Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Stabil knockdown af gener kodning Ekstracellulære Matrix Proteiner i C2C12 Myoblast Cell Line Ved hjælp af Small-Hairpin (sh)RNA

Published: February 12, 2020 doi: 10.3791/60824
Automatic Translation
1, 1, 1
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Vi leverer en protokol til stably knockly nedslag gener kodning ekstracellulære matrix (ECM) proteiner i C2C12 myoblaster ved hjælp af små hårnål (sh) RNA. Målretning ADAMTSL2 som et eksempel, beskriver vi metoderne til validering af knockdown effektivitet på mRNA, protein, og cellulære niveau under C2C12 myoblast til myotube differentiering.

Abstract

Ekstracellulære matrix (ECM) proteiner er afgørende for skeletmuskulatur udvikling og homøostase. Den stabile knockdown af gener, der koder for ECM-proteiner i C2C12 myoblaster, kan anvendes til at undersøge disse proteiners rolle i skeletmuskulaturen. Her beskriver vi en protokol til at nedbryde ECM-proteinet ADAMTSL2 som et eksempel ved hjælp af små-hårnål (sh) RNA i C2C12 celler. Efter omladning af shRNA plasmider blev stabile celler udvalgt ved hjælp af puromycin. Vi beskriver endvidere vedligeholdelsen af disse cellelinjer og den fænotypiske analyse via mRNA-udtryk, proteinudtryk og C2C12-differentiering. Fordelene ved metoden er den relativt hurtige generation af stabile C2C12 knockdown celler og pålidelig differentiering af C2C12 celler i flernucleated myorør ved udtømning af serum i cellekultur mediet. Differentiering af C2C12-celler kan overvåges af lys feltmikroskopi og ved at måle ekspressioniske markørgener, såsom MyoD, myogenin eller myosin tung kæde (MyHC), der angiver udviklingen af C2C12 myoblastdifferentiering i myotubes. I modsætning til den forbigående knockdown af gener med små-interfererende (si) RNA, gener, der udtrykkes senere under C2C12 differentiering eller under myotube modning kan målrettes mere effektivt ved at generere C2C12 celler, der stably udtrykke shRNA. Begrænsninger af metoden er en variation i knockdown effektivitet, afhængigt af de specifikke shRNA, der kan overvindes ved hjælp af gen knockout strategier baseret på CRISPR / Cas9, samt potentielle off-target virkninger af shRNA, der bør overvejes.

Introduction

Ekstracellulære matrixproteiner (ECM) understøtter alle væv, mægle cellecellekommunikation og bestemmer celleskæbne. Dannelsen og den dynamiske ombygning af ECM er således afgørende for at opretholde væv og organhostasis1,2. Patologiske varianter i flere gener, der koder for ECM-proteiner , giver anledning til muskel- og skeletbesvær med fænotyper, der spænder fra muskeldystrophies til pseudomouscular build3,4. For eksempel, patogene varianter i ADAMTSL2 forårsage den ekstremt sjældne muskellidelse geleofysik dysplasi, som præsenterer med pseudomuskulær bygge, dvs en tilsyneladende stigning i skeletmuskulatur masse5. Sammen med genekspressiondata hos mus og mennesker, dette tyder på en rolle for ADAMTSL2 i skeletmuskulatur udvikling eller homøostase6,7.

Den protokol, som vi beskriver her, blev udviklet til at undersøge den mekanisme, hvorved ADAMTSL2 modulerer skeletmuskulatur udvikling og / eller homøostase i en celle kultur indstilling. Vi stably slået ned ADAMTSL2 i murine C2C12 myoblast cellelinje. C2C12 myoblaster og deres differentiering i myotubes er en velbeskrevet og udbredt celle kultur model for skeletmuskulatur differentiering og skeletmuskulatur bioengineering8,9. C2C12 celler går gennem forskellige differentieringtrin efter serum tilbagetrækning, hvilket resulterer i dannelsen af multinucleated myotubes efter 3−10 dage i kultur. Disse differentieringstrin kan overvåges pålideligt ved at måle mRNA-niveauer af forskellige markørgener, såsom MyoD, myogenin eller myosintung kæde (MyHC). En fordel ved at generere stabile genknockdowns i C2C12 celler er, at gener, der udtrykkes på senere stadier af C2C12 differentiering kan målrettes mere effektivt, sammenlignet med forbigående knockdown opnået ved små-forstyrrende (si) RNA, som typisk varer i 5-7 dage efter omladning, og er påvirket af transfektion effektivitet. En anden fordel ved protokollen som beskrevet her er den relativt hurtige generation af partier af C2C12 knockdown celler ved hjælp af puromycin udvælgelse. Alternativer, såsom CRISPR/Cas9-medieret genknockout eller isolering af primære skeletmuskelcelleprækursorer fra henholdsvis humane eller målgenmangelmus, er teknisk mere udfordrende eller kræver, at der er patientmuskelbiopsier eller målgenmangelmus. Men, svarende til andre celle kultur baserede tilgange, der er begrænsninger i brugen af C2C12 celler som model for skeletmuskulatur celle differentiering, såsom to-dimensionelle (2D) karakter af cellekultur set-up og manglen på in vivo mikromiljø, der er afgørende for at opretholde udifferentierede skeletmuskulatur prækursor celler10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af shRNA Plasmid DNA fra Escherichia coli

