Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari
Summary
Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.
Abstract
Una coltura tridimensionale di cellule sferoidi può ottenere risultati più utili negli esperimenti cellulari perché può simulare meglio i microambienti cellulari del corpo vivente rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. In questo studio, abbiamo fabbricato una piattaforma di laboratorio su un CD (disco compatto) azionata a motore elettrico, chiamata sistema di coltura di sferoidi a base microfugale centrifuga , per creare sferoidi cellulari tridimensionali (3D) che implementano una forza centrifuga ad alta dimensione. Questo dispositivo può variare la velocità di rotazione per generare condizioni di gravità da 1 g a 521 x g. Il sistema CMS ha un diametro di 6 cm, ha cento micropozzi di 400 m ed è realizzato stampando con polidimetilsilosa in uno stampo in policarbonato prefatto da una macchina di controllo numerico al computer. Una parete di barriera all’ingresso del canale del sistema CMS utilizza la forza centrifuga per diffondere le cellule in modo uniforme all’interno del chip. Alla fine del canale, c’è una regione di scorrimento che permette alle cellule di entrare nei micropozzi. Come dimostrazione, gli sferoidi sono stati generati dalla monocoltura e dalla cocultura delle cellule staminali derivate dall’adiposità umana e dei fibroblasti polmonari umani in condizioni di alta gravità utilizzando il sistema. Il sistema CMS ha utilizzato un semplice schema operativo per produrre sferoidi cocoltura di varie strutture concentriche, giano e sandwich. Il sistema CMS sarà utile negli studi di biologia cellulare e ingegneria tissutale che richiedono sferoidi e coltura organoide di tipi di cellule singole o multiple.
Introduction
È più facile simulare microambienti biologici in vivo con colture di cellule sferoidi tridimensionali (3D) che con colture cellulari bidimensionali (2D) (ad esempio, colture convenzionali di parabole di Petri) per produrre sperimentali più fisiologicamente realistici risultati1. I metodi di formazione degli sferoidi attualmente disponibili includono la tecnica di caduta appesa2, latecnica di sovrapposizione dei liquidi3, latecnicadi cellulosa carboxymetil bioreattori6. Anche se ogni metodo ha i suoi benefici, è necessario un ulteriore miglioramento della riproducibilità, della produttività e della generazione di sferoidi cocoltura. Ad esempio, mentre la tecnica microfluidica basata sulla forza magnetica5 è relativamente poco costosa, gli effetti dei forti campi magnetici sulle cellule viventi devono essere attentamente considerati. I benefici della cultura degli sferoidi, in particolare nello studio della differenziazione e della proliferazione delle cellule staminali mesenchymic, sono stati riportati in diversi studi7,8,9.
Il sistema microfluidico centrifugo, noto anche come lab-on-a-CD (compact disc), è utile per controllare facilmente il fluido all’interno e sfruttare la rotazione del substrato ed è stato quindi utilizzato in applicazioni biomediche come immunoasiste10, saggi colorimetrici per rilevare marcatori biochimici11, analisi dell’acido nucleico (PCR), sistemi automatizzati di analisi del sangue12e dispositivi microfluidici centrizici all-in-one13. La forza motrice che controlla il fluido è la forza centripeta creata dalla rotazione. Inoltre, più funzioni di missaggio, valving e suddivisione dei campioni possono essere eseguite semplicemente in questa singola piattaforma CD. Tuttavia, rispetto ai suddetti metodi di analisi biochimica, ci sono stati meno studi che hanno applicato piattaforme CD alle cellule di coltura, in particolare gli sferoidi14.
In questo studio, mostriamo le prestazioni del sistema di sferoidi a base microfluidica centrifuga (CMS) per monocoltura o cocultura di cellule staminali derivate da adiposi umane (hASC) e fibroblasti polmonari umani (MRC-5). Questo documento descrive in dettaglio la metodologia di ricerca del nostro gruppo15. Così, la piattaforma lab-on-a-CD di coltura sferoide può essere facilmente riprodotta. Viene presentato un sistema di generazione CMS che comprende un chip di coltura CMS, un supporto per chip, un motore DC, un supporto motore e una piattaforma rotante. Il supporto motore è stampato in 3D con acrylonitrile butadiene styrene (ABS). Il supporto del chip e la piattaforma rotante sono CNC (controllo numerico al computer) lavorati con il PC (policarbonato). La velocità di rotazione del motore è controllata da 200 a 4.500 rpm codificando un algoritmo PID (proporzionale-integrale-derivato) basato sulla modulazione larghezza-impulso. Le sue dimensioni sono 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, rendendolo facile da maneggiare. Utilizzando il sistema CMS, gli sferoidi possono essere generati in varie condizioni di gravità da 1 x g a 521 x g, quindi lo studio della promozione della differenziazione cellulare sotto alta gravità può essere esteso da cellule 2D16,17 a 3D sferoide. La cocultura di vari tipi di cellule è anche una tecnologia chiave per imitare efficacemente l’ambiente in vivo18. Il sistema CMS può facilmente generare sferoidi monocoltura, così come sferoidi coculture di vari tipi di strutture (ad esempio, concentrico, Giano e sandwich). Il sistema CMS può essere utilizzato non solo in semplici studi sferoidi, ma anche in studi organoidi 3D, per considerare le strutture degli organi umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il CMS è un sistema chiuso in cui tutte le cellule iniettate entrano nel microwell senza rifiuti, rendendolo più efficiente ed economico rispetto ai metodi convenzionali di generazione di sferoidi a base di microwell. Nel sistema CMS, il supporto viene sostituito ogni 12-24 h attraverso un foro di aspirazione progettato per rimuovere il supporto nel chip (Figura 3A). Durante il processo di aspirazione dei supporti, a malapena qualsiasi supporto fuoriesce dall’interno del microposimo a caus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) e dal Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) della NRF e finanziata dal governo coreano MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
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