Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids
Summary
We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.
Abstract
Een driedimensionale spheroid-celcultuur kan nuttiger resultaten verkrijgen in celexperimenten, omdat het de celmicroomgevingen van het levende lichaam beter kan simuleren dan de tweedimensionale celcultuur. In deze studie hebben we een elektrisch motorgestuurd lab-on-a-CD-platform (compact disc) gemaakt, een centrifugale microfluïdisch-gebaseerd spheroid (CMS)-cultuur systeem, om driedimensionale (3D) celsferoïden te maken die een hoge centrifugale kracht implementeren. Dit apparaat kan rotatiesnelheden variëren om zwaartekracht condities te genereren van 1 x g tot 521 x g. Het CMS-systeem is 6 cm in diameter, heeft 500 μm micro putten, en is gemaakt door molding met Polydimethylsiloxaan in een polycarbonaat mal premade door een computer numerieke besturings machine. Een barrière muur bij de ingang van het kanaal van het CMS-systeem maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen gelijkmatig in de chip te verspreiden. Aan het einde van het kanaal is er een diagebied dat de cellen in staat stelt om de micro putjes in te voeren. Als demonstratie werden sferoïden gegenereerd door monocultuur en cocultuur van stamcellen en menselijke Long fibroblasten met een hoge zwaartekracht, met behulp van het systeem. Het CMS-systeem gebruikte een eenvoudig bedienings schema om cocultuurspheroids van verschillende structuren van concentrische, Janus en sandwich te produceren. Het CMS-systeem zal nuttig zijn in celbiologie en weefsel engineering studies die sferoïden en organoïde cultuur van enkele of meerdere celtypen vereisen.
Introduction
Het is gemakkelijker om biologische in vivo micro-omgevingen te simuleren met driedimensionale (3D) spheroid-celcultuur dan met tweedimensionale (2D) celkweek (bijv. conventionele Petri schaalcelcultuur) om fysiologisch realistische experimentele resultaten1. Op dit moment beschikbare spheroid-vormings methoden omvatten de hangende druppel techniek2, vloeistofoverlay-techniek3, Carboxymethyl cellulose techniek4, op magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5, en het gebruik van bioreactoren6. Hoewel elke methode zijn eigen voordelen heeft, is verdere verbetering van de reproduceerbaarheid, productiviteit en het genereren van cocultuursspheroïden noodzakelijk. Bijvoorbeeld, terwijl de magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5 relatief goedkoop is, moeten de effecten van sterke magnetische velden op levende cellen zorgvuldig worden overwogen. De voordelen van spheroid-cultuur, met name in de studie van mesenchymale stamcel differentiatie en proliferatie, zijn gemeld in verschillende onderzoeken7,8,9.
Het centrifugale microfluïdische systeem, ook bekend als lab-on-a-CD (compact disc), is handig om de vloeistof binnen eenvoudig te regelen en de rotatie van het substraat te benutten en is dus gebruikt in biomedische toepassingen zoals immunoassays10, colorimetrische assays voor het opsporen van biochemische markers11, nucleïnezuur versterking (PCR) testen, geautomatiseerde bloedanalyse systemen12, en all-in-One centrifugale microfluïdische apparaten13. De drijvende kracht die de vloeistof bestuurt, is de centripetale kracht die wordt gecreëerd door rotatie. Bovendien kunnen meerdere functies van mengen, valving en monster splitsing eenvoudig worden gedaan in dit enkele CD-platform. In vergelijking met de bovengenoemde biochemische analysemethoden zijn er echter minder proeven uitgevoerd om cd-platforms toe te passen op kweekcellen, met name sferoïden14.
In deze studie tonen we de prestaties van het centrifugale microfluïdische spheroid-systeem (CMS) door monocultuur of cocultuur van stamcellen die afkomstig zijn van menselijke adipeus (hASC) en humane Long fibroblasten (MRC-5). Dit artikel beschrijft in detail de onderzoeksmethodologie van onze groep15. Zo kan het spheroid Culture lab-on-a-CD-platform eenvoudig worden gereproduceerd. Er wordt een CMS-genererend systeem gepresenteerd dat bestaat uit een CMS-kweek chip, een chip houder, een DC-motor, een motor bevestiging en een draaiend platform. De Motorsteun is 3D bedrukt met acrylonitril butadieen styreen (ABS). De chip houder en het roterende platform zijn CNC (computer numerieke besturing) bewerkt met de PC (polycarbonaat). De rotatiesnelheid van de motor wordt geregeld van 200 tot 4.500 rpm door het coderen van een PID (proportioneel-integraal-afgeleid) algoritme op basis van Pulsbreedtemodulatie. De afmetingen zijn 100 mm x 100 mm x 150 mm en het weegt 860 g, waardoor het gemakkelijk te hanteren is. Met behulp van het CMS-systeem kunnen sferoïden onder verschillende zwaartekracht condities worden gegenereerd van 1 x g tot 521 x g, zodat de studie van de promotie van celdifferentiatie onder hoge zwaartekracht kan worden uitgebreid van 2D-cellen16,17 naar 3D spheroid. Cocultuur van verschillende soorten cellen is ook een belangrijke technologie voor het effectief nabootsen van de in vivo omgeving18. Het CMS-systeem kan eenvoudig monocultuur-sferoïden genereren, evenals cocultuursspheroids van verschillende structuurtypen (bijv. concentrisch, Janus en sandwich). Het CMS-systeem kan niet alleen worden gebruikt in eenvoudige spheroid-studies, maar ook in 3D-organoïde-studies, om menselijke orgaan structuren te overwegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het CMS is een gesloten systeem waarin alle geïnjecteerde cellen zonder verspilling de titer binnenkomen, wat het efficiënter en zuiniger maakt dan conventionele titer-based spheroid-generatie methoden. In het CMS-systeem wordt de media elke 12 – 24 h vervangen door een zuigopening die is ontworpen om de media in de chip te verwijderen (Figuur 3a). Tijdens het zuig proces van de media worden nauwelijks media uit de titer ontsnapt door de oppervlaktespanning tussen de media en de wand van…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het basis wetenschaps onderzoeksprogramma (2016R1D1A1B03934418) en het bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) van het NRK, en gefinancierd door de Koreaanse overheid, MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Recherche en cancérologie. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