  1. Generation af klonale bakteriekolonier bærer shRNA plasmids
    1. Få glycerol lagre af E. coli transporterer målspecifikke shRNA plasmids og en kontrol plasmid fra kommercielle kilder (Tabel over materialer).
      BEMÆRK: Der blev anvendt tre forskellige shRNA-plasmider, der var rettet mod forskellige regioner i murine Adamtsl2 mRNA. En shRNA blev udvalgt til at målrette 3'-uoversatte region (3'UTR) af Adamtsl2 at lette redningsforsøg med udtryk plasmider kodning rekombinant fuld længde ADAMTSL2 eller individuelle ADAMTSL2 protein domæner. Desuden blev en forvrænget shRNA plasmid inkluderet som en negativ kontrol. Nærmere oplysninger om shRNA-sekvenserne findes i figur 1A.
    2. Tø shRNA bakterielglycerol lager ved stuetemperatur (RT). Overfør 10 μL bakteriel glycerollager på en Luria-Bertani (LB) agarplade suppleret med 100 μg/ml ampicillin (LB-Amp).
      BEMÆRK: LB-Amp plader fremstilles ved autoklavering 1 L LB medium (for 1 L: 10 g tryptone, 5 g gær ekstrakt, 10 g NaCl, justere pH til 7,0) sammen med 12 g agar. Mediet afkøles til ~50 °C, og der tilsættes ampicillin (lageropløsning: 50 mg/ml i sterilt vand) til en endelig koncentration af μg/ml (LB-Amp agar). Hæld straks ~ 20 ml LB-Amp agar i en 10 cm petriskål og lad agaren størkne før brug. 1 L LB-Amp agar er typisk tilstrækkelig til at hælde omkring 40 10 cm petriskåle. Petriskåle, der indeholder LB-Amp agar, er stabile i mindst en måned, hvis de opbevares forseglet ved 4 °C i mørke.
    3. Spred bakterier med steril drygalski spatel eller enhver anden passende metode til at opnå enkelte bakterielle kolonier. Inkubere bakterieplader på hovedet natten over ved 37 °C.
  2. Plasmid forberedelse
    1. Næste morgen fjernes petriskålen med de enkelte bakteriekolonier og opbevares ved 4 °C for at undgå overvækst af bakteriekolonierne og dannelsen af satellitkolonier. Seal petriskålen, hvis den opbevares natten over eller længere.
    2. Om eftermiddagen tilsættes 5 ml LB-Amp medium i et polypropylen bakteriekulturrør. Vælg en enkelt bakteriekoloni fra petriskålen dyrket natten over med en pipettespids og inokulere LB-Amp medium ved at skubbe pipettespidsen i bakteriekulturrøret, der indeholder LB-Amp-mediet.
    3. Inkubere bakteriekultur natten over i en shaker ved 250 omdrejninger i minuttet ved 37 °C med låget løst fastgjort for at muliggøre bestilning.
    4. Tag bakteriekulturrøret ud næste morgen og hold ved 4 °C for at undgå bakterieovervækst. Om eftermiddagen, resuspendbakterier ved vortexing og overføre 1 ml af natten bakteriekultur i 50 ml LB-Amp medium i en 250 ml konisk kolbe. Inkubernatten i en shaker ved 250 omdrejninger i minuttet ved 37 °C.
    5. Næste morgen overføres bakterier til et 50 ml engangscentrifugerør og centrifugebakterier ved 6.000 x g ved RT i 15 min. Fjern mediet og fortsæt med trin 1.2.6.
      BEMÆRK: Hvis plasmid-DNA ikke kan isoleres med det samme, skal LB-Amp-mediet fjernes efter centrifugeringstrinnet og opbevares i bakteriepelletved -20 °C.
    6. Følg instruktionerne for plasmid forberedelse kit (midi skala) for at udtrække plasmid DNA fra bakterierne. Vurder plasmid DNA-kvalitet ved at måle A260/A280-forholdet ved hjælp af et spektrofotometer.
      BEMÆRK: En A260/A280 forholdet mellem >1.8 er ønskeligt, hvilket indikerer høj renhed af plasmid DNA præparat. En lavere A260/A280-forhold tyder på kontaminering med protein eller utilstrækkelig fjernelse af ekstraktionsreagenser. Yderligere plasmid rensning trin kan være påkrævet.

