Summary
Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.
Abstract
Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas son una herramienta importante en la biología celular que proporciona información sobre los procesos celulares que de otro modo podrían ser pasados por alto, malinterpretados o malinterpretados por el análisis de células fijas. Si bien la imagen y el análisis de células fijas son robustos y suficientes para observar el estado estacionario celular, puede ser limitado en la definición de un orden temporal de eventos a nivel celular y está mal equipado para evaluar la naturaleza transitoria de los procesos dinámicos, incluyendo progresión mitotica. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo y tiene la capacidad de capturar la dinámica de procesos que de otro modo estarían mal representados en las imágenes de células fijas. Aquí describimos un enfoque para generar células que llevan marcadores etiquetados fluorescentesmente de cromatina y microtúbulos y su uso en enfoques de imágenes de células vivas para monitorear la alineación del cromosoma metafásico y la salida mitótica. Describimos técnicas basadas en imágenes para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitológica, incluida la identificación de células en varias etapas de la mitosis, la identificación y el seguimiento de defectos mitoticos, y el análisis de la dinámica del husillo y destino de células mitoticas tras el tratamiento con inhibidores mitoticos.
Introduction
El análisis basado en imágenes de células fijas se utiliza comúnmente para evaluar los cambios en el nivel de población celular en respuesta a diversas perturbaciones. Cuando se combina con la sincronización celular, seguida de la recopilación y la creación de imágenes de puntos de tiempo en serie, estos enfoques se pueden utilizar para sugerir una secuencia celular de eventos. Sin embargo, las imágenes de células fijas están limitadas en el sin embargo, las relaciones temporales están implícitas para una población y no se demuestran a nivel de celdas individuales. De esta manera, mientras que la creación de imágenes y análisis de células fijas es suficiente para observar fenotipos robustos y cambios en el estado estacionario, la capacidad de detectar cambios transitorios a lo largo del tiempo y cambios que afectan solo a una subpoblación de las células es imperfecta. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares y subcelulares dentro de una sola célula, o población celular, con el tiempo y sin la ayuda de enfoques de sincronización que pueden afectar el comportamiento celular 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
La formación de un husillo mitético bipolar es esencial para la segregación cromosómica adecuada durante la división celular, lo que resulta en dos células hijas genéticamente idénticas. Los defectos en la estructura del husillo mitotico que corrompen la progresión mitotica y comprometen la fidelidad de la segregación cromosómica pueden resultar en divisiones celulares catastróficas y una menor viabilidad celular. Por esta razón, los venenos mitoticos que alteran la formación del husillo son terapias prometedoras para limitar la rápida proliferación de células cancerosas7,8,9. Sin embargo, el análisis de células fijas de la estructura del husillo después de la adición de venenos mitoticos es limitado en su capacidad para evaluar el proceso dinámico de formación del husillo y puede no indicar si los cambios observados en la estructura del husillo son permanentes o son en cambio transitorio y puede ser superado para permitir una división celular exitosa.
En este protocolo, describimos un enfoque para evaluar la dinámica de la mitosis después de las perturbaciones del husillo por imágenes de células vivas. Usando la línea celular RPE-1 inmortalizada hTERT diseñada para expresar un Histone 2B con la etiqueta RFP para visualizar la cromatina, junto con una tubulina con etiqueta EGFP para visualizar microtúbulos, el tiempo de alineación del cromosoma metafase, el inicio de la anafase y, en última instancia, el destino celular mitotico se evalúa mediante señales visuales de movimiento cromosómico, compactación y morfología nuclear.
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Protocol
1. Generación de células hTERT-RPE-1 que expresan establemente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) y -tubulin-EGFP (tub-EGFP)
NOTA: Todos los pasos siguen técnicas asépticas y tienen lugar en un armario de seguridad de nivel de bioseguridad II+ (BSL2+).
- Generar retrovirus que lleven los genes de interés (-tubulina-EGFP y RFP-H2B) por la transfección de células 293T con los plásmidos lentivirales apropiados de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sistema de administración de transfección basado en lípidos.
