Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels
Summary
Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l’aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.
Abstract
Une culture tridimensionnelle de cellules sphéroïdes peut obtenir des résultats plus utiles dans les expériences cellulaires parce qu’elle peut mieux simuler les microenvironnements cellulaires du corps vivant que la culture cellulaire bidimensionnelle. Dans cette étude, nous avons fabriqué une plate-forme de culture de laboratoire sur un CD (disque compact) à moteur électrique, appelée système de culture sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS), pour créer des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) mettant en œuvre une force centrifuge élevée. Cet appareil peut varier les vitesses de rotation pour générer des conditions de gravité de 1 x g à 521 x g. Le système CMS est de 6 cm de diamètre, a cent 400 micropuits m, et est fait en moulage avec du polydiméthylsiloxane dans un moule en polycarbonate préfabriqué par une machine de contrôle numérique de l’ordinateur. Un mur de barrière à l’entrée du canal du système CMS utilise la force centrifuge pour répartir les cellules uniformément à l’intérieur de la puce. À l’extrémité du chenal, il y a une région de glissement qui permet aux cellules d’entrer dans les micropuits. Comme démonstration, les sphéroïdes ont été générés par la monoculture et la coculture des cellules souches adipeuses humaines et des fibroblastes pulmonaires humains dans des conditions de haute gravité utilisant le système. Le système CMS a utilisé un schéma d’opération simple pour produire des sphéroïdes de coculture de diverses structures de concentrique, Janus, et sandwich. Le système CMS sera utile dans les études de biologie cellulaire et d’ingénierie tissulaire qui nécessitent des sphéroïdes et la culture organoïde de types de cellules simples ou multiples.
Introduction
Il est plus facile de simuler des microenvironnements biologiques in vivo avec une culture tridimensionnelle (3D) de cellules sphéroïdes qu’avec la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) (p. ex., la culture conventionnelle des cellules de plat Petri) pour produire une culture expérimentale plus réaliste sur le plan physiologique résultats1. Actuellement disponibles méthodes de formation sphéroïde comprennent la technique de chute de suspension2, technique de superpose use liquide3, technique de cellulose carboxymethyl4, technique microfluidique à base de force magnétique5, et l’utilisation de bioréacteurs6. Bien que chaque méthode ait ses propres avantages, une amélioration supplémentaire de la reproductibilité, de la productivité et de la production de sphéroïdes de coculture est nécessaire. Par exemple, alors que la technique microfluidique à base de force magnétique5 est relativement peu coûteuse, les effets des champs magnétiques forts sur les cellules vivantes doivent être soigneusement examinés. Les avantages de la culture sphéroïde, en particulier dans l’étude de la différenciation et de la prolifération des cellules souches mésenchymales, ont été rapportés dans plusieurs études7,8,9.
Le système microfluidique centrifuge, également connu sous le nom de laboratoire-sur-un-CD (disque compact), est utile pour contrôler facilement le fluide à l’intérieur et exploiter la rotation du substrat et a donc été utilisé dans des applications biomédicales telles que les immunossays10, essais colorimétriques pour détecter les marqueurs biochimiques11, amplification de l’acide nucléique (PCR), systèmes automatisés d’analyse sanguine12, et tout-en-un dispositifs microfluidiques centrifuges13. La force motrice contrôlant le fluide est la force centripète créée par la rotation. En outre, plusieurs fonctions de mixage, de valorisation et de fractionnement d’échantillons peuvent être effectuées simplement dans cette plate-forme CD unique. Cependant, par rapport aux méthodes d’analyse biochimique mentionnées ci-dessus, il y a eu moins d’essais appliquant des plates-formes de CD aux cellules de culture, en particulier les sphéroïdes14.
Dans cette étude, nous montrons la performance du système sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS) par monoculture ou coculture de cellules souches d’adipose humaine (hASC) et de fibroblastes pulmonaires humains (MRC-5). Cet article décrit en détail la méthodologie de recherche de notre groupe15. Ainsi, la plate-forme de laboratoire de culture sphéroïde sur un CD peut être facilement reproduite. Un système de génération CMS comprenant une puce de culture CMS, un support de puce, un moteur DC, une monture de moteur, et une plate-forme tournante, est présenté. La monture moteur est imprimée en 3D avec du styrène butadéin acrylonitrile (ABS). Le support de puce et la plate-forme rotative sont CNC (contrôle numérique de l’ordinateur) usiné avec le PC (polycarbonate). La vitesse de rotation du moteur est contrôlée de 200 à 4 500 tr/min en codant un algorithme PID (proportionnel-dérivé-dérivé) basé sur la modulation de la largeur des impulsions. Ses dimensions sont 100 mm x 100 mm x 150 mm et il pèse 860 g, ce qui le rend facile à manipuler. En utilisant le système CMS, les sphéroïdes peuvent être générés dans diverses conditions de gravité de 1 x g à 521 x g, de sorte que l’étude de la promotion de la différenciation cellulaire sous haute gravité peut être étendue à partir de cellules 2D16,17 à 3D Sphéroïde. La coculture de divers types de cellules est également une technologie clé pour imiter efficacement l’environnement in vivo18. Le système CMS peut facilement générer des sphéroïdes monoculturels, ainsi que des sphéroïdes de coculture de différents types de structures (p. ex. concentrique, Janus et sandwich). Le système CMS peut être utilisé non seulement dans de simples études sphéroïdes, mais aussi dans des études d’organoïdes 3D, pour tenir compte des structures des organes humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le CMS est un système fermé dans lequel toutes les cellules injectées pénètrent dans le micropuits sans déchets, ce qui le rend plus efficace et économique que les méthodes conventionnelles de production de sphéroïdes à base de micropuits. Dans le système CMS, les supports sont remplacés tous les 12 à 24 h par un trou d’aspiration conçu pour enlever les supports de la puce (Figure 3A). Pendant le processus d’aspiration des médias, presque aucun média s’échappe de l’intérie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche en sciences fondamentales (2016R1D1A1B03934418) et le Programme de développement des technologies bio et médicales (2018M3A9H1023141) de la NRF, et financé par le gouvernement coréen, MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
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