2. Dyrkning og omladning af C2C12-celler og Puromycin Valg

  1. C2C12 cellekultur
    1. Tø C2C12 celler(Tabel over materialer)hurtigt i en 37 °C vandbad og hæld celler i sterile engangs 15 ml centrifuge rør, der indeholder 8 ml Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) medium suppleret med 100 enheder af penicillin og streptomycin antibiotika (serum-fri DMEM) i en celle kultur hætte. Centrifugerceller i 3 min ved 160 x g ved RT.
    2. Aspirate supernatant og resuspendercellepellet i 10 ml serumfri DMEM suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) (komplet DMEM). Overfør celler til 10 cm vævskultur behandlede plastretter. Inkuberceller i en befugtet kuvøse ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
    3. På den næste dag skal mediet udskiftes med frisk komplet DMEM.
    4. Udvid lav passage C2C12 celler på 3−4 10 cm retter. Når C2C12-cellerne når 50−60% sammenløb, aspireremediet og skyl C2C12-cellerne med 10 ml fosfatbufferet saltvand (PBS).
    5. Tilføj 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes i 2 min. ved RT. Monitor celleløsrivelse under et mikroskop og forlænge inkubationstiden, hvis det er nødvendigt, indtil de fleste af cellerne er løsrevet.
      BEMÆRK: Omhyggeligt at trykke på fadet kan bidrage til at løsne cellerne.
    6. Når de fleste af cellerne er løsrevet, tilsættes 10 ml komplet DMEM til skålen, pipette volumen op og ned flere gange, og overføre celle suspension til en steril engangsbrug 15 ml centrifuge rør. Centrifuger celler i 3 min ved 160 x g på RT. Aspirate supernatant og resuspendercellepellet i 2 ml frysemiddel (10% dimethylsulfoxid [DMSO]/90% FBS).
    7. Overfør to 1 ml aliquots pr. 10 cm fad i kryovialer. Inkuberi i en cellefrysningsbeholder fyldt med RT isopropanol i mindst 24 timer i en -80 °C fryser, hvilket resulterer i en frysehastighed på ca. -1 °C pr. min. Opbevar celler til langvarig brug i dampfasen af flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Leverandøren anbefaler at bruge C2C12-celler op til passage nummer 15. Forfatternes erfaringer viste også, at lavere passage tal celler viste mere konsekvent og hurtig differentiering i myotubes. Det er vigtigt at opretholde C2C12-celler ved lav celletæthed (<50% sammenløb) for at undgå for tidlig indtræden af differentiering. Differentierende eller differentierede C2C12-celler kan ikke vendes tilbage til den oprindelige myoblasttilstand og skal kasseres.
  2. Forberedelse af C2C12-celler til omladning
    1. Kultur udifferentierede C2C12 celler i en 10 cm skål, indtil de når 50-60% sammenløb. Aspirate mediet, skyl C2C12 celler med 10 ml PBS, og tilsæt 1 ml 0,25% trypsin-EDTA. Inkubere i 2 min på RT, overvåge celle udstationering under et mikroskop, og forlænge inkubationstiden, hvis det er nødvendigt, indtil de fleste af cellerne er løsrevet.
      BEMÆRK: Omhyggeligt at trykke på fadet kan bidrage til at løsne cellerne.
    2. Når de fleste af cellerne er løsrevet, tilsættes 10 ml komplet DMEM til skålen og overfør celleaffjedring til et sterilt engangsrør på 15 ml centrifuge. Centrifuger celler i 3 min ved 160 x g på RT. Aspirate supernatant og resuspendercellepellet i 4 ml komplet DMEM.
    3. Kombiner 10 μL celleaffjedring med 10 μL trypanblå i et 1,5 ml reaktionsrør, bland ved at pipettere op og ned og forsigtigt svippe reaktionsrøret og overføre celler til et tælledias. Bestem cellenummeret/mL'en ved hjælp af en automatiseret celletæller.
    4. Fortyndec2C12-celler til 50.000 celler/ml og frø 100.000 celler (2 ml) pr. brønd i en 6 brøndplade for at opnå ca. 40−50% sammenløb efter nattens inkubation. Inkuberceller i en befugtet kuvøse ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
  3. Omladning af C2C12-celler med shRNA plasmid ved hjælp af polyethylenimin (PEI) og puromycin udvælgelse
    1. Forberedelse af PEI-lagerløsning
      1. 16 mg PEI opløses i 50 ml sterilt destilleret vand (koncentration af lageropløsning: 0,32 mg/ml) i en 50 ml glasmedieflaske med skruelåg. Inkuber opløsningen ved 65 °C i 1 time og vortex opløsningen kraftigt flere gange i inkubationstiden for helt at opløse PEI.
      2. Juster til pH 8 ved tilsætning af 15 μL 1N HCl pr. 50 ml.
        FORSIGTIG: HCl er ætsende. Koncentreret HCl skal håndteres under røghætte. Efterforskere bør bære passende personlige værnemidler.
      3. PEI-opløsningen fryses ved -80 °C i 1 time med et løst fastgjort låg og tør hurtigt ved 37 °C i et vandbad for yderligere at forbedre opløseligheden. Gentag fryse-tø cyklus 3x.
      4. Opbevar PEI-lageropløsning i 0,5 ml aliquots til engangsbrug ved -20 °C.
    2. Transfection af C2C12 celler
      1. 25,5 μL (8,5 μL/μg plasmid DNA) af PEI-lageropløsningen med 100 μL 25 mM NaCl i et 1,5 ml reaktionsrør og inkuber i 5 min ved 37 °C. 3 μg plasmid-DNA med 100 μL 25 mM NaCl og inkuber i 5 min ved 37 °C.
      2. Kombiner hele mængden af fortyndet PEI reagens med fortyndet plasmid og bland ved forsigtigt at pipettere op og ned. Inkuber i 25 min ved 37 °C.
      3. I inkubationstiden ændres mediet af C2C12-cellerne, der er beregnet til omladning til DMEM uden FBS eller antibiotika.
      4. Tilføj PEI / DNA transfection mix til C2C12 celler dråbe for dråbe og bland konstant ved omhyggeligt at flytte cellekultur parabol. Inkuberi et befugtet inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Efter 6 timer skal mediet ændres, så det fuldføres.
    3. Udvælgelse af Puromycin
      1. 24 timer efter omladning, skift medium til markeringsmedium (komplet DMEM plus 5 μg/ml puromycin). Fortsæt valget af puromycin, indtil puromycinresistente C2C12-celler opnås, hvilket typisk tager 10−14 dage.
      2. Udvid puromycinresistente C2C12-celler ved lav celletæthed (<50−60% sammenløb), dvs.
        BEMÆRK: Vedligehold puromycinresistente C2C12-celler i nærvær af 5 μg/ml puromycin til rutinemæssig cellekultur og ekspansion. Puromycin blev imidlertid udeladt i differentieringsforsøgene.