- Día 1: Utilice una pipeta Pasteur de vidrio desechable para aspirar el medio de cultivo celular de una placa de células subconfluentes 293T y lavar el medio residual con solución salina tamponada de fosfato (PBS) añadiendo 5 ml de PBS. Gire para distribuir PBS sobre el fondo de la placa, luego aspire el PBS con una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril.
- Añadir 2 ml de trippsina al 0,05% que se haya precalentado a 37 oC y devolver la placa a una incubadora humidificada a 37 oC con 5% deCO2 durante 2 a 5 min para permitir la liberación de células adherentes de la superficie del plato de cultivo celular.
- Añadir 8 ml de medio de águila modificado (DMEM) fresco de Dulbecco, complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina a la placa que contiene trippsina.
- Resuspenda las células pipeteando suavemente y transfiera la suspensión a un tubo cónico estéril de 15 ml. Coloque el tubo cónico en una centrífuga equilibrada y gire a 161 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar suavemente las células.
- Aspirar la solución media/trippsina de células peletizadas y resuspender células en 10 ml de DMEM suplementadas con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina. Utilice un hemocitómetro para contar la suspensión de celda 293T y la placa 2 x 106 293T células por pozo de una placa de 6 pocillos.
- Células de cultivo en un volumen total de 2 ml del medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementadas con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina y manteneren en una incubadora humidificada a 37oC con 5% de CO2.
- Día 2: Pipeta de 7 ml de reactivo de entrega de transfección a base de lípidos y 100 ml de medio sérico reducido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y permite que se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos (tubo #1).
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, pipeta 1 g de vector de expresión RFP-H2B (o 1 g de vector de expresión de tubulina-EGFP), junto con un reactivo potenciador de 5 l (según sea necesario según las directrices del fabricante), 0,5 g pMD2.G y 1 g de psPAX2 y 100 l de reactivo reducido medio sérico (tubo #2).
- Combine el contenido del paso 1.1.7 y el paso 1.1.8 pipeteando cuidadosamente #2 en tubos #1 e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: La reacción se puede escalar según sea necesario para la transfección de células en pozos adicionales. - Pipetear la reacción de transfección en gota al pozo deseado que contiene 293T en 2 ml de medio y devolver el plato a la incubadora humidificada a 37 oC con 5% de CO2.
NOTA: Para generar células que expresen tanto RFP-H2B como -tubulina-EGFP, genere un virus independiente para cada construcción de expresión (pasos 1.1.7- 1.1.9). - Día 3: Aspirar y sustituir el medio por 2 ml de DMEM fresco complementado con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina. Devolver el plato a la incubadora humidificada a 37oC con un 5% deCO2.
- Día 4: Recoger el medio que contiene partículas de virus expresadas, siendo cauteloso no interrumpir o eliminar las células 293T. Filtrar el medio que contiene partículas de virus pasándolo a través de un filtro de 0,45 m unido a una jeringa de 5 ml. Virus aliquot para almacenamiento a corto plazo a 4 oC, o almacenamiento a largo plazo a -80 oC.
NOTA: Las partículas virales obtenidas de esta manera estarán presentes en un rango de 1 x 107 a 1 x 108 Unidades transductoras/ml. Como las células y células que producen virales y las células que se infectan se cultivan en el mismo medio, no se requiere concentración viral para reemplazar el medio y las partículas virales filtradas se pueden utilizar directamente para infectar las células. - Semilla 2 x 105 hTERT-RPE-1 células por pozo de un plato de 6 pozos en preparación para la infección viral. Células de cultivo en 2 ml de DMEM suplementadas con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina y mantener en una incubadora humidificada a 37oC con 5% co2.
- Día 5: Añadir bromuro de hexadimetrina (p. ej., polibreno) a las células hTERT-RPE-1 a una concentración final de 8 g/ml. Infectar las células con una mezcla de 500 ml de virus diluido en 500 ml de medio de cultivo celular.
