,28.
    2. Führen Sie alle Experimente in dreifacher, statischer und dynamischer Situation durch. Sammeln Sie jede Probe, von jedem Dreifachen, in einem separaten Mikrorohr. Analysieren Sie die Proben mit HPLC/UV.

5. Instrumentierung und chromatographische Bedingungen

  1. HPLC-Analyse
    1. Stellen Sie alle relevanten Parameter für die HPLC-Analyse gemäß Tabelle 1ein.
    2. Filtern Sie die mobile Phase durch einen 0,45 m Membranfilter unter Vakuum. Filtern Sie die Proben durch einen PVDF-Spritzenfilter der Porengröße (Durchmesser 13 mm) und lagern Sie sie in einer Durchstechflasche. Starten Sie die Messung.
  2. Bestandslösungen, Kalibrierstandards und QC-Proben (Quality Control)
    1. 10 mM APAP-Lagerlösungen im Ammoniumacetatpuffer (100 mM, pH 6,8) vorbereiten und mit DMEM S und Williams E S zellkulturmedien, verdünnt mit Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v), weiter verdünnen, um die Arbeitslösungen von 0,25 bis 100,00 m zu erreichen.
    2. Fügen Sie eine Reihe von Kalibrierproben in dreifacher sowie Qualitätskontrolle Proben auf vier Ebenen in Dreifache. Bereiten Sie diese Standards durch serielle Verdünnung vor.
    3. Erstellen Sie Kalibrierkurven von APAP-Spitzenbereichen im Vergleich zu APAP-Nominal-Standardkonzentrationen. Bestimmen Sie die lineare Regressionsanpassung für jede Kalibrierkurve. Bewerten Sie die Passgenauigkeit verschiedener Kalibriermodelle anhand visueller Inspektion, Korrelationskoeffizient, Intra- und Interrun-Genauigkeit und Präzisionswerten.
    4. Injizieren Sie leere Proben von DMEM S und Williams E S Medien in Ammoniumacetat Puffer (1:1, v/v) in Sextuplikat verdünnt. Bereiten Sie Triplicate von Qualitätskontrollproben in DMEM S- und Williams E S-Medien vor, die mit Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) für die APAP-Konzentrationen von 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 und 90,00 m verdünnt wurden.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Qualitätskontrollproben aus einer neuen Lagerlösung hergestellt werden, die sich von der zur Erzeugung einer Standardkurve verwendeten unterscheidet. Verwenden Sie Qualitätskontrollproben, um Intra- und Inter-Run-Variationen zu untersuchen.
  3. Validierungsverfahren
    1. Führen Sie die bioanalytische Methodenvalidierung nach den zuvor gemeldeten Verfahren29,30durch. Führen Sie die chromatographischen Läufe bei fünf oder sechs verschiedenen Gelegenheiten durch, wobei Williams E S bzw. DMEM S Zellkulturmedien berücksichtigt werden.
    2. Stellen Sie sicher, dass Kalibrierpunkte im Bereich von 0,25 bis 100,00 m APAP, in DMEM S oder Williams E S Zellkulturmedien, die im Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) verdünnt sind, basierend auf den Spitzenflächen von APAP (Achse y) gegen die jeweiligen Nennkonzentrationen (Achse x) dargestellt werden. Vergleichen Sie die Steigungen dieser Standardkalibrierungskurven mit Neigungen der Kalibrierkurve, die in Ammoniumacetatpuffern vorbereitet sind. Stellen Sie sicher, dass alle Kalibrierkurven einen Korrelationswert von mindestens 0,998 aufweisen.
    3. Bestimmen Sie die Genauigkeit und Genauigkeit (Intra- und Interrun) für den Analyten in der Ersatzmatrix mithilfe von Replikationen auf vier verschiedenen Ebenen LLOQ, Low, Middle und High-Quality-Kontrolle an fünf oder sechs verschiedenen Tagen. Führen Sie am selben Tag intra-run Präzisions- und Genauigkeitsmessungen in DMEM S- oder Williams E S-Zellkulturmedien durch, die in Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) verdünnt sind und 0,50, 4,50, 45,00 und 90,00 M APAP-Konzentrationen (n= 3) enthalten.
    4. Bewerten Sie jeden Satz von Qualitätskontrollproben, die die APAP-Konzentrationen aus kürzlich erhaltenen Kalibrierkurven enthalten. Testen Sie die Selektivität der Assays durch den Grad der Trennung der Zinsverbindung und mögliche andere chromatographische Spitzen, die durch störende Komponenten verursacht werden.
  4. Untere Quantifizierungsgrenze (LLOQ) und Nachweisgrenze (LOD)
    1. Bestimmen Sie die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) basierend auf der Standardabweichung der Antwortvariablen und dem Neigungsansatz. Berechnen Sie mit der Formel 10/S, wobei α die Standardabweichung von y-Intercept und S die Steigung der geraden Linie ist, die durch Plotten von Kalibrierkurven29,30erhalten wird. Schätzen Sie die Erkennungsgrenze (LOD) unter Berücksichtigung des 3,3-fachen der Standardabweichung des Rohlings, dividiert durch die Steigung der Kalibrierkurve29,30.