3. Fænotypisk analyse af C2C12 Differentiering

BEMÆRK: De metoder, der er beskrevet nedenfor, kan let tilpasses til generel fænotypisk analyse af C2C12 myoblastdifferentiering i myorør ved at variere de specifikke antistoffer, der anvendes i vestlig blotting, eller de genspecifikke primere, der anvendes i den kvantitative polymerase analyse af kædereaktion (qPCR).

  1. C2C12 differentiering protokol og brightfield mikroskopi
    1. Frø 150.000 celler/ godt i en 12 brønd plade. Dyrkning puromycin-resistente C2C12 stabile celler i en 12 brønd plade i udvælgelsesmedium i en befugtet inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Kultur C2C12 celler i komplet DMEM, indtil de når ~ 95% sammenløb.
    2. For at fremkalde differentiering af C2C12-celler skal fuldstændig DMEM udskiftes med serumfri DMEM (dag 0 i differentiering). Skift medium hver anden dag og følg C2C12 myotube dannelse ved hjælp af en omvendt lyse felt mikroskop med kamera.
      BEMÆRK: Mange protokoller bruger 2% hesteserum til at differentiere C2C12-celler i myorør. I forfatternes hænder, fjerne serum helt havde en lignende effekt. Insulin beskrives som et tilsætningsstof til cellekulturmediet for at fremskynde C2C12-differentieringen. I den nuværende protokol blev C2C12-celler, der imidlertid er pålideligt differentieret i myorør inden for 3−5 dage efter serumafsavn og tilsætning af insulin, anset for unødvendig.
  2. Myosin tunge kæde (MyHC) immunfarvning at visualisere myotubes
    1. Frø 50.000 puromycinresistente C2C12 celler pr kammer i en 8 brønd kammer dias i 500 μL af komplet DMEM. Kulturceller, indtil de når 95% sammenløb i komplet DMEM (ca. 24 timer).
    2. For at fremkalde differentiering skal du skifte fra komplet DMEM til 500 μL serumfri DMEM (dag 0 i differentiering). På det eller de ønskede tidspunkt(er) aspireremediet og skylle cellerne 3x med 0,5 ml PBS.
      BEMÆRK: Udfør alle følgende trin på RT.
    3. Fastgør celler med 0,2 ml 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS i 15 min. Skyl celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
      FORSIGTIG: PFA er farlig. Tag passende forholdsregler og kassér paraformaldehydopløsning som farligt affald.
    4. Quench PFA med 0,2 ml 0,5 M glycin i PBS i 5 min. Skyl celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    5. Inkuberceller med 0,2 ml 0,1 % ikke-ionisk overfladeaktive stof/rengøringsmiddel (materialetabel)i PBS i 10 minutter for at permeabilisere cellemembranen. Bloker med 0,2 ml kvægserumalbumin i PBS i 1 time. Skyl celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    6. Inkuberceller med 0,2 ml MyHC antistof (1:200 i PBS) i 2 timer. Skyl celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    7. Inkuberede celler med 0,2 ml gede-anti mus rhodamin rødkonjugeret sekundært antistof (1:200 i PBS). Skyl cellerne med 0,5 ml PBS 3x i 5 minutter hver.
    8. Efter fjernelse PBS kvantitativt, tilføje en dråbe montering medium, der indeholder 4',6-diamidino-2-phenylindzol (DAPI) per kammer. Dæksel og hærdning smedium i henhold til producentens anvisninger. Seal med neglelak.
    9. Observere C2C12 celler ved hjælp af et fluorescensmikroskop ved hjælp af det relevante filtersæt.
  3. Vurdering af knockdown effektivitet ved kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qRT-PCR)
    1. Kultur C2C12 celler under differentiering betingelser i 12 brønd plader som beskrevet i afsnit 3.1.
    2. På det eller de ønskede tidspunkt(er) skal du fjerne differentieringsmediet, skylle cellerne én gang med 1 ml PBS og tilsættes 0,5 ml RNA-ekstraktionsreagens (Materialetabel)pr. brønd. Lyse cellerne ved omhyggeligt at pipettere op og ned og overføre cellelysat til et sterilt 1,5 ml reaktionsrør. Isoler RNA ved omhyggeligt at følge producentens protokol.