NOTA: La solución de stock de bromuro de hexadimetrina se prepara en agua destilada estéril y luego se filtra a través de un filtro de 0,45 m. - Día 6: Usando una pipeta Pasteur de vidrio desechable, aspirar el medio de los pozos que contienen las células infectadas por el virus. Reemplace el medio de cultivo celular por 2 ml de DMEM que contenga 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina y concentraciones adecuadas de antibióticos para seleccionar para la integración y expresión de plásmido.
NOTA: El plásmido de expresión de tubulina-EGFP utilizado en los experimentos descritos lleva un gen de resistencia a la puromicina y el plásmido de expresión RFP-H2B conlleva un gen de resistencia a la blasticidina. Por lo tanto, se utilizan 10 g/ml de puromicina y 2 g/ml de blasticidina para la selección de células de la tubulina-EGFP, RFP-H2B que expresa las células de hTERT RPE-1. Las concentraciones de antibióticos utilizados para la selección pueden diferir para varias líneas celulares utilizadas. - Mantener las células bajo selección de antibióticos durante 5-7 días, reemplazando el medio cada 3 días por un medio fresco que contenga reactivos de selección adecuados.
NOTA: Las celdas deben mantenerse en la subconfluencia durante la selección y deben ampliarse según sea necesario, como se describe en los pasos 1.1.1 a 1.1.4. - Utilice imágenes de inmunofluorescencia para confirmar la expresión de construcciones etiquetadas.
NOTA: Si lo desea, se pueden derivar clones de una sola celda para obtener niveles de expresión uniformes dentro de la población de células. Una vez que se confirman los clones estables, las células se pueden mantener bajo las condiciones de cultivo estándar en ausencia de selección de antibióticos.
2. Preparación de células para imágenes de células vivas después de perturbaciones del husillo mitotico
NOTA: Utilice técnicas asépticas y realice los pasos de un armario de seguridad BSL2.
- Usando una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril, aspirar el medio de la placa de cultivo que contiene la línea celular que lleva la(s) construcción(es) de expresión (del paso 1.7). Lave brevemente las células con 10 ml de PBS estéril. Gire para distribuir PBS sobre el fondo de la placa, luego aspire PBS con una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril.
- Añadir 2 ml de 0,05% de trippsina a la placa de 10 cm. Incubar la placa a 37 oC durante 2-5 min o hasta que las células se hayan separado de la superficie de la placa.
- Añadir 8 ml de medio fresco a la placa que contiene trippsina. Resuspenda las células pipeteando suavemente y transfiera la suspensión a un tubo cónico estéril de 15 ml. Coloque el tubo cónico en una centrífuga equilibrada y gire a 161 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar suavemente las células.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en 10 ml de PBS pipeteando suavemente con una pipeta serológica de 10 ml. Coloque el tubo cónico en una centrífuga equilibrada y gire a 161 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar suavemente las células.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en 10 ml del medio fresco pipeteando suavemente con una pipeta serológica de 10 ml.
- Cuente las células, luego calcule el número de celda usando un hemacitómetro y diluya a una concentración de 1-2 x 105 células/ml en el medio de cultivo celular. Semilla de 500 l de la suspensión celular a cada pocto de una placa inferior estéril de 12 poloes. Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular y permita que las células se adhieran a la superficie de la placa.
NOTA: Las imágenes de celda sin vida requieren que las celdas estén bien adheridas para que permanezcan asociadas con el plano de imagen durante la adquisición de la imagen. La duración del tiempo necesario para que las celdas se adhieran después del revestimiento puede diferir de una línea de celda a la siguiente y debe optimizarse para la línea de celda en estudio. - Hasta 30 minutos antes de iniciar la toma de imágenes de lapso de tiempo, agregue una concentración relevante de un fármaco mitético a uno o más de los pozos sembrados con células. Para tener en cuenta el impacto potencial del disolvente orgánico en el comportamiento celular, agregue un volumen igual del diluyente del inhibidor a las células como controles. Por ejemplo, asegúrese de que la adición de 100 nM del inhibidor específico de la quinasa mitológica Aurora A (por ejemplo, alisertib) sea paralela a un volumen igual de DMSO, el diluyente de este fármaco, en un pozo de control de las células.
