Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden
Summary
Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.
Abstract
Eine dreidimensionale sphäroide Zellkultur kann in Zellexperimenten nützlichere Ergebnisse erzielen, da sie Zellmikroumgebungen des lebenden Körpers besser simulieren kann als zweidimensionale Zellkulturen. In dieser Studie haben wir eine elektrische motorgesteuerte Lab-on-a-CD-Plattform (Compact Disc) hergestellt, ein so genanntes zentrifugales mikrofluidisches Sphäroid-basiertesphärisches Sphäroid (CMS)-Kultursystem, um dreidimensionale (3D) Zellsphäride zu erstellen, die eine hohe Zentrifugalkraft implementieren. Dieses Gerät kann die Drehzahlen variieren, um Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gzu erzeugen. Das CMS-System hat einen Durchmesser von 6 cm, hat hundert 400 m Mikroschäbe und wird durch Formen mit Polydimethylsiloxan in einer Polycarbonatform hergestellt, die von einer numerischen Computersteuerungsmaschine vorgefertigt wurde. Eine Barrierewand am Kanaleingang des CMS-Systems nutzt Fliehkraft, um Zellen gleichmäßig im Chip zu verteilen. Am Ende des Kanals befindet sich ein Diabereich, der es den Zellen ermöglicht, in die Mikrobrunnen einzudringen. Als Demonstration wurden Sphäroide durch Monokultur und Kokultur menschlicher, aus Fettgewonnener Stammzellen und menschlicher Lungenfibroblasten unter Hochgravitationsbedingungen mit Hilfe des Systems erzeugt. Das CMS-System verwendete ein einfaches Betriebsschema, um Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturen von Konzentrisch, Janus und Sandwich zu produzieren. Das CMS-System wird in Zellbiologie- und Gewebe-Engineering-Studien nützlich sein, die Sphäroide und organoide Kultur von einzelnen oder mehreren Zelltypen erfordern.
Introduction
Es ist einfacher, biologische In-vivo-Mikroumgebungen mit dreidimensionaler (3D) Sphäroid-Zellkultur zu simulieren als mit zweidimensionaler (2D) Zellkultur (z. B. konventionelle Petrischalenzellkultur), um physiologisch realistischere experimentelle Ergebnisse1. Derzeit verfügbare Sphäroid-Bildungsmethoden umfassen die Hängetropfentechnik2, Flüssigkeits-Overlay-Technik3, Carboxymethyl-Zellulose-Technik4, magnetische kraftbasierte mikrofluidische Technik5, und die Verwendung von Bioreaktoren6. Obwohl jede Methode ihre eigenen Vorteile hat, ist eine weitere Verbesserung der Reproduzierbarkeit, Produktivität und Erzeugung von Cokultursphäroiden erforderlich. Während beispielsweise die magnetkraftbasierte mikrofluidische Technik5 relativ kostengünstig ist, müssen die Auswirkungen starker Magnetfelder auf lebende Zellen sorgfältig geprüft werden. Die Vorteile der Sphäroidkultur, insbesondere bei der Untersuchung der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung und -proliferation, wurden in mehreren Studien7,8,9berichtet.
Das zentrifugale mikrofluidische System, auch Lab-on-a-CD (Compact Disc) genannt, ist nützlich, um die Flüssigkeit im Inneren leicht zu steuern und die Rotation des Substrats zu nutzen und wurde daher in biomedizinischen Anwendungen wie Immunoassays10eingesetzt. kolorimetrische Assays zum Nachweis biochemischer Marker11, Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) Assays, automatisierte Blutanalysesysteme12und All-in-One-Zentrifugal-Mikrofluidika13. Die treibende Kraft, die die Flüssigkeit steuert, ist die Zentripetalkraft, die durch Rotation entsteht. Darüber hinaus können mehrere Funktionen des Mischens, Valvings und Sample-Splittings einfach in dieser einzigen CD-Plattform durchgeführt werden. Im Vergleich zu den oben genannten biochemischen Analysemethoden gab es jedoch weniger Versuche, CD-Plattformen auf Kulturzellen anzuwenden, insbesondere Sphäroide14.
In dieser Studie zeigen wir die Leistungsfähigkeit des zentrifugalen mikrofluidischen Sphäroid-basierten Sphäroid-Systems (CMS) durch Monokultur oder Kokultur von humanen Adipose-abgeleiteten Stammzellen (hASC) und menschlichen Lungenfibroblasten (MRC-5). In diesem Beitrag wird die Forschungsmethodik unserer Gruppe ausführlich beschrieben15. So kann die Sphäroid-Kultur-Lab-on-a-CD-Plattform einfach reproduziert werden. Ein CMS-Erzeugungssystem bestehend aus einem CMS-Kulturchip, einem Chiphalter, einem Gleichstrommotor, einer Motorhalterung und einer rotierenden Plattform wird vorgestellt. Die Motorhalterung ist 3D mit Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS) bedruckt. Der Chiphalter und die rotierende Plattform sind CNC (Computer numerische Steuerung) mit dem PC (Polycarbonat) bearbeitet. Die Drehzahl des Motors wird von 200 bis 4.500 Umdrehungen pro Minute durch Kodierung eines PID-Algorithmus (proportional-integral-derivative) auf Basis der Pulsweitenmodulation gesteuert. Seine Abmessungen sind 100 mm x 100 mm x 150 mm und wiegt 860 g, so dass es einfach zu handhaben. Mit dem CMS-System können Sphäroide unter verschiedenen Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gerzeugt werden, so dass die Untersuchung der Zelldifferenzierungsförderung unter hoher Schwerkraft von den 2D-Zellen16,17 bis 3D erweitert werden kann. Sphäroid. Kokultur verschiedener Zelltypen ist auch eine Schlüsseltechnologie, um die in vivo-Umgebung effektiv nachzuahmen18. Das CMS-System kann problemlos Monokultur-Sphäroide sowie Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturtypen (z. B. konzentrisch, Janus und Sandwich) erzeugen. Das CMS-System kann nicht nur in einfachen Sphäroidstudien, sondern auch in 3D-Organoidstudien genutzt werden, um menschliche Organstrukturen zu berücksichtigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das CMS ist ein geschlossenes System, bei dem alle injizierten Zellen ohne Abfall in den Mikrobrunnen gelangen, was es effizienter und wirtschaftlicher macht als herkömmliche mikrowellbasierte Sphäroid-Erzeugungsmethoden. Im CMS-System wird das Medium alle 12–24 h durch ein Saugloch ersetzt, das entwickelt wurde, um die Medien im Chip zu entfernen (Abbildung 3A). Während des Mediensaugvorgangs entweicht kaum ein Medium aus dem Inneren des Mikrobrunnens aufgrund der Oberflächenspannung …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) und das Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) des NRF und finanziert von der koreanischen Regierung MSIT unterstützt.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
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