6. Gewebeäquivalente Lebensfähigkeit/Funktionalität

  1. Mtt
    1. Führen Sie einen MTT-Test durch, um die Organoid-Lebensfähigkeit in allen Zeitpunkten des MPS-Assays zu bewerten. Verwenden Sie als Negativkontrolle Zellmedien plus Fahrzeug. Als positiver Schutz, behandeln Sie die Organoide mit 100 mM APAP und 1% NaOH in Zellmedium verdünnt.
    2. Übertragen Sie die 20 Sphäroide jeder Replikation für einzelne Brunnen in einer 96-Well-Platte, und die Zellkultureinsätze, die die Darmäquivalente enthalten, auf 24 Well-Zellplatten, wobei ein Darmäquivalent pro Brunnen platziert wird. Waschen Sie die Gewebeäquivalente dreimal mit 1x DPBS.
    3. Fügen Sie 300 l einer 1 mg/ml MTT-Lösung, verdünnt im jeweiligen Zellmedium, pro Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platten für 3 h bei Standard-Zellkulturbedingungen.
    4. Entfernen Sie die MTT-Lösung aus jedem Brunnen sorgfältig durch Pipettieren. Extrahieren Sie MTT-Formazan aus dem Darm und Leberäquivalente mit 200 l Isopropanol pro Brunnen über Nacht bei 4 °C.
      HINWEIS: Versiegeln Sie den Deckel, um Verdunstung zu verhindern.
    5. Übertragen Sie 200 l jedes Überstands mittels eines Überstandes in einer 96-Well-Mikro-Prüfplatte auf den jeweiligen vordefinierten Brunnen. Verwenden Sie Isopropanol als Leerzeichen.
    6. Lesen Sie die Formazan-Absorption in einem Plattenleser bei 570 nm. Berechnen Sie die relative Fähigkeit der Zellen, MTT zu reduzieren (%) verwendung der durchschnittlichen optischen Dichte jedes Zeitpunktes im Vergleich zur negativen Kontrolle, die als 100% Zelllebensfähigkeit angesehen wird.
  2. Zytochemie/Histologie
    1. Fixieren Sie die Darm- und Leberäquivalente für 25 min bei Raumtemperatur mit 4% (w/v) Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat-Saline-Puffer, pH 7,4. Waschen Sie die Organoide 5 Mal in PBS Puffer für 10 Minuten jedes Mal. Verflecken Sie das Darm- und leberäquivalente mit Tetramethylrhodamine Isothiocyanat-Phalloidin oder Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 in PBS31.
    2. Übertragen Sie sie für einige Minuten auf das OCT-Gefriermedium, um sich bei RT zu akklimatisieren, bevor Sie sie bis zum vollständigen Einfrieren in flüssigen Stickstoff übertragen. Führen Sie Lebersphäride Kryosektionen ca. 10-12 m dick, mit einem Kryostat.
    3. Montieren Sie die Gewebeabschnitte im Montagemedium mit DAPI. Untersuchen Sie sie durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie.
    4. Einfrieren der Organoide nach der Fixierung, um Hämatoxylin & Eosin Färbung nach den etablierten Protokollen durchzuführen. Montieren Sie die Dias mit Montagemedium nach dem Schneiden des Gewebes wie oben beschrieben und nehmen Sie histologische Bilder mit einem optischen Mikroskop.
  3. Analyse mit hohem Inhalt
    1. Mitochondriale und nukleare Färbung der Zellen
      1. Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver in DMSO, um eine 1 mM mitochondriale Färbung Strumpflösung (z.B. MitoTracker Deep Red FM) herzustellen. Salatierte Lagerlösung bei -20 °C vor Licht schützen. Verdünnen Sie die 1 mM mitochondriale Färbung der Lagerlösung bis zur Endkonzentration (200 nM) in vorgewärmtem (37 °C) Gewebekulturmedium ohne Serum.
      2. Entfernen Sie die Zellkulturmedien. Fügen Sie die mitochondriale Färbung Lösung, um die Probe vollständig zu decken und brüten Zellen für 15-45 min bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%CO2.
      3. Entfernen Sie die mitochondriale Färbung sorgsam und ersetzen Sie sie bei Raumtemperatur 15 Minuten lang durch 2-4% Paraformaldehydfixativ in PBS.
      4. Spülen Sie die festen Zellen 5 Minuten lang vorsichtig mit PBS ab. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.
      5. Bereiten Sie eine 10 mg/ml (16,23 m) Nukleinsäure-Färbung stäbchen Lösung durch Auflösen von 100 mg Hoechst 33342 Farbstoff in 10 ml Reinstwasser.
        HINWEIS: Die Lagerlösung sollte aliquoted und lichtgeschützt bei -20 °C gelagert werden.
      6. Bereiten Sie eine 0,2-2,0 g/ml Nukleinsäure-Färbungs-Arbeitslösung in PBS vor und inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Nukleinsäure-Färbungsarbeitslösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
      7. Entfernen Sie die Nukleinsäure-Färbung Arbeitslösung und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS für 5 Minuten dreimal. Die Zellen sollten in PBS bei 4 °C aufbewahrt werden, geschützt vor Licht.
    2. Mitochondriale und nukleare Färbeanalyse
      1. Analysieren Sie Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätzen, die für den Nukleinsäurefleck (Ex/ Em: 361/497 nm) und den mitochondrialen Fleck geeignet sind (Ex/ -Em: 644/665 nm). Finden Sie Zellen durch Nukleinsäure positive Färbung und quantifizieren Zellzahl. Quantifizieren Sie die mitochondriale Fluoreszenzintensität in Mitochondrien.
  4. Morphometrische Messungen (Sphäroidberechnungen) in ImageJ
    1. Exportieren Sie HCA-Images (High Content Analysis) als *.flex-Dateien aus der Columbus-Software. Importieren Sie .flex Dateien als Graustufen in ImageJ mit Bio-Formats Plugin32: Datei > Importieren > Bio-Formate.
    2. Wählen Sie im Fenster Importoptionen Hyperstack-Anzeige aus und aktivieren Sie Kanäle unter Teilen in separate Fenster aufteilen. Diese Option ermöglicht den Zugriff auf alle Dateien in einem bestimmten Kanal (z. B. DAPI, Mitotracker, etc.). Wählen Sie unter Speicherverwaltung nicht virtuellen Stack verwenden aus.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, DAPI-Kanal als "Staub" in Bildern zu verwenden, da Kulturmedium in UV-Wellenlänge reduziert wird (z. B. 405 nm).
    3. Anpassen der Pixelgröße (Analysieren > Skalierung festlegen), wenn sie nicht gemäß den eingebetteten Werten in der .flex-Datei geladen wurde. Wenden Sie einen Gaussian Blur Filter an, um die Überschreitung von Rauschen zu entfernen und Unregelmäßigkeiten in der Formkontur zu vermeiden. Prozess > Filter > Gaußsche Unschärfe. Ein hoher Sigma-Wert (Radius) zwischen 2,0 und 3,0 ist für die meisten Fälle ideal. Wenn der Stapel über mehrere Bilder verfügt, gelten Sie für alle (wählen Sie Ja im Fenster Prozessstapel).
    4. Generieren Sie ein binäres Bild, um Hintergrund und Organoide (Objekte) mithilfe eines Schwellenwerts zu trennen. Klicken Sie auf Bild > Anpassen > Schwellenwert. Verwenden Sie die rote Maske, um die Werte an die Intensität des Bildes anzupassen, um die Organoidform anzupassen, um die Morphologie intakt zu halten. Deaktivieren Sie den dunklen Hintergrund, wenn das Bild einen weißen Hintergrund hat. Klicken Sie auf Übernehmen.
    5. Wählen Sie im Fenster Stapel in Binär konvertieren die Threshold-Methode aus. Normalerweise werden Standard oder Dreieck bei dieser Art der Bildverarbeitung bevorzugt. Halten Sie den Hintergrund als dunkel. Wählen Sie Schwellenwert für jedes Bild berechnen aus, wenn sich mehrere Bilder im Stapel befinden.
    6. Wählen Sie Prozess > Binär > Löcher füllen. Optional entfernen Sie Bohrungen aus dem Hintergrund. Wählen Sie in Prozess > Binär > Optionen s Schwarze S-Hintergründe aus, und führen Sie Fülllöcher erneut aus. Deaktivieren Sie die Option "Schwarzer Hintergrund", bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    7. Separate Objekte. Für Organoide ist die Wasserscheidemethode eine gute Wahl. Klicken Sie auf Prozess > Binär > Einzugsgebiet. Führen Sie die Formanalyse aus.
      1. Wählen Sie Analysieren > Messungen festlegen. Es stehen mehrere Optionen zur Verfügung (Details in https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Wählen Sie für Organoide Bereich, Mittlerer Grauwert, Min & max Grauwert und Shape-Deskriptoren . Optional wählen Sie Beschriftung anzeigen aus, um Objekte im Bild und in der wissenschaftlichen Notationzu identifizieren. Klicken Sie auf OK.
      2. Wählen Sie Analyse > Partikel analysieren. Wählen Sie die Größen- und Zirkularitätsgrenzen aus. Halten Sie 0-unendlich und 0.00-1.00, um alle Objekte im Bild zu messen. Wählen Sie unter Anzeigen Umrisse aus, damit die Objekte identifiziert werden. Aktivieren Sie die Anzeigeergebnisse, um Ergebnisse auszugeben; An Kanten ausschließen, um Objekte auszuschließen, die Rahmen berühren; Schließen Sie Löcher ein, sodass eventuelle Innenlöcher in den Objekten als Teil der Hauptform betrachtet werden.
    8. Wiederholen Sie die Shape-Analyse für jeden Bildstapel, und die Ergebnisse werden in einer einzelnen Tabelle angehängt. Exportergebnistabelle in Datei > Speichern unter... als .csv-Datei (Comma Separated Values).
  5. Echtzeit-PCR
    1. Extrahieren Sie RNA aus Gewebeäquivalenten unter Verwendung einer monophasischen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat, nach den Anweisungen des Herstellers.
    2. Führen Sie die cDNA-Synthese durch reverse Transkription von 1 – 2 g Gesamt-RNA durch.
    3. Verstärken Sie alle Targets mit genspezifischen Primern (Tabelle 5), um quantitative PCR in Echtzeit durchzuführen. Jede qRT-PCR enthält 30 ng reverse-transscribed RNA und 100 nM jedes Primers.
    4. Folgen Sie pcR-Bedingungen: 50 °C für 3 Minuten (1 Zyklus); 95 °C für 5 Minuten (1 Zyklus); 95 °C für 30 Sekunden, 59 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden (35 - 40 Zyklen).
  6. CYP-Assay
    1. Folgen Sie Abschnitt 2.2 für die Leber 2-OC-Montage. Die experimentellen Gruppen sind No-Cell Control, APAP 2'M Behandlungen für 12 h, 24 h und Fahrzeugsteuerung. Folgen Sie den Abschnitten 3.3 und 4.2 für die APAP 2-M-Vorbereitung und -Behandlung.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass alle Proben gleichzeitig für den CYP-Test bereit sind, beginnen Sie die 12-H-Behandlung 12 Stunden nach Beginn der 24-Stunden-Behandlung. Behandeln Sie die zellfreie Kontrolle der CYP-Aktivität mit 0,5% Ethanollösung sowie die Fahrzeugsteuerung.
    2. 3 mM luminogene Substrat-Lagerlösung bei Raumtemperatur auftauen und eine Verdünnung von 1:1000 in Williams E S. Schutz vor Licht machen.
    3. Sammeln Sie Sphäroide und übertragen Sie jede Versuchsgruppe auf einen Brunnen einer 96-Well-Platte. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie es zweimal mit 100 l 1x DPBS und fügen Sie 80 L 3 M Substratlösung pro Bohrgut hinzu. Behalten Sie die no-cell-Kontrolle in Williams E S Medium. Speichern Sie einen Brunnen ohne Sphäroide oder Substratlösung für eine Hintergrundsteuerung. 30-60 min bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten, lichtgeschützt.
    4. Equilibrate lyophilisierte Luciferin Detektion Reagenz (LDR) mit dem Rekonstitutionspuffer mit Esterase. Mischen Sie durch Wirbeln oder Invertieren. Bewahren Sie das angeeignete Volumen bei Raumtemperatur bis zum nächsten Schritt auf.
      HINWEIS: Rekonstituierte LDR kann bei Raumtemperatur für 24 Stunden oder bei 4 °C für 1 Woche ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Für die Langzeitlagerung bei -20 °C lagern.
    5. Übertragen Sie 25 L des überlagerten Überstandes der intakten Sphäriden nach der Inkubation in drei verschiedene Brunnen einer weißen, opaken 96-Well-Mikroplatte. Fügen Sie 25 l LDR pro Brunnen hinzu und homogenisieren.
    6. Inkubieren Sie die weiße Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Lesen Sie die Lumineszenz auf einem Luminometer. Verwenden Sie kein Fluorometer.
    7. Berechnen Sie Nettosignale, indem Sie Hintergrundlumineszenzwerte (No-Cell Control) von den mit Derversuchsmasse behandelten und unbehandelten (Fahrzeugsteuerung) Werten subtrahieren. Berechnen Sie prozentuale Veränderung der CYP3A4-Aktivität, indem Sie die mit dem Netto behandelten Werte durch die unbehandelten Nettowerte dividieren und mit 100 multiplizieren.
  7. Western Blotting
    1. Übertragen Sie die Lebersphäride in ein identifiziertes 1,5 ml Mikrorohr. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es zweimal mit 100 l 1x DPBS.
    2. Lysatieren Sie die Lebersphäroide in 100 l Zelllyse RIPA Puffer bei 4 °C für 20 min. Zentrifuge für 15 min, 4 °C und 11000 U/min. Übertragen Sie den Überstand auf ein anderes identifiziertes 1,5 ml Mikrorohr.
    3. Quantifizieren Sie die Menge an Protein, die durch die Bradford-Methode gewonnen wird. Laden Sie zwischen 10 und 50 g Protein aus dem quantifizierten Zelllysat pro Bohrung eines Gradienten Polyacrylamid-Gels 3-15% und führen Sie eine SDS-PAGE durch.
    4. Übertragen Sie das geladene Protein aus dem Gel über die halbtrockene Anlageanlage auf eine 0,22 m PVDF-Membran. Verwenden Sie eine Übertragungslösung von 50 mM Tris-HCl und 192 mM Glycin. Stellen Sie die Geräteparameter entsprechend der Anzahl der zu übertragenden Gele ein (1 bis 2 gleichzeitig).
    5. Block unspezifische Wechselwirkungen auf PVDF-Membran mit einer 3-5% Magermilchlösung im TBS-T Puffer: Tris-Buffered Saline (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM Natriumchlorid) ergänzt mit 0,1% Tween 20. Halten Sie die Membran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter sanft konstantem Schütteln.
    6. Mit TBS-T unter sanftem konstantem Schütteln 3-5 min bei Raumtemperatur waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
    7. Verdünnen Sie Albumin und Vinculin primäre Antikörper auf 1:1000 bzw. 1:2000 auf TBS-T. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C unter sanft konstantem Schütteln.
      HINWEIS: Befolgen Sie immer die Anweisungen des Herstellers, um Antikörper zu verdünnen.
    8. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Membran 3 Mal (Schritt 6.7.6). ECL Anti-Maus IgG Sekundärantikörper auf 1:5000 auf TBS-T verdünnen. Inkubieren Sie die Membran mit einem sekundären Antikörper unter sanft konstantem Schütteln für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
    9. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Membran (Schritt 6.7.6). Führen Sie den Proteinnachweis mit ECL Western Blotting Substrate durch. Stellen Sie die autoradiografischen Filme für 30 s bis 30 min zur Unterlegen. Führen Sie die Immunoblotting-Erkennung in Dreifacharbeit durch.