NOTA: El análisis comparativo de los cambios dinámicos en la progresión mitótica requiere que se preparen pozos de células en ausencia de perturbaciones para permitir la toma de imágenes de los mitoses normales en paralelo a las condiciones experimentales.
3. Microscopio configurado para imágenes de lapso de tiempo de RFP-H2B, células de expresión de la tubulina-GFP(Figura 1, Figura 2)
- Coloque la placa de cultivo celular que contiene RFP-H2B, -tubulina-GFP que expresa las células hTERT RPE-1 que se mostrarán en un inserto de etapa apropiado en un microscopio de epifluorescencia invertido que está equipado con una cámara de alta resolución (tamaño de píxel de 0,67 m a 20x), un cámara ambiental precalentada a 37oC, y un sistema de entrega para humidificado 5% CO2.
NOTA: Las cámaras ambientales cerradas o las inserciones de escenario controladas por temperatura pueden ser apropiadas siempre que se pueda entregar un 5% deCO2 humedecido y obtener un control de temperatura estable. - Utilice un objetivo de aire 20x con una apertura numérica de 0,5 y equipado para la fluorescencia de alto contraste y el contraste de fase o la imagen de campo brillante. Vea las celdas con el contraste de fase o el campo brillante y ajuste el curso y el enfoque fino en el microscopio para enfocar las células.
- Identifique y establezca los tiempos de exposición óptimos para la adquisición de imágenes de campo brillante, GFP y RFP seleccionando el cubo de filtro respectivo con la excitación y emisión apropiadas para los fluoróforos que se crearán imágenes. También puede hacer clic en el botón de exposición automática para introducir un tiempo de exposición predeterminado. Si la señal no es lo suficientemente intensa, seleccione pixel binning para permitir tiempos de exposición más cortos haciendo clic en la pestaña de binning y seleccionando 2 x 2 pixel binning en el menú desplegable.
NOTA: La fototoxicidad puede afectar la progresión mitótica y la viabilidad celular. El fracaso de las células mitoticas en las poblaciones de control para completar las mitosis normales puede ser una indicación de que los tiempos de exposición y/o la duración de las imágenes deben optimizarse aún más. - Utilice un software de adquisición y análisis que permita adquirir simultáneamente imágenes multicoordenadas y multipozos y definir los parámetros para la adquisición de imágenes.
- Seleccione y calibre la etapa del microscopio a la placa multi-pozo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice el software de adquisición de imágenes para resaltar o seleccionar los pozos que se crearán en la imagen haciendo clic en los pozos relevantes en el diagrama del formato de placa que se está utilizando.
- En el panel de control GeneratedPoints (Figura 2), defina las coordenadas dentro de cada pozo que se crearán en la imagen haciendo clic en la pestaña Colocación de puntos y seleccionando la colocación de coordenadas predefinida o aleatoria de el menú desplegable. Seleccione la pestaña Area de trabajo y seleccione restringido en el menú desplegable para restringir el área de selección de coordenadas para excluir los límites del pozo. Haga clic en las fichas Recuento y Distribución para seleccionar el número y la distribución de los puntos que se van a capturar por pozo, respectivamente.
NOTA: El número de coordenadas que se pueden crear imágenes por pozo dentro del incremento de 5 minutos de tiempo estará limitado por el número de pozos a crear imágenes, así como el tiempo de exposición para cada canal. Típicamente, 5-8 coordenadas por pozo son suficientes para observar al menos 50 células en cada condición progresan a través de la mitosis dentro de 4 h. - Seleccione e introduzca el intervalo de tiempo y la duración para recopilar imágenes haciendo clic e introduciendo los valores en el panel de control TimeSequence.
NOTA: La adquisición de imágenes cada 1 a 5 minutos es adecuada para supervisar la dinámica de la progresión mitotica. La duración total de la toma de imágenes debe reflejar el punto final deseado y la tasa de proliferación de la línea celular. Por ejemplo, 4 horas es suficiente para ver muchas células progresar a través de la mitosis, 16 horas es suficiente para ver la mayoría de las células RPE-1 en un progreso de la población asincrónica a través de la mitosis.