      FORSIGTIG: RNA-ekstraktionsreagensen indeholder fenol. Det skal bruges under en røg hætte. Opsaml RNA-ekstraktionsreagensaffaldet, og affald bortskaffes som farligt affald. Efterforskere bør bære passende personlige værnemidler.
    3. Den endelige RNA-pellet opløses i 20 μL diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet vand. Bestemme mængden og kvaliteten af RNA-præparatet ved hjælp af et spektrofotometer, og a260/A280-forholdet bestemmes som en kvalitetsforanstaltning.
      BEMÆRK: Et typisk udbytte fra 1 brønd af en 12 brøndplade er 5−7 μg total RNA med et A260/A280-forhold på 1,8−2.
    4. For at fordøje resterende co-renset genomisk DNA fortyndes 1 μg RNA i et samlet volumen på 8 μL DEPC-behandlet vand i et PCR-rør. Der tilsættes 1 μL 10x reaktionsbuffer og 1 μL DNase I (1 enhed/μL) (materialetabel) og inkuberes i 15 min ved RT. Tilsættes 1 μL stopopløsning (25 mM EDTA) og inkuber ved 70 °C i 10 min.
    5. For at generere cDNA skal du kombinere 10 μL DNase behandlet RNA med 10 μL 2x omvendt transskriptionasmastermix, indeholdende omvendt transskriptionase, tilfældige primere, 4 mM dNTP mix (1 mM hver dATP, dTTP, dGTP og dCTP) og omvendt transskriptionasereaktionsbuffer. Inkuber reaktionen i en termocycler ved hjælp af programmet som anbefalet af producenten. Fortynd cDNA med vand i forholdet 1:5.
    6. For at forberede qRT-PCR-reaktionen kombineres 5 μL SYBR grøn qPCR master mix med henholdsvis 0,5 μL genspecifikke frem- og bakprimere (lager: 10 μM) og 2 μL DEPC-behandlet vand pr. reaktion. Pipette qPCR reaktion i en brønd af en 96 godt qRT-PCR plade og tilsæt 2 μL fortyndet cDNA. Opstil tre tekniske replikater for hver biologisk replikat og omfatter et rengøringsgen, f.eks.
    7. Forstærke PCR-produktet med en qRT-PCR termocycler ved hjælp af følgende program: 50 °C i 2 min (uracil-DNA glycosylase [UDG] aktivering), 95 °C i 2 min (dual-lock DNA polymerase aktivering), 40 cyklusser af 95 °C for 15 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 1 min.
    8. Kvantificer qRT-PCR-resultater ved hjælp af DDCt-metoden, der normaliseres til et rengøringsgen, f.eks.
  4. Vurdering knockdown effektivitet ved vestlige blotting
    1. Frø 300.000 puromycin-resistente C2C12 celler per brønd i en 6 godt plade til vestlige blot analyse. Efter 24 timer skal du skifte mellem- til serumfri DMEM for at indlede differentiering (dag 0 i differentieringen).
    2. På det eller de ønskede tidspunkt(er) indsamles to 1 ml serumfrit konditioneret medium i et 1,5 ml reaktionsrør og centrifugerer i 5 min ved 500 x g ved RT for at fjerne adskilte celler og celleaffald.
      BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt, hvis ECM-proteiner eller andre udskillede proteiner i konditioneret medium undersøges. Hvis proteinet af interesse er lokaliseret i cytoplasmaet eller er membranbundet, skal cellekulturmediet aspireres, og cellelysis-trinnene (3.4.7−3.4.12) aspireres. Cellelyse bør udføres parallelt med proteinudfældningfra serumfrit konditioneret medium for at minimere proteolytisk nedbrydning og andre utilsigtede konsekvenser af langvarig opbevaring af cellelaget.
    3. Efter centrifugering overføres 1 ml konditioneret medium i et nyt 1,5 ml reaktionsrør og udfældeproteiner ved at tilsætte 0,391 ml af en blanding af trichloreddikesyre (TCA) og ikke-ionisk overfladeaktive/vaskemiddel. Kort vortex blandingen og inkubere i 10 min på is.
      BEMÆRK: Forbered proteinnedbørsblandingen direkte før brug ved at kombinere 0,252 ml 55% TCA og 0,139 ml 1% ikke-ionisk overfladeaktive/vaskemiddel pr. mL konditioneret medium og vortex kort. Løsningen bliver uklar.