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Representative Results

Um die PK APAP-Tests im 2-OC MPS durchzuführen, besteht der erste Schritt darin, den menschlichen Darm und Leberäquivalente (Organoide) herzustellen. Sie sind in das 2-OC mikrofluidische Gerät(Abbildung 1A) 24 h vor Beginn des PK APAP-Assays integriert. Am nächsten Tag wird das Medium geändert, und das Modell wird APAP ausgesetzt. Abbildung 1 zeigt die Darm- und Leberäquivalente, die sich innerhalb des 2-OC-Geräts (Abbildung 1B) und des APAP PK-Experimentszeitkurses befinden (Abbildung 1C). Wir führten einen MTT-Assay, TEER-Messungen, HCA, Echtzeit-PCR, Western Blotting, Histologie und konfokale Fluoreszenzmikroskopie in 2D-Kultur und 3D-Organoide durch, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu überprüfen und mögliche aPAP-toxische Effekte zu erkennen. In den konfokalen Fluoreszenzmikroskopiebildern wurden die mit DAPI und Phalloidin gefärbten Darmäquivalentproben (für Kerne bzw. Aktin) als zusammenhängende Barriere für die nicht behandelten (Abbildung 2A) und die 12 -M APAP-behandelten Proben(Abbildung 2B) dargestellt. Wie in Abbildung 2Cdargestellt, zeigte der MTT-Assay relative Zelllebensfähigkeitswerte über 70 %, was auf das Fehlen relevanter zytotoxischer Wirkungen als Reaktion auf aPAP-Exposition bei 12 M Konzentration33,34,35,36,37hinweist. Die positive Kontrolle (100 mM) induzierte einen signifikanten Zelltod (Überleben unter 5%). Die Caco-2/HT-29 Lebensfähigkeit und richtige Differenzierung sowie die Darmäquivalentbarriereintegrität wurden durch TEER Evolution während des Differenzierungszeitraums überprüft (Abbildung 2D). APAP hat keine Änderung der TEER-Werte verursacht, wie in Abbildung 2Edargestellt. Die Expression der aktiven Natriumgekoppelten Glukosetransporter SLC5A1, Multidrug Resistance Transporter MDR1 und Natrium-Kalium ATPase wurden analysiert, um die Auswirkungen der APAP-Behandlung auf die Bildung von Zellbarrieren und die Basalfunktionalität zu überprüfen. Wie abbildung 2F-Hzeigt, haben sowohl nicht behandelte als auch APAP-behandelte Darmäquivalente eine ähnliche Expression von SLC5A1 und NaKATPase gezeigt. Die orale Verabreichung von 12 M APAP induzierte markierte einen Anstieg der MDR1 mRNA-Spiegel in Darmäquivalenten nach 24 h (Abbildung 2H). Wir führten auch HCA von Zellphänophenveränderungen durch ein Fluorophor-Farbstoff-Gemisch für Kerne und mitochondrialen Massengehalt durch. Positivkontrollen waren 100 mM APAP und 1% NaOH.