4. Análisis de imagen de lapso de tiempo para determinar el tiempo metafásico y el destino de células mitoticas después de perturbaciones mitoticas del husillo
NOTA: Realice el análisis de imágenes utilizando un software de adquisiciónde imágenes (Tabla de materiales),ImageJ o un software de análisis de imágenes comparable.
- Visualice la cromatina etiquetada RFP-H2B seleccionando las imágenes capturadas con el cubo de filtro RFP en su lugar. Identificar una célula que entra en la mitosis como se indica en la compactación inicial de la cromatina(Figura 2C, punta de flecha azul) y la envolvente nuclear se descomponen (cuando el límite nuclear ya no excluye la -tubulina-EGFP).
- Determinar el momento mitótico de la alineación de la metafase y el inicio de la anafásica en celdas individuales: Realice un seguimiento de la célula a través de puntos de tiempo consecutivos en la película adquirida para determinar el número de puntos de tiempo/minutos desde la entrada mitótica hasta la cromatina etiquetada con RFP-H2B completa la alineación en el ecuador de celdas durante la metafase(Figura 2C,punta de flecha amarilla).
- Para monitorear el tiempo mitático, la fidelidad mitotica y el destino celular, continúe rastreando la célula a través de puntos de tiempo consecutivos para identificar la coordenada de tiempo en la que la segregación del cromosoma anafásico es evidente(Figura 2C,punta de flecha blanca) y/o donde se ha producido la descomposición de la cromatina y la reforma de la envolvente nuclear (como se indica mediante la exclusión de la tubulina del núcleo).
NOTA: Las perturbaciones en el ensamblaje del husillo o la progresión mitológica se pueden evaluar en función del tiempo necesario para obtener un husillo mitético bipolar y lograr una alineación cromosómica completa, o para completar la segregación del cromosoma anafásico. - Visualice RFP-H2B para identificar las células de cada población que presentan defectos mitóticos, incluidos los cromosomas rezagados y los puentes de cromatina durante la segregación del cromosoma anafásico.
NOTA: La fidelidad mitotica comprometida también puede dar lugar a células hijas multinucleadas o micronucleadas y se puede visualizar en las células después de la salida mitotica, como en la Figura 3.
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Representative Results
Evaluación de la progresión mitotica en presencia de perturbaciones del husillo
La regulación del enfoque del polo del husillo es un paso esencial en la formación adecuada del husillo bipolar. Interrupción en este proceso a través de agotamiento de proteínas, inhibición de fármacos o alteraciones en el número centrosoma estructura del husillo corrupta y retrasar o detener la progresión mitológica10,11,12,13. Sin embargo, algunas perturbaciones sólo retrasan transitoriamente la formación del husillo con las células que continúan finalmente a través de la mitosis para completar la segregación cromosómica de la anafase14. En ausencia de enfoques de sincronización de células, que pueden afectar indirectamente a los procesos mitoticos1,2, las células progresan a través de la mitosis de forma asincrónica(Figura 2C). Utilizando RFP-H2B para identificar la cromatina, las células mitóticas con cromatina compacta se pueden escenificar como en prometafase (las anteriores a la alineación completa de la metafase: Figura 2C, puntas de flecha azul), metafase (alineación cromosómica completa: Figura 2 C, puntas de flecha amarillas) y anafase (cromosomas segregados hacia los polos del husillo: Figura 2C, puntas de flecha blancas). La captura de 5-8 coordenadas a lo largo de 4 h es suficiente para seguir la progresión de al menos 50 células a través de la mitosis en una condición dada. Para investigar la dinámica del conjunto del husillo tras las alteraciones en el número centrosoma y/o la inhibición de Aurora A quinasa, un importante regulador del polo del husillo que se enfoca14,15,16, 17, utilizamos la imagen de lapso de tiempo de células vivas de células humanas con 2 centrosomas, o aquellas que contienen centrosomas supernumerarios. Las células se cultivaron en presencia o ausencia del inhibidor de la quinasa Aurora A antes del inicio de la toma de imágenes. Las células con 2 centrosomas experimentan la interrupción en la progresión mitotica cuando se tratan con el inhibidor de la quinasa aurora A, pero en última instancia son capaces de lograr la alineación del cromosoma metafase(Figura 2C,punta de flecha amarilla). Por el contrario, las células con >2 centrosomas son exquisitamente sensibles a la inhibición de Aurora A y presentan un aumento en las células de prometafase y una ausencia de células metafásicas, lo que indica un retraso en el ensamblaje del husillo y la progresión mitotica.