      FORSIGTIG: TCA er ætsende og skal håndteres korrekt.
    4. Pelletde de udfældede proteiner ved >16.000 x g i 10 min ved 4 °C. Kassér supernatanten.
      FORSIGTIG: Supernatantet indeholder TCA og skal indsamles separat og bortskaffes som farligt materiale.
    5. Proteinpellet3x vaskes med iskold acetone og centrifuger hver gang ved >16.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    6. Proteinpelletlen lufttørres i 3−4 min ved RT og opløses i 50 μL 1x natriumdodecylulfat polyacrylamidgelelektroforrese (SDS-PAGE) prøvebuffer (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% glycerol og 0,004% bromophenol blå, suppleret med 5% β-mercapethanolto). Prøven koges i 5 min ved 95 °C, og den anvendes til vestlig blotting til at detektere det ønskede målprotein ved hjælp af standardprocedurer.
      FORSIGTIG: β-Mercaptoethanol er lugtende og giftig og skal håndteres i en røghætte.
    7. For intracellulære og membranbundne proteiner skylles cellelaget én gang med 2 ml PBS.
    8. Tilføj 1 ml PBS og løsne celler ved at skrabe dem af brønden ved hjælp af en celleskraber. Cellerne opsamles i et 1,5 ml reaktionsrør og centrifuger ved 3.420 x g i 3 min ved 4 °C. Cellepellet 3x med 1 ml PBS og centrifugeres ved 3.420 x g i 3 min ved 4 °C hver gang.
    9. For at lyse cellerne skal cellepelletlen i 0,2 ml lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTS, 1% NP40, 1% natriumdeoxycholate, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat, og 1 mM natrium orthovanadate) suppleret med 1x EDTA-fri protease hæmmer cocktail reagens og inkubati30 min på is.
    10. Ultralydtil 15 s på is med en effektindstilling på 10 ved en driftsfrekvens på 23 kHz.
    11. Celleaffald fjernes ved centrifugering ved 13.680 x g i 20 min ved 4 °C. Saml supernatant i et nyt 1,5 ml reaktionsrør, og proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af en kommerciel Bradford-analyse eller enhver anden egnet metode.
    12. For hver prøve kombineres 100 μg protein med 5x SDS-PAGE-prøvebuffer i et samlet volumen på 60 μL og kog i 5 min ved 95 °C. Analyser prøver af standard vestlige blotting procedurer for tilstedeværelsen af det ønskede mål protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udvælgelse af puromycinresistentC2C12 kan opnås på 10−14 dage efter omladning på grund af effektiv eliminering afikke-resistente, dvs. Typisk, mere end 80% af cellerne løsrive sig fra cellekultur parabol og disse celler fjernes under rutinemæssig celle vedligeholdelse. Puromycin-resistente C2C12 celler udtrykke kontrol (forvrænget) shRNA bevare spindel-form, aflange celle morfologi ved lav celletæthed og evnen til at differentiere i myotubes. C2C12 differentiering ved serum tilbagetrækning kan overvåges ved lyse felt mikroskopi og ved immunfarvning for myotube markør myosin tunge kæde (MyHC) (Figur 2). MyHC-positive myorør observeres mellem 3−5 dage efter differentieringsindledning. Myotubes er multinucleated som vist ved tilstedeværelsen af mere end én DAPI-positiv kerne inden for MyHC-positive celle grænser. Figur 3A viser lyse feltbilleder af stabile C2C12-celler, der dyrkes i komplet DMEM. Den knockdown effektivitet præsenteres her spænder fra 40−60%(figur 3B). Da mRNA blev høstet i den proliferative tilstand, hvor lidt Adamtsl2 udtrykkes, knockdown effektivitet synes lav, men knockdown effektivitet forventes at være større på senere tidspunkter under C2C12 differentiering, hvor endogenadamtsl2 er induceret og dermed udtrykt på meget højere niveauer. Western blot analyse bekræftede en vellykket knockdown af ADAMTSL2 i cellen lysate opnået fra C2C12 celler stabilt udtrykke shRNA 3086 sammenlignet med kontrol shRNA (Figur 3C).