Zusätzlich analysierten wir, ob 12 M APAP zytotoxizität in die Co-Kultur von 2D Caco-2/HT-29 induzieren könnten. Die in Abbildung 2I aufgenommenen Darmzellenbilder, die mit fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, bestätigen die MTT-Daten, die gezeigt haben, dass 12 M APAP keine signifikante Zytotoxizität in den Caco-2/HT-29 Darmäquivalenten verursacht haben.

Die Beurteilung der Basallebensfähigkeit der Hepatensphäroide und der Zytotoxizität als Reaktion auf 2 M APAP erfolgte durch MTT-Assay und morphologische Analysen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, H&E-Histologie und HCA-Assays. Wie in Abbildung 3Adargestellt, konnte der MTT-Assay keine relevante Zytotoxizität als Reaktion auf die 2-m-APA-Behandlung in Proben aus der Leber-2-OC-Baugruppe unter statischen und dynamischen Bedingungen identifizieren. Die Zelllebensfähigkeit verringerte sich, blieb aber über 80% für 12 h und 24 h Zeitpunkte33,34,35,36,37. Die Positivkontrollbehandlungen (100 mM APAP und 1% NaOH) verursachten signifikante Gewebeschäden (Lebensfähigkeit unter 10%). Mikroskopische konfokale Bilder deuten auf das Fehlen eines nekrotischen Zentrums in den Lebersphäroiden sowohl bei Basal- als auch bei APAP-Behandlungsbedingungen hin, und es gibt keine Hinweise auf signifikante Sterberaten (Abbildung 3B-C). Als wir jedoch mehrere zelluläre phänotypische Veränderungen nach der Verabreichung des Fahrzeugs oder 2 M APAP in der 2D-HepaRG/HHSteC-Kokultur durch HCA-Assay analysierten, indem wir 100 mM APAP (C+) als positive Kontrolle verwendeten, zeigten die Leberzellen im Widerspruch zu den Ergebnissen des MTT-Assays eine frühe zytotoxische Reaktion auf 2 M APAP -Behandlung(Abbildung 3D). Nach 24 h gab es einen Rückgang der Anzahl der Zellen, im Kernbereich und eine Zunahme der mitochondrialen Masse. Zusätzlich wurde ein Fluorophor-Farbstoff-Cocktail mit Hoechst 33342 und MitoTracker Deep Red verwendet, um die 3D-Hepatische Sphäroide zu färben (Abbildung 3J). Fidschi-Software wurde verwendet, um 3D sphärische Architektur Homogenität zwischen mehreren Sphäroiden zu bewerten (Abbildung 3E-I). Die in Abbildung 3E dargestellte Grafik zeigt die Ähnlichkeit zwischen Lebersphäroiden gesamtfläche. Das Seitenverhältnis (Abbildung 3F) um 1 bedeutet ein Fehlen von Verzerrung während des Konfektionsprozesses der Sphäroide. Die Auswertung ergab auch, dass die Mehrheit der Sphäroide grob gerundet waren (Abbildung 3G). Die Auswertung des Morphologieperimeters und der Zellverteilung erfolgte nach Zirkularität (Abbildung 3I) bzw. durch Soliditätsberechnung (Abbildung 3H). Wir kamen zu dem Schluss, dass die Methode zur Konfektion der Lebersphäroide Organoide mit einem glatten Umfang erzeugt hatte, kompatibel mit sphärischem Wachstum, keine Verzerrungen oder Nekrose während des Prozesses.

Wie in Abbildung 4A-Bgezeigt, zeigten die Lebersphäroide jeweils einen relativ hohen Basalgehalt an Albumin- bzw. GST-mRNA-Expression, was auf die richtige Basalfunktionalität hindeutet. Dennoch induzierte die 2-M-APAP-Behandlung für 24 h eine Abnahme des Albumin- und der GST-mRNA-Expressionsniveaus, was auf eine funktionelle Beeinträchtigung der Lebersphäroide bei 24 h Zeitpunkt der APAP-Behandlung hindeutet.

Der Nachweis der CYP3A4- und UGT1A1-mRNA-Expressionsniveaus zeigt die metabolische Leistungsfähigkeit der Leberäquivalente. Der CYP3A4 mRNA Basalwert (Abbildung 4C) entsprach früheren Berichten6. Die APAP-Behandlung induzierte einen Trend für eine Abnahme sowohl der CYP3A4 mRNA- als auch der UGT1A1-Expression als Reaktion auf die APAP-Behandlung (Abbildung 4C-D), die die Hypothese einer Beeinträchtigung von Lebersphäroiden funktionell zum 24-stunden-Zeitpunkt der APAP-Behandlung bestätigte.

Zusätzlich wurden Experimente mit westlicher Blotting und in vitro enzymatischer Aktivität durchgeführt, um die Albumin-Proteinexpression sowie die CYP 3A4-Aktivität in Leberäquivalenten bei Basal- und APAP-Behandlungsbedingungen zu analysieren. Wir fanden heraus, dass 2 -M APAP-Behandlungen, die am Leber-2-OC-MPS durchgeführt wurden, eine Verringerung der Leberäquivalent-Gesamtalbuminexpression bei 12 h und 24 h Zeitpunkten sowohl bei statischen (Abbildung 4E) als auch bei dynamischen (Abbildung 4F) Bedingungen induzierten. Auf der anderen Seite zeigten Leberäquivalente aus dynamischen Bedingungen einen Trend zu einer höheren Proteinexpression von Albumin im Vergleich zu den statischen Bedingungen (Abbildung 4G). Der CYP 3A4-In-vitro-Assay, der an Leberäquivalenten aus Leber 2-OC MPS durchgeführt wurde, zeigte, dass eine 2-M-M-APAP-Behandlung für 12 h oder 24 h in der Lage war, eine robuste und signifikante Beeinträchtigung der CYP-3A4-Aktivität sowohl bei statischen als auch bei dynamischen Bedingungen zu induzieren (Abbildung 4H-I). Interessanter ist, dass das Vorhandensein von Medienfluss (dynamisch) eine signifikante Verbesserung der CYP-3A4-Aktivitätsniveaus der Leberäquivalente im Vergleich zu Bedingungen induziert hat, unter denen die Leberäquivalente ohne zirkulierendes Medium (statische Bedingungen) gehalten wurden (Abbildung 4J).

Um den empfindlichsten analytischen Zustand in Bezug auf die HPLC-Analyse zu finden, wurden mehrere Parameter untersucht, darunter die Zusammensetzung der mobilen Phase, die Art und Konzentration von Additiven. Es wurde festgestellt, dass Acetonitril eine bessere Chromatogrammauflösung und angemessene Retentionszeit als Methanol gab. Eine schnelle und reproduzierbare Trennung von APAP wurde mit einer C18-Umkehrphasensäule erreicht. Der APAP-Aufbewahrungszeitwert (Rt) betrug 9,27 ± 0,19 Minuten. Die Selektivität für APAP wird durch die Form und symmetrische Auflösung des Peaks sowie durch das Fehlen störender Spitzen aus den DMEM- und Williams-Zellkulturmedien angezeigt.