La Figura 3 demuestra que estos enfoques de imágenes de lapso de tiempo son suficientes para supervisar tanto el ensamblaje del husillo como la fidelidad mitotica. Al visualizar la tubulina-EGFP, se observó que las células que experimentan la interrupción del husillo (que se muestra aquí debido a la sobreduplicación centrosoma) experimentan cambios dinámicos a medida que se logra el enfoque del polo del husillo y se forma un husillo mitótico bipolar en preparación para división celular. Simultáneamente con el conjunto del husillo, el movimiento cromosómico se puede visualizar con RFP-H2B para evaluar la alineación del cromosoma y la fidelidad de la segregación. Las células mitoticas que experimentan multipolaridad transitoria del husillo son susceptibles a errores de conexión que dan lugar a cromosomas rezagados durante la anafase y forman micronúcleos en la fase G1 posterior del ciclo celular. Tales defectos son evidentes con estos enfoques de imágenes de células vivas.
Los cambios en la progresión dinámica de la mitosis alteran el tiempo mitotico y afectan el destino celular mitotico
Después de la descomposición de la envolvente nuclear, la formación del husillo y el movimiento cromosómico se pueden rastrear a través de las etapas de la mitosis para evaluar la progresión mitotica, la duración y el destino de las células que progresan a la anafase. La amplificación centrosoma, una característica común en muchos tipos de cáncer, se caracteriza por la presencia de centrosomas adicionales y formación de husillo multipolar18,19,20. Como las divisiones multipolares dan como resultado células hijas altamente aneuploides y probablemente inviables, las células cancerosas agrupan activamente centrosomas adicionales para formar un husillo bipolar y se someten a una división bipolar5,20,21, 22,23,24. Utilizando enfoques de imágenes de células vivas, nuestros resultados representativos muestran que las células con un contenido centrososoma normal son capaces de proceder de la descomposición de la envolvente nuclear a través de la alineación de la metafase y el inicio de la anafase para lograr una división bipolar en menos de 30 minutos ( Figura 4 A,D,E). En presencia de centrosomas adicionales, casi el 50% de las células son capaces de superar un husillo mitotico multipolar transitorio y formar un husillo bipolar y una división celular completa(Figura 4C,D). Las células restantes son incapaces de alcanzar un husillo bipolar y como resultado salen de la mitosis a través de una división multipolar(Figura 4B,D). Independientemente de si se logra la bipolaridad del husillo, las células con centrosomas adicionales presentan una duración significativamente mayor de la mitosis en comparación con las células con 2 centrosomas, lo que indica que la dinámica de la progresión mitotica puede alterarse incluso cuando los cambios en resultado mitotico no son evidentes(Figura 4E).
