Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu
Summary
Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.
Abstract
Üç boyutlu küresel hücre kültürü hücre deneylerinde daha yararlı sonuçlar elde edebilir çünkü canlı vücudun hücre mikro ortamlarını iki boyutlu hücre kültüründen daha iyi simüle edebilir. Bu çalışmada, yüksek santrifüj kuvvet uygulayan üç boyutlu (3D) hücre küreselleri oluşturmak için santrifüj mikroakışkan tabanlı küresel (CMS) kültür sistemi adı verilen, motorlu laboratuvar-on-a-CD (kompakt disk) platformu imal ettik. Bu cihaz 1 x g ile 521 x garasında yerçekimi koşulları oluşturmak için dönüş hızlarını değiştirebilirsiniz. CMS sistemi 6 cm çapında, yüz 400 μm mikrowells vardır ve bir bilgisayar sayısal kontrol makinesi tarafından önceden yapılmış bir polikarbonat kalıp polidimethylsiloxane ile kalıplama tarafından yapılır. CMS sisteminin kanal girişindeki bir bariyer duvarı, çipin içindeki hücreleri eşit olarak yaymak için santrifüj kuvveti kullanır. Kanalın sonunda, hücrelerin mikrokuyulara girmesini sağlayan bir slayt bölgesi vardır. Bir gösteri olarak, küresel ler sistemi kullanarak yüksek yerçekimi koşulları altında insan yağ kaynaklı kök hücre ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür ve coculture tarafından üretildi. CMS sistemi, konsantrik, Janus ve sandviçin çeşitli yapılarının ortak kültür spheroidlerini üretmek için basit bir operasyon şeması kullansın. CMS sistemi, tek veya birden fazla hücre tipinin küresel ve organoid kültürünü gerektiren hücre biyolojisi ve doku mühendisliği çalışmalarında yararlı olacaktır.
Introduction
Biyolojik in vivo mikroortamları üç boyutlu (3D) küresel hücre kültürüne sahip simüle etmek, fizyolojik olarak daha gerçekçi deneysel üretmek için iki boyutlu (2D) hücre kültürüne (örn. geleneksel Petri kabı hücre kültürü) göre daha kolaydır. sonuçlar1. Şu anda mevcut küresel oluşum yöntemleri asma damla tekniği2dahil , sıvı-bindirme tekniği3, karboksimetil selüloz tekniği4, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan tekniği5, ve kullanımı biyoreaktörler6. Her yöntemin kendine has yararları olmasına rağmen, tekrarlanabilirlik, üretkenlik ve kokültür spheroidlerinin üretilmesinde daha fazla iyileşme gereklidir. Örneğin, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan teknik5 nispeten ucuz olmakla birlikte, güçlü manyetik alanların canlı hücreler üzerindeki etkileri dikkatle düşünülmelidir. Mezenkimal kök hücre farklılaşması ve çoğalması çalışmalarında özellikle sferoid kültürün yararları, çeşitli çalışmalarda bildirilmiştir7,8,9.
Santrifüj mikroakışkan sistem, aynı zamanda lab-on-a-CD (kompakt disk) olarak bilinen, kolayca içinde sıvı kontrol etmek ve substrat rotasyon istismar için yararlıdır ve böylece immünoassays10gibi biyomedikal uygulamalarda kullanılmıştır , biyokimyasal belirteçleri tespit etmek için kolorimetrik tahliller11, nükleik asit amplifikasyon (PCR) tahlilleri, otomatik kan analiz sistemleri12, ve all-in-one santrifüj mikroakışkan cihazlar13. Sıvıyı kontrol eden itici güç, rotasyontarafından oluşturulan merkezcil kuvvettir. Ayrıca, karıştırma, değerleme ve örnek bölme birden fazla işlevleri sadece bu tek CD platformu yapılabilir. Ancak, yukarıda bahsedilen biyokimyasal analiz yöntemleri ile karşılaştırıldığında, kültür hücrelerine CD platformları uygulayarak daha az çalışma olmuştur, özellikle küresel ler14.
Bu çalışmada santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) sisteminin insan yağkaynaklı kök hücrelerin (hASC) ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür veya kokültür ile performansını gösterdik (MRC-5). Bu yazı, grubumuzun araştırma metodolojisi15’iayrıntılı olarak açıklamaktadır. Böylece, küresel kültür lab-on-a-CD platformu kolayca çoğaltılabilir. CMS kültür çipi, yonga tutucu, DC motor, motor montaj ve dönen bir platformdan oluşan bir CMS üretim sistemi sunulmaktadır. Motor montaj akrilonitril bütadien stiren (ABS) ile basılmış 3D. Talaş tutucu ve dönen platform PC (polikarbonat) ile işlenmiş CNC (bilgisayar sayısal kontrol) vardır. Motorun dönüş hızı, darbe genişliği modülasyonuna dayalı bir PID (orantılı-integral-türevi) algoritması kodlayarak 200 ile 4.500 rpm arasında kontrol edilir. Boyutları 100 mm x 100 mm x 150 mm olup 860 g ağırlığındadır ve kullanımı kolaydır. CMS sistemi kullanılarak, küresel ler çeşitli yerçekimi koşulları altında oluşturulabilir 1 x g 521 x g,böylece yüksek yerçekimi altında hücre farklılaşma promosyon çalışma 2D hücrelerden uzatılabilir16,17 için 3D küresel. Çeşitli hücre türlerinin coculture da etkili in vivo ortamda taklit etmek için önemli birteknolojidir 18. CMS sistemi kolayca monokültür spheroids üretebilir, yanı sıra çeşitli yapı türlerinin coculture sheroids (örneğin, konsantrik, Janus, ve sandviç). CMS sistemi sadece basit küresel çalışmalarda değil, aynı zamanda 3Boyutlu organoid çalışmalarda, insan organ yapılarını göz önünde bulundurmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
CMS, enjekte edilen tüm hücrelerin atık olmadan mikrokuyu girdiği kapalı bir sistemdir ve bu da onu geleneksel mikrowell bazlı küresel üretim yöntemlerinden daha verimli ve ekonomik hale getirir. CMS sisteminde, ortam her 12-24 saatte bir çipteki ortamı çıkarmak için tasarlanmış bir emme deliğinden değiştirilir(Şekil 3A). Ortam emme işlemi sırasında, ortam ve mikrokuyu duvarı arasındaki yüzey gerilimi nedeniyle mikrokuyunun içinden neredeyse hiç ortam kaçamaz. PD…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, NMG’nin Temel Bilim Araştırma Programı (2016R1D1A1B03934418) ve NMG’nin Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) tarafından desteklenmiş ve Kore hükümeti MSIT tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Recherche en cancérologie. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