Figure 1
Figur 1: Udvælgelse af stabile C2C12-celler efter omladning med shRNA-kodning plasmid DNA. (A) Tabel med angivelse af målområdet (CDS, kodningssekvens; 3'-UTR, 3'-uoversat region), klon-id (i det følgende benævnt 1977, 3086 og 972) og sekvens af de shRNA'er, der anvendes til at målrette Adamtsl2. (B) Panelerne viser udvælgelsen af C2C12-celler, der er transfected med kontrolshRNA og de tre Adamtsl2-målretningshRNA'er. C2C12 celler blev transfected med shRNA plasmids og puromycin blev tilføjet til mediet efter 24 h. Puromycin-følsomme celler vises runde og i sidste ende løsrive sig under rutinemæssig cellekultur vedligeholdelse (røde pile). I modsætning hertil synes puromycinresistente celler, der huser de integrerede shRNA plasmids spindelformede, let aflange, fastgjorte og levedygtige (blå pile). Skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: C2C12 myoblast til myotube differentiering. Lyse feltbilleder af differentierende C2C12-celler viser cellers tætte brostensbelagte udseende i begyndelsen af differentieringen (dag 0−1) og flernuklerede myorør blev observeret efter dag 5 (øverste række). Immunfarvning af differentierende C2C12 celler med myosin tung kæde (MyHC, rød), som er en markør for myotubes, er induceret på dag 3 i differentiering (midterste panel). Nuclei blev plettet med DAPI og det fusionerede billede er vist i de nederste paneler. Skalastænger = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Validering af stabil knockdown i prolifererende C2C12 celler. (A) Lyse feltbilleder af stabile C2C12-celler, der dyrkes i komplet DMEM. Skalastænger = 300 μm. (B) qRT-PCR analyse af Adamtsl2 mRNA-udtryk i stabile C2C12-celler. Ct værdier blev normaliseret til husholdning genet Hprt1. mRNA blev høstet før differentieringens indtræden. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. (C) Western blot analyse, der viser reduceret ADAMTSL2 protein i cellen lysate / ECM fraktion fra C2C12 celler stabilt udtrykke shRNA 3086. EndogenadamTSL2 blev opdaget ved hjælp af et skræddersyet polyklonalt peptidantistof (tilgængelig efter anmodning). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her en protokol for den stabile knockdown af ECM proteiner i C2C12 myoblaster og for fænotypisk analyse af differentieringen af C2C12 myoblaster i myotubes. Flere faktorer bestemmer resultatet af eksperimentet og skal overvejes nøje. Fastholdelse C2C12 celler i prolifererende fase er et kritisk skridt til at holde C2C12 celler i myoblast prækursor tilstand. Fastholdelse af evne til C2C12 celler til konsekvent at differentiere i myotubes afhænger af i) passage antallet af celler, ii) tætheden af de dyrkede celler under rutinemæssig vedligeholdelse, og iii) næringsstof tilgængelighed, der kræver hyppig og regelmæssig genopfyldning af cellekultur medium11,12,13. På grund af nogle ukendte mekanismer, højere passage nummer C2C12 celler også miste potentialet for yderligere myoblast fusion11. Instruktionerne fra udbyderen af C2C12-cellerne foreslår, at disse celler opretholdes op til passage nummer 15. Derefter kan differentieringspotentialet reduceres, og forsøg med sådanne celler kan resultere i mindre konsekvent myotubedannelse. På den anden side kan celletætheden under vedligeholdelse resultere i lignende virkninger9. Opnåelse af flydende C2C12 celletætheder under rutinemæssig cellekultur fremme indledningen af C2C12 myoblast differentiering og dermed kan have en negativ indflydelse på differentieringpotentiale af cellepopulationen. Derfor er det af afgørende betydning at forhindre C2C12 celler i at nå høje celletætheder under rutinemæssig C2C12 celle vedligeholdelse. Dette kan opnås ved allerede under-dyrkning C2C12 celler ved lav celle tætheder (<50-60% sammenløb). Serumsult bruges til at fremkalde C2C12 celledifferentiering i myotubes. Derfor, opretholde celler i længere tid uden at genopfylde medium alvorligt udstødning næringsstof og serum niveauer. Genopfyldning med frisk serum, der indeholder medium mindst hver anden dag kan forhindre udbrud af uønsket for tidlig differentiering på grund af næringsstof og serum afsavn.