Figura 1: Selección de los parámetros del microscopio y la cámara. (A) Representación de la ventana para seleccionar el objetivo deseado y el cubo de filtro adecuado utilizando un software de adquisición de imágenes. Se muestra la selección del objetivo de ampliación 20x y el cubo de filtro brightfield. (B) Las células de la placa de muestra se encuentran y se enfocan mediante microscopía de contraste de fase o campo brillante. (C) Representación de la ventana para establecer los parámetros de exposición para cada captura de imagen. El binning de píxeles se puede utilizar, si es necesario, para reducir el tiempo de exposición por captura y minimizar el daño fotográfico a las células. La barra de escala es de 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Captura de imágenes y análisis de la microscopía de lapso de tiempo. (A y B) Representación de la ventana que indica cómo se establecen los parámetros de adquisición de imágenes mediante el software de adquisición de imágenes de trabajos HCA de NIS Elements. Este software permite imágenes multiororororreos y multipozos a lo largo del tiempo. Cada trabajo se puede modificar para especificar los pozos y coordenadas que se van a capturar. (C) Marcos de tiempo únicos de cuatro condiciones de un experimento. RFP-H2B se utiliza para rastrear la cromatina. La compactación y el posicionamiento de la cromatina se utilizan para identificar diferentes etapas de la mitosis: Prometafase (compactación en ausencia de alineación cromosómica, punta de flecha azul), Metafase (alineación completa del cromosoma en el ecuador celular, punta de flecha amarilla) y Anafase (tras el inicio de la segregación cromosómica sincrónica, punta de flecha blanca). La barra de escala es de 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La creación de imágenes de lapso de tiempo visualiza defectos en la fidelidad mitotica. Las células que contienen centrosomas adicionales forman husillos multipolares y a menudo los agrupan en un husillo bipolar antes de completar la división celular. Aquí, una célula entra en mitosis con siete polos de husillo distintos (asteriscos blancos) que, con el tiempo, se agrupan en dos polos principales del husillo. En este punto, los cromosomas son capaces de alinearse a lo largo del ecuador del husillo, y la célula procede a la anafase. La multipolaridad transitoria ha permitido una unión mal de un solo cromosoma. Este error no resuelto da como resultado un cromosoma rezagado durante la anafase que se incorpora en un micronúcleo en una célula hija (etiquetada con una flecha). La cromatina se visualiza con RFP-Histone 2B y los microtúbulos se visualizan con la tubulina-EGFP. Las marcas de tiempo de cada panel indican minutos con respecto a la aparente avería de la envolvente nuclear, tal como se juzga mediante la detección de tubulina dentro del límite nuclear. La barra de escala es de 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los cambios en la progresión dinámica de la mitosis alteran el tiempo mitotico y afectan el destino celular mitotico. RFP-H2B, que se muestra en rojo, se utiliza para rastrear el movimiento de la cromatina y la GFP de la tubulina, que se muestra en verde, se utiliza para monitorear el número y la organización del polo centrosoma/husillo. La pérdida de la exclusión de la GFP-tubulina del núcleo, simultánea con la compactación temprana de la cromatina, es una indicación de que la envolvente nuclear se ha descompuesto (NEB) en preparación para la división de células mitóticas. La exclusión nuclear de la GFP-tubulina es evidente tras la salida mitotica y la reforma de la envolvente nuclear. (A) Una célula con dos centrosomas forma un husillo bipolar y progresa a través de la anafase para formar dos células hijas. (B y C) Las células con centrosomas adicionales entran en la mitosis para formar un husillo multipolar. (B) Algunas de estas células con centrosomas adicionales se retrasan en la mitosis sin lograr un husillo bipolar y progresan a la anafase multipolar completa. (C) Otras células con centrosomas adicionales presentan un retraso transitorio en la progresión mitótica mientras agrupan centrosomas adicionales para habilitar la anafase bipolar. (D) Las células con centrosomas adicionales son capaces de someterse a una división bipolar aproximadamente el 50% del tiempo, mientras que las células restantes con centrosomas adicionales se someten a una división multipolar. (E) Las células con centrosomas adicionales han aumentado el tiempo mitético independientemente del destino mitético final (anafase bipolar o multipolar). La barra de escala es de 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La resolución temporal proporcionada por las imágenes de lapso de tiempo permite la visualización y evaluación de eventos celulares secuenciales dentro de células individuales. Los enfoques que hacen uso de la sincronización celular seguido de la recopilación y fijación de celdas en puntos de tiempo secuenciales son limitados en que las comparaciones se hacen en última instancia entre poblaciones de celdas. En contextos donde la respuesta celular a las perturbaciones puede ser no uniforme, o donde el proceso que se visualiza es dinámico, la imagen de lapso de tiempo de células vivas está mejor equipada para seguir y analizar tanto la dinámica de células individuales, como la heterogeneidad dentro de una población celular. De esta manera, las imágenes de lapso de tiempo son particularmente útiles para monitorear la progresión celular a través de las etapas dinámicas de la mitosis y evaluar cómo las perturbaciones a esta progresión impactan en última instancia la fidelidad de la división celular mitotica y el posterior destino celular.