Für den Aufbau der Kalibrierkurven wurden APAP-Standardkonzentrationen in DMEM S- und Williams E S-Zellkulturmedien verwendet, die mit Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) im Bereich von 0,25 bis 100,00 m verdünnt wurden. Die Linearität des Verfahrens wurde bei neun Konzentrationsstufen bestimmt. Die Daten sind in Tabelle 2 und Tabelle 3dargestellt. Die Beziehung zwischen der APAP-Konzentration und den Spitzenbereichen wurde durch die linearen Regressionsgleichungen beschrieben: y = 16106*x + 3579.8 (R2=1, in DMEM-Medium) und y = 16397*x + 2475.1 (R2=1, in Williams-Medium), in dem "x" die APAP-Nennkonzentration in M und "y" die Chromatogramm-Spitzenfläche von APAP in AU ist. An der oberen Quantifizierungsgrenze (d. h. 100,00 m) lagen die prozentuale Abweichung und die Inter-Run-Variabilitätswerte unter 2,50 %. Die Genauigkeit und Genauigkeit für neun Konzentrationsstufen, mit Ausnahme der 0,50 m (LLOQ), lagen innerhalb eines akzeptablen Bereichs mit DEV- und C.V.-Werten von weniger als 7,00 %(Tabelle 2 und Tabelle 3).

Die analysemethode Inter- und Intra-Run-Genauigkeit und Präzision fiel in vier getesteten Konzentrationen unter die allgemein anerkannten Kriterien für bioanalytische Assays. Die Reproduzierbarkeit des Verfahrens wurde durch die Analyse von Replikationen von APAP-Qualitätskontrollproben von 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 und 90,00 m bewertet. Die durchschnittlichen Ergebnisse innerhalb und zwischen den Durchläufen sind in Tabelle 4dargestellt. Die Genauigkeit und Genauigkeit des Assays wird durch DEV-Werte ≤ 15,00% bzw. durch C.V.-Werte ≤ 7,00% nachgewiesen.

LOD wurde als Die Probe bestimmt, deren Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) gerade größer als 3 war und einem 0,25 M APAP entsprach. Auf der anderen Seite zeigte der LLOQ, geschätzt mit 0,50 M APAP-Proben, ein S/N-Verhältnis von 10. Darüber hinaus fanden wir Genauigkeitswerte (DEV%) innerhalb ≤ 19,00% der Nominalkonzentrationswerte. Die Intra- und Interrun-Variabilitäten wurden durch c.V. ≤ 18,77% nachgewiesen, wie aus Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4)29,30hervorgeht.

Die APAP PK-Analysen wurden in drei verschiedenen 2-OC-MPS-Baugruppen durchgeführt: 1) Darm 2-OC, die nur das Darmäquivalent enthalten; 2) Leber 2-OC, enthält nur die Lebersphäroide und 3) Darm/Leber 2-OC mit Darmbarriere und Lebersphäroide.

Für Absorptionsstudien wurde der orale Weg durch die Verabreichung von 12 M APAP auf der Darmäquivalent-Apical-Seite nachgeahmt. Die APAP-Konzentrationen wurden mit HPLC/UV in den mittleren Proben gemessen, die sowohl von apikalen als auch basolateralen Darmäquivalenten unter statischen und dynamischen Bedingungen gesammelt wurden. Die APAP-Kinetik im Medium, die von den apikalen und basolateralen Seiten gesammelt wurde, zeigte, dass das Darmmodell in der Lage war, das APAP zu absorbieren. Es gab eine progressive APAP-Konzentrationsabnahme in der apikalen Seite (Abbildung 5A) gleichzeitig mit der APAP-Konzentrationserhöhung auf der darmen basolateralen Seite (Abbildung 5B). Die maximalen Konzentrationen (Cmax) im Medium betrugen sowohl für statische als auch für dynamische Bedingungen nach 12 h der Verabreichung (Tmax) etwa 2 m.

Für Stoffwechselstudien wurde die intravenöse Verabreichung durch die Anwendung von 2 M APAP im Medium des Leberfachs nachgeahmt. Die APAP-Konzentrationskinetik in den Medien sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen zeigte, dass nur unter den dynamischen Bedingungen die Abnahme der APAP-Konzentration festgestellt werden konnte, die 0,87 M APAP 12 h nach 2 M APAP-Verabreichung (T1/2 = 12 h) erreichte. Die Leberäquivalente zeigten eine minimale metabolische Effizienz unter statischen Bedingungen (Abbildung 5C). Die APAP-Konzentration erreichte nach APAP-Verabreichung 1,7 m 12 h. Die integrierte, systemische APAP-Absorptions- und Stoffwechselauswertung wurde im Darm/Leber 2-OC-Modell durchgeführt. Das APAP wurde über die apikale Seite des Darmäquivalents verabreicht, wodurch der orale Weg nachgeahmt wurde. Von beiden Darmseiten und auch aus dem Leberfach wurden mittlere Proben entnommen. Abbildung 5D zeigt den fortschreitenden Zerfall der APAP-Konzentration auf der apikalen Seite sowohl bei statischen als auch bei dynamischen Bedingungen.