Si bien hay una serie de ventajas para la creación de imágenes celulares en vivo, se asocian desafíos significativos que deben ser considerados y mitigados cuando sea posible. Uno de los desafíos consiste en mantener las condiciones ambientales adecuadas para garantizar la viabilidad celular y la proliferación durante la toma de imágenes. Para lograr esto, la configuración de imágenes debe incluir una cámara ambiental que regula tanto la temperatura como elCO2. Alternativamente, las células se pueden tomar imágenes a corto plazo con sólo regulación de temperatura si se hace en una cámara cerrada. En ambos casos, se debe emplear el uso de una tabla antivibración y/o enfoques basados en hardware para mitigar las fluctuaciones de enfoque axial (por ejemplo, El enfoque perfecto de Nikon) para mantener el enfoque de la placa durante toda la duración del experimento. Una segunda preocupación significativa con las imágenes celulares vivas es el potencial de fotodaño y fotoblanqueo. El fotoblanqueo es una preocupación en la que el fluoróforo que se está fotografiando disminuye gradualmente en intensidad de fluorescencia a medida que avanza la imagen. Sin embargo, la exposición a la luz de excitación de alta intensidad que da lugar a fotoblanqueo también es tóxica para las células y se debe tener cuidado para minimizar la exposición celular mediante la disminución de los tiempos de exposición, los intervalos de adquisición de imágenes y la duración total de la secuencia de imágenes 25. Las consecuencias de no optimizar las condiciones de imagen para minimizar la fototoxicidad pueden incluir la generación de daño en el ADN y otros cambios celulares que a su vez pueden comprometer la interpretación y la comprensión del experimento. Si la viabilidad celular se convierte en una preocupación con las imágenes a largo plazo, se debe hacer un esfuerzo para utilizar el binning de píxeles (para permitir exposiciones más cortas) y aumentar la duración entre las capturas de imagen posteriores. Una preocupación adicional es que la etiqueta fluorescente puede alterar el comportamiento de la proteína a la que se fusiona, o que la integración de la construcción de la expresión viral en el genoma puede afectar el comportamiento celular. Para tener en cuenta la posibilidad de que la adición de una etiqueta fluorescente pueda afectar a la función proteica, es necesaria una evaluación de la función proteica tras la adición de una etiqueta fluorescente terminal N o C y una comparación con la función proteica no etiquetada. Para determinar si surgen efectos adversos sobre el comportamiento celular debido a la perturbación del locus genómico en el que se ha integrado la construcción viral, se deben derivar múltiples clones de una sola célula, en comparación con las células que carecen de la proteína etiquetada, y probados para monitorear que la aptitud celular y la progresión mitótica no se perturban. Alternativamente, los efectos fuera del objetivo de la integración aleatoria de la construcción de la expresión viral pueden mitigarse mediante la integración dirigida de la proteína de fusión en el locus endógeno u otras regiones conocidas del genoma, utilizando enfoques basados en CRISPR.
Los enfoques para identificar y caracterizar los principales reguladores de la progresión mitotica han dependido en gran medida de las imágenes de células fijas. Los reguladores mitéticos identificados de esta manera han sido explotados posteriormente en terapias dirigidas a células cancerosas que proliferan rápidamente7,8,9. Sin embargo, los fármacos antimitoticos no siempre funcionan uniformemente en diferentes tipos de cáncer y en muchos casos la percepción de los fenotipos mitoticos que preceden a enfoques quimioterápicos exitosos o fallidos siguen sin estar claros. La toma de imágenes de lapso de tiempo de células vivas para rastrear células mitoticas en presencia y ausencia de fármacos que perturban el husillo tiene el potencial de proporcionar la información necesaria para identificar los moduladores más propensos a dar lugar a mitosis catastróficas y una viabilidad comprometida de células cancerosas con un impacto mínimo en las células normales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
DLM es compatible con un NSF GRFP. ALM cuenta con el apoyo del Premio Smith Family a la Excelencia en Investigación Biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
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