Abbildung 5E zeigt unterscheidbare Absorptions- und Stoffwechselphasen. Der Fluss wirkte sich auch auf die Darmabsorption aus. Der APAP Cmax im Medium änderte sich von 2 'M auf der "Darm 2-OC" (Abbildung 5B) Baugruppe auf 1,7 'M für die dynamische "Darm/Leber 2-OC" (Abbildung 5E). Abbildung 5F zeigt einen direkten Vergleich zwischen dem Konzentrations-Zeit-Profil von APAP in unserem dynamischen mikrophysiologischen System "Darm/Leber 2-OC" (rote Kurve und y-Achse) und einem repräsentativen Profil, das beim Menschen nach einer einzigen oralen Dosis von 1000 mg (schwarze Kurve und y-Achse) erhalten wurde.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Schrittkompilierung für PK-Studien im 2-OC MPS. A) Schematische Zeichnung des 2-OC MPS, die die Darm- und Lebergewebeäquivalente in der Bottom-up-Ansicht zeigt. B) 2-OC MPS-Foto mit den Darm- und Leberäquivalenten, die in das Gerät in der Bottom-up-Ansicht integriert sind, mit repräsentativen optischen Mikroskopiebildern. C) Zeitleiste der Gewebeäquivalentpräparation, APAP-Behandlung und Kulturmedium-Sammlungsphasen für die Organoidherstellung sowie pharmakokinetische und toxikologische Bewertungen. Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Lebensfähigkeit und toxikologische Bewertung der Darmäquivalente. A) Repräsentative konfokale Fluoreszenzmikroskopiebilder von nicht behandelten Caco-2/HT-29-Zellen, die mit Zellkernen und Aktin-Filamenten fluoreszierendem Farbstoff (DAPI bzw. Phalloidin) gefärbt sind; 63x Vergrößerung, Zoom 2.6. B) Repräsentative konfokale Fluoreszenzmikroskopiebilder von Caco-2/HT-29-Zellen, die mit 12 M APAP für 24 h behandelt wurden, mit Kernen und Akzidenzfilamenten fluoreszierenden Farbstoffen (DAPI bzw. Phalloidin) gefärbt sind; 63x Vergrößerung, Zoom 2.6. C) Darmäquivalente Lebensfähigkeitsbewertung durch MTT-Assay sowohl unter statischen als auch dynamischen Bedingungen. Die Werte, die durch die Balken im Diagramm dargestellt werden, werden prozentrelativ zur Fahrzeugsteuerung berechnet (Zeitpunkt, der als 0)*P<0,05 0 vs. Behandlung bezeichnet wird. D) TEER-Entwicklung während der 21 Tage der Differenzierung. *P<0.05 Tag 1 im Vergleich zu anderen Tagen. E) TEER-Werte nach APAP-Verabreichung in den Darm 2-OC MPS unter dynamischen Bedingungen. Genexpression im Darm Äquivalente. Das Absorptionspotential der Darmbarriere und mögliche Wirkungen von 12 M APAP für 24 h unter dynamischem Zustand wurde durch SLC5A1 (F), Na-K-ATPase (G) und MDR1 (H) Durch die Expression überprüft. Werte stellen den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. Das Ergebnis wird als Verhältnis zur Haushaltsführung GAPDH ausgedrückt. *P<0.05 Fahrzeug vs APAP. I) Operette bildbasierte HCA von der Columbus durchgeführt® 2.4.0. Software. Repräsentative Bilder der 2D-Darm-Kokultur in verschiedenen Zeitpunkten nach 12 M APAP-Behandlung. Negativkontrollen waren mittel (0 h) oder Fahrzeug (0,5% Ethanol). Positive Kontrollen, die hier gezeigt werden, ist der 100 mM APAP. Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Lebensfähigkeit und toxikologische Bewertung der Leberäquivalente. A) Leberäquivalente Lebensfähigkeitsbewertung durch MTT-Assay sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen. Die Werte, die durch die Balken im Diagramm dargestellt werden, werden prozentrelativ zur Fahrzeugsteuerung berechnet (Zeitpunkt als 0) *P<0,05 0 vs. Behandlung. B) Vertreter konfokale Bilder aus dem Fahrzeug aufgenommen und 2 M APAP 24 h behandelt Lebersphäroide aus einem inneren Abschnitt. C) Vertreter H&E (Hämatoxylin und Eosin Färbung) Bilder aus dem Fahrzeug aufgenommen und 2 M APAP 24 h behandelt Lebersphäroide aus einem inneren Abschnitt. Skala bar = 50 m. D) Repräsentative Bilder der 2D-Leber-Co-Kultur in verschiedenen Zeitpunkten nach 2 M APAP-Behandlung. Bei diesen Analysen wurden Proben berücksichtigt, die mit dem Fahrzeug und mit 2 M APAP behandelt wurden. Die Fluorophor-Farbstoff-Mischung enthält Hoechst für nukleare Färbung und Mitotracker Deep Red für Mitochondrien-Massenfärbung. Negativkontrollen waren mittel (0 h) oder Fahrzeug (0,5% Ethanol). Positivkontrollen waren 100 mM APAP. Messungen ganzer Sphäroide-Bilder wurden mit Fidschi-Software durchgeführt. E) Frequenzverteilungen des Bereichs F) Seitenverhältnis, G) Rundheit, H) Festigkeit, I) Zirkularität. N = 85. *p < 0,05. J) Repräsentative Bilder von 3D-Lebersphäroiden, die von der Operette mit dem LWD 10x Objektiv aufgenommen wurden. Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die Lebensfähigkeit/Funktionalität der Leber und mögliche Wirkungen von 2 M APAP unter statischen und dynamischen Bedingungen wurden durch Gen- und Proteinexpression und enzymatische Aktivität überprüft. A) Albumin-Genexpression. B) GSTA2-Genexpression. Die Leberfähigkeit zur Durchführung des Phase-I- und Phase-II-Stoffwechsels und mögliche Wirkungen von 2 M APAP für 24 h unter dynamischem Zustand wurden durch genexpression von CYP3A4 (C) bzw. UGT1A1 (D) überprüft. E) Gesamtalbumin-Proteinexpression unter statischem Zustand. F) Gesamtalbumin-Proteinexpression unter dynamischen Bedingungen. Zustand. G) Vergleichsdiagramm zur Veranschaulichung des Unterschieds in der Gesamt-Albuminexpression in Leberäquivalenten, die unter statischen oder dynamischen Bedingungen kultiviert und behandelt werden. H) CYP 3A4 in vitro enzymatische Aktivität unter statischen Bedingungen. I) CYP 3A4 in vitro enzymatische Aktivität unter dynamischen Bedingungen. J) Vergleichsdiagramm zur Veranschaulichung des Unterschieds in der CYP-3A4-Aktivität in Leberäquivalenten, die unter statischen oder dynamischen Bedingungen kultiviert und behandelt werden. Werte stellen den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Daten der Genexpression werden als Verhältnis zur Housekeeping GAPDH ausgedrückt. Die Daten der Proteinexpression werden als Verhältnis zu Vinkulinprotein ausgedrückt. *P<0.05 Fahrzeug vs APAP Behandlung. Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Analyse der APAP-Pharmakokinetik in 2-OC-MPS. APAP-Absorptionsprofil nach 12 M APAP-Verabreichung an der apikalen Seite des Darms 2-OC MPS-Präparat. Die Darmbarriere wurde aus einer Kokultur von Caco-2/HT-29-Zelllinien (A) Statische und dynamische APAP-Konzentrationen im Medium von der apikalen Seite (die die menschliche Darmlumenseite darstellt) hergestellt. (B) Statische und dynamische APAP-Konzentrationen im Medium von der basolateralen Seite (die die menschliche Darmblutbahnseite darstellt). *P<0.05 statische vs. dynamische Bedingungen. C) APAP-Stoffwechselprofil im Leber 2-OC MPS von HepaRG/HHSTeC Lebersphäroide. Vergleich der statischen und dynamischen Bedingungen nach einer 2 M APAP-Verabreichung in das Medium. *P<0.05 0h vs 6 h, 12 h und 24 h APAP Behandlung. APAP-Absorptions- und Stoffwechselprofil nach 12 M Verabreichung auf der Darmbarriere-Apical-Seite des Darms/Leber 2-OC MPS-Präparats. Dadurch wird die mündliche Route nachgeahmt. Die Darmbarriere bestand aus Caco-2/HT-29-Zelllinien und dem Leberäquivalent aus Sphäroiden von HepaRG/HHSTeC-Zelllinien. (D) Darm-/Leber-2-OC-APAP-Konzentrationen auf der apikalen Seite der Darmbarriere unter statischen und dynamischen Bedingungen. (E) Darm-/Leber-2-OC-APAP-Konzentrationen im Medium unter statischen und dynamischen Bedingungen. *P<0.05 statische vs. dynamische Bedingungen. (F) Vergleich zwischen dem Konzentrations-Zeit-Profil von APAP in unserem mikrophysiologischen System (rote Kurve und y-Achse) und einem repräsentativen Profil, das beim Menschen nach einer einzigen oralen Dosis von 1000 mg (schwarze Kurve und y-Achse) erhalten wurde. Daten wurden mit WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer) aus Diagrammen extrahiert. Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HPLC-System Waters Alliance 2695 (Milford, MA, USA), ausgestattet mit Quaternary Pump, Sample Manager und Degasser
Detektor Waters 2996 Uv-Vis Im Bereich 210-400 nm
Systemsteuerung, Datenerfassung und -verarbeitung Waters Empower 2002 Chromatographie-Software
Spalte Reversed-phase Luna C18
(150 x 4,6 mm I.D.; 5 mm Partikelgröße)
Phenomenex
Wachsäule Umkehrphase Luna C18 (4 x 3 mm)
Phenomenex
Mobile Phase Lösungsmittel A- Acetonitril
Lösungsmittel B- 0,10 M Ammoniumacetat, pH 6,8
Isokratische Bedingungen Zeit A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Fluss 1,0 ml/min
Injektionsvolumen 25 l
Temperatur 25 °C
APAP-Erkennung UV bei 243 und 254 nm
Laufzeit 15 Minuten

Tabelle 1: Bedingungen und Parameter für HPLC-UV-Analysen von APAP in Kulturmediummatrizen.

Nominale Konzentration Berechnete APAP-Konzentration (m) Durchschnitt (m) S.D.b Lebenslauf. Dev
(M) (Triplikte jeder Konzentration) (M) (%)c (%)d
Assay-Nummer 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17,08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0,09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0,03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tabelle 2: Inter-Run-Variation – Genauigkeit, Genauigkeit und Linearität von Standardkurvenproben, die in einer Mischung aus DMEM-Medium mit 0,10 M Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) aus sechs separaten Assays hergestellt werden. a
a Eine lineare Kurve wurde an die Daten für eine Antwortvariablen (APAP) im Vergleich zur theoretischen Konzentration angepasst, wie in Experimental beschrieben. Die berechnete Konzentration wurde aus dem Lesen der Antwort für jede Standardprobe mit der Kalibrierkurve abgeleitet. Jeder Eintrag (Assay 1-6) entspricht dem Durchschnittswert der Dreifachanalyse.
b SD= Standardabweichung.
c C.V. (Variationskoeffizient. Präzision).
d Genauigkeit (DEV %) = Abweichung der berechneten Konzentration vom Nennwert.
Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Nominale Konzentration Berechnete APAP-Konzentration (m) Durchschnittliche S.D.b Lebenslauf. Dev
(M) (Triplikte jeder Konzentration) (M) (M) (%)c (%)d
Assay-Nummer 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26,03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0,01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tabelle 3: Inter-Run-Variation – Genauigkeit, Genauigkeit und Linearität von Standardkurvenproben, die in einer Mischung aus Williams-Medium mit 0,10 M Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) aus sechs separaten Assays hergestellt werden. a
a Eine lineare Kurve wurde an die Daten für eine Antwortvariablen (APAP) im Vergleich zur theoretischen Konzentration angepasst, wie in Experimental beschrieben. Die berechnete Konzentration wurde aus dem Lesen der Antwort für jede Standardprobe anhand einer Kalibrierkurve abgeleitet. Jeder Eintrag (Assay 1-5) entspricht dem Durchschnittswert der Dreifachanalyse.
b SD= Standardabweichung.
c C.V. (Variationskoeffizient. Präzision).
d Genauigkeit (DEV %) = Abweichung der berechneten Konzentration vom Nennwert.
Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Williams medium Nominale Konzentration Gemessene Konzentration Sd. Lebenslauf. Dev
(M) (M) (M) (%) (%)
Intra-Run (n=3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8,37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Interrun (n=15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5,31
DMEM mittel Nominale Konzentration Gemessene Konzentration Sd. Lebenslauf. Dev
(M) (M) (M) (%) (%)
Intra-Run (n=3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6,35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1,04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4,00
Interrun (n=12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tabelle 4: Intra- und Inter-Run-Präzision und Genauigkeit für APAP in Qualitätskontrollproben. a
a Die Daten werden als Durchschnitte angezeigt. SD (Standardabweichung). C.V. (Variationskoeffizient. Genauigkeit) und Genauigkeit (prozentuale Abweichung. DEV%).
Diese Zahl wurde von Marin et al. geändert. Acetaminophen Absorption und Stoffwechsel in einem Darm/ Leber mikrophysiologischen System. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Primer (5' → 3')
Gewebe Gen vorwärts Rückwärts
Darm SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgACggT
NA-K-ATPase ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg
Leber Albumin TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgACAgggTgTTTCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgagggAAggCTggAAATAAg
CPY3A4 ggAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgAAaggCTggAg

Tabelle 5: Echtzeit-qPCR-Primer zur Bewertung der Gentranskription auf mRNA-Ebene in den 2-OC-Kulturen für Darm- und Lebergewebe

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Discussion

Die genaue und zuverlässige Bewertung der pharmakologischen Eigenschaften von investigativen neuen Arzneimitteln ist entscheidend für die Verringerung des Risikos in den folgenden Entwicklungsschritten. Die MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und Zeit zu reduzieren, die mit präklinischen Tests verbracht werden. Unsere Gruppe schreitet bei der Bewertung pharmakokinetischer und toxikologischer Eigenschaften voran, die hauptsächlich für die Bleioptimierung benötigt werden. Wir arbeiteten mit dem 2-OC mikrofluidischen Gerät, das zwei Kammern hat, was die Integration von zwei Organoiden ermöglicht. APAP wurde gewählt, weil es viele hochwertige menschliche Daten hat, wird meist von der Leber metabolisiert, und zeigt auch hepatotoxische Eigenschaften. Das Studienprotokoll zielte darauf ab, einige Schritte der klinischen Phase I der Phase I nachzuahmen, bei der ein Medikament oral an Freiwillige verabreicht wird, und regelmäßige Blutproben gezogen werden, um die Konzentration der Medikamente zu bewerten, um die pharmakokinetischen Eigenschaften zu kennen, und biochemische und klinische Parameter werden gesammelt, um die Sicherheit und Verträglichkeit zu bewerten. Wenn sich das MPS also so entwickelt, dass es zuverlässige Vorhersagen liefert, wird es das Ausfallrisiko in der Phase-I-Studie deutlich reduzieren. Durch die Hinzufügung der Krankheitsmodelle in der Zukunft wird die gleiche Annahme möglicherweise für die klinischen Studien der Phasen II und III gelten.

Alle Studien wurden in drei Modellen durchgeführt: Darm 2-OC (APAP orale Verabreichung), Leber 2-OC (intravenöse Verabreichung), und Darm/Leber 2-OC (orale Verabreichung). Das erste Modell isolierte die Absorption, das zweite den Stoffwechsel und das dritte integrierte beide. Wir produzierten zuerst die Organoide und wurden in das mikrofluidische Gerät integriert, als zweites das APAP verabreicht und die Medienproben gesammelt, und zuletzt eine Reihe von Tests durchgeführt, um die Zelllebensfähigkeit und -funktionalität und die toxikologischen Auswirkungen der APAP-Exposition zu bewerten. Für die pharmakokinetischen Studien haben wir eine chromatographische Methode zur APAP-Quantifizierung im Medium entwickelt und validiert. Die Validierung entsprach der Richtlinie zur Validierung bioanalytischer Methoden in Bezug auf Spezifität, Linearität, Quantifizierungsgrenze (LOQ), Nachweisgrenze (LOD), Matrixeffekt, Präzision und Genauigkeit, wie von FDA29,30beschrieben. Die Spezifität wurde mit leeren, gepoolten und einzelnen biologischen Proben aus zwei verschiedenen Quellen festgelegt. Die Methode wurde während der Analyse akzeptabel durchgeführt, und die Daten bestätigten die Fähigkeit einer einfachen isokratischen mobilen Phase, APAP zu trennen und zu quantifizieren.

Die Lebensfähigkeit/Funktion von Darm und Leberorganoiden wurde mit verschiedenen Techniken beurteilt. Für das Darmäquivalent, die konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2A-B), den MTT-Assay (Abbildung 2C), die Genexpressionsbewertung (Abbildung 2D-F) oder das HCA-Experiment, wurde nach APAP-Exposition keine Toxizität 24 h festgestellt. Ebenso stellte der MTT-Assay keine toxischen Beleidigungen fest, die durch APAP in Leberäquivalenten induziert wurden (Abbildung 3A). Die HCA-Technik fügte jedoch die Möglichkeit des Nachweises sehr früher toxischer Ereignisse (24 h nach APAP-Exposition) für Leberzellen durch die Beobachtung von Zellphäobismusveränderungen mit einigen mechanistischen Hinweisen hinzu (Abbildung 3D). Dagegen erwiesen sich die konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3B) und die Histologie (Abbildung 3C) als nützliches ergänzendes Instrument bei der Untersuchung des Lebensfähigkeitsstatus der Äquivalente des menschlichen Gewebes. Für die Leberzellen war die gleichzeitige Anwendung verschiedener Techniken sehr vorteilhaft. Der MTT-Assay konnte, wie bereits erwähnt, die aPAP-Zytotoxizität, die von der HCA 24 h nach APAP-Exposition nachgewiesen wurde, nicht erkennen. Die Genexpressionsanalysen bewerteten die Funktionalität des Darms (Abbildung 2D-F) und der Leberorganoide (Abbildung 4A-D) sowohl bei Basal- als auch bei 24 h nach APAP-Behandlung. Unter basalen Bedingungen, Es gab normale Niveaus von Darm und Leber-spezifische Marker, was auf die richtige Funktionalität. Nach 24 h APAP-Exposition gab es eine Downregulation von Albumin, GST mRNA-Spiegel, und eine Tendenz, die CYP3A4-Genexpression in Leberäquivalentgeweben zu reduzieren, was auf eine frühe APAP-Zytotoxizität hindeutet. Die westlichen Blotting-Experimente bestätigten diese Ergebnisse und zeigten, dass die Verringerung der Genexpression auch mit einer robusten Verringerung der Gesamt-Albumin-Proteinexpression der Leber als Reaktion auf die APAP-Behandlung einherging (Abbildung 4E-F), was die toxischen Beleidigungen bestätigte, die dem Lebergewebe durch Exposition gegenüber APAP auferlegt wurden. Dementsprechend zeigten Experimente mit in vitro enzymatischer Aktivität eine robuste und progressive Reduktion der CYP 3A4-Aktivitätsniveaus, die durch APAP-Behandlung in Leberäquivalenten induziert wurden (Abbildung 4H-I).

Morphometrische Statistiken von Organoiden wurden auf Bild J (Abbildung 3E-I) durchgeführt. Der Bereich zeigt, wie nah die 2D-Größe an allen analysierten Organoiden ist, die in diesem Protokoll als Standardisierung verwendet werden könnten, so dass ein unvoreingenommenes Ergebnis erzielt werden kann. Die "Formdeskriptoren" zeigen Statistiken, die genau der Formmorphologie entsprechen. Das Seitenverhältnis ist ein Index, der die Haupt- und Nebenachse verwendet, so dass die Ergebnisse um 1 keine Verzerrung (d. h. bevorzugtes Wachstum) während der Organoidbildung anzeigen. Die Werte der Rundheit (4 ×[Fläche]/ (π × [Hauptachse]2)) sind sehr empfindlich gegenüber einem präferenziellen Wachstum, das als Hauptachse offenbart würde. Festigkeit ([Fläche]/ ([Konvexfläche])) ist für die Darstellung der groben Morphologie von wesentlicher Bedeutung, da sie nicht von Unregelmäßigkeiten in Denranden betroffen ist, da sie konvexe Fläche (=Umschlag) verwendet. Verteilungen, die um 1,0 zentriert sind, deuten auf ein vermeintliches sphärisches Wachstum hin. Umgekehrt ist die Zirkularität (4× π [Fläche]/[Perimeter]2) sehr empfindlich gegenüber einem komplexen Umfang, sodass "Hohlräume" oder "Taschen" diesen Index beeinflussen würden. So bestätigt die Zirkularität um 1 auch das vermeintliche sphärische Wachstum, das mit der richtigen Organoidfunktionalität kompatibel ist.

Die Analyseergebnisse zeigten, dass das MPS die APAP-Absorptions- und Stoffwechseleigenschaften emulieren konnte, die sowohl isoliert als auch in eine Kurve integriert waren, die mit der in vivo(Abbildung 5F) vergleichbar ist, ohne die Ausscheidungsphase. Die APAP-Absorption war nach oraler Verabreichung sowohl mit Darm-MPS- als auch bei Darm-/Leber-MPS-Modellen ähnlich , sowohl unter statischen als auch dynamischen Bedingungen (Abbildung 5A-B, Abbildung 5D-E). In beiden gab es eine APAP-Konzentrationsabnahme an der apikalen Seite gleichzeitig zu seiner Zunahme auf der basolateralen Seite, ohne signifikanten Unterschied für statische und dynamische Bedingungen. Im Gegensatz dazu unterschied sich der APAP-Leberstoffwechsel unter diesen Bedingungen. Die zirkulierenden Medien in MPS schienen die organoide Stoffwechselfähigkeit zu verbessern (Abbildung 5C und Abbildung 5E). Es gab einen signifikanten APAP-Zerfallsunterlauf, der nicht ohne Strömung gesehen wurde. Interessanterweise bestätigen invitro CYP3A4-Aktivitätsexperimente die Hypothese, dass das Vorhandensein von Strömung im System die Funktionalität menschlicher Leberäquivalente erhöht. Wie in Abbildung 4Jdargestellt, war die Aktivität von CYP 3A4 bei Leberäquivalenten, die sowohl unter dem Durchfluss als auch bei APAP-Behandlungsbedingungen unter Fließengehalten gehalten wurden, signifikant höher. Ebenso zeigten die unter Flussgehalten gehaltenen Leberäquivalente (dynamisch) eine Tendenz, die Proteinexpression von Albumin im Vergleich zu denen zu erhöhen, die sowohl zu Beginn als auch bei APAP-behandelten Bedingungen ohne Durchfluss (statisch) gehalten wurden (Abbildung 4G).

Im Vergleich zum Konzentrationszeitprofil nach oraler Verabreichung von APAP an den Menschen zeigt unser mikrophysiologisches System viel größere t1/2 (Halbwertszeit) (Abbildung 5F). Dies geschieht, wie bereits erwähnt, denn während wir ein Zwei-Organ-System mit Darm und LeberÄquivalente haben, die das Medikament absorbieren und verstoffwechseln können, gibt es keine Niere Äquivalent zu ausscheiden APAP und seine Metaboliten aus dem Plasmafach38. Darüber hinaus zeigt das mikrophysiologische System kleinere Cmax (Spitzenplasmakonzentration) und größere tmax (Zeit, Um Cmax zu erreichen) als das, was typischerweise für den Menschen beobachtet wird(Abbildung 5F). Dies ist eine Folge der Unterschiede in der Skala der In-vitro- und In-vivo-Experimente. Insgesamt gibt es drei Hauptunterschiede zwischen dem Konzentrations-Zeit-Profil, das mit dem mikrophysiologischen System gewonnen wurde, und den Profilen, die nach oraler Verabreichung von APAP an den Menschen erhalten wurden: größer t1/2, kleiner cmax und größer tmax (Abbildung 5F). Während das größere t1/2 auf das Fehlen einer Niere zurückzuführen ist, die APAP und seine Metaboliten aus dem Plasmaäquivalent ausscheidet, sind kleinere Cmax und größere tmax Folgen des kleinen Umfangs des Experiments im Vergleich zum menschlichen Körper. Die besten Skalierungsstrategien für den Aufbau und Betrieb mikrophysiologischer Systeme sind nach wie vor ein aktives Forschungsgebiet, und es ist unwahrscheinlich, dass ein einheitlicher Ansatz für alle Systeme optimal ist39. Darüber hinaus können mathematische Modellierung oder maschinelles Lernen verwendet werden, um Korrekturen anzuwenden oder die Kartierung von der Mikroskala auf den vollen Maßstab zu lernen, um In-vitro-Daten, die mit den mikrophysiologischen Systemen erhalten wurden, auf das beim Menschen beobachtete In-vivo-Verhalten zu extrapolieren40.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon am Referat 522 INSERM und Dr. Christian Trepo am Referat 271 INSERM für den Einsatz des Biologischen Materials (Hepa RG Zellen) und für die bereitstellung für uns, um die akademische Forschung durchzuführen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Chemie Ausgabe 166 Mikrophysiologisches System Acetaminophen ADMETox Organoide
Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber
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Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

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