C2C12 differentiering er typisk induceret af serum sult. Procentdelen af serum, der anvendes til at fremkalde C2C12 differentiering kan i høj grad påvirke resultaterne, specielt den tid, det tager at danne MyHC positive myotubes14,15. Flere protokoller viser vellykket induktion af differentiering under forskellige serum koncentrationer. Der er rapporteret om anvendelse af 2−10% FBS eller hesteserum og fuldstændig serummangel, og alle tilstande resulterer i C2C12 myotubedannelse. Serumprocenten eller ændringen i serumpartiet kan ændre markører for differentiering betydeligt. Desuden kan serumkilden påvirke forsøgsresultatet, da oprindelseslandet måske tillader eller ikke tillader visse tilsætningsstoffer under kvægserumproduktionen8. Serumniveauet kan justeres for at opnå differentieringshastigheden i henhold til specifikke eksperimentelle krav. Insulin kan tilsættes til dyrkningsmediet C2C12-celler for at fremskynde differentiering og myotubedannelse16.

Evnen til at levere plasmider kodning shRNA eller rekombinant proteiner i C2C12 celler via omladning er et attraktivt træk ved C2C12 celler. Flere kommercielle liposom-baserede transfektionreagens er tidligere blevet brugt til at levere plasmid DNA i C2C12 celler med variabel rapporteret omfektion effektivitet17,18,19,20,21. PEI viser også rimelig transfektioneffektivitet og er et omkostningseffektivt alternativ til liposome-baserede transfektionreagenser. En sammenligning mellem transfektion med et kommercielt liposombaseret transfektionsreagens og PEI viste ingen væsentlig ændring i transfektionseffektiviteten , og der blev fundet lidt højere effektivitet med PEI22. I vores hænder var transfektionseffektivitet med PEI tilstrækkelig til at generere stabile puromycinresistente C2C12-celler. Men et kritisk skridt i denne protokol er at holde inkubationstiden for transfektionsreagens kort. Som nævnt ovenfor, C2C12 celler er følsomme over for serum tilbagetrækning og langvarig udsættelse for lave serum betingelser under omladning kan favorisere C2C12 celle differentiering. Da omladning udføres uden serum, blev inkubationstiden efter omladningen holdt kort for hurtigt at genforsyne serumholdigt medium for at forhindre for tidlig differentiering. Puromycin blev tilføjet til kulturmediet 24 timer efter omladning for at indlede udvælgelsen af puromycinresistente C2C12-celler. Metoder til indførelse af plasmid DNA i differentierede myotubes omfatter omladning (op til 85% effektivitet rapporteret), elektroporation, eller en biolistic tilgang23,24,25. Alternativt kan stabile C2C12-celler, der huser en uudslettelig shRNA plasmid, genereres for at vælte gener på senere stadier af myotube-differentiering eller under myotubemodning26.

Den metode, der er beskrevet her resulterede i stabil knockdown af ADAMTSL2 i C2C12 celler, hvor dens funktion under differentiering i myotubes nu kan bestemmes. Dannelsen af stabile knockdown celler kan være særligt vigtigt at studere funktionen af proteiner, der er induceret under myotube dannelse eller modning. Forbigående omladning med siRNA for eksempel ville ikke være tilstrækkeligt til effektivt at vælte disse gener, da den forbigående knockdown effekt af siRNA kan vænne sig ud efter 5-7 dage. Alternativt er knockout af et ECM-protein ved hjælp af CRISPR/Cas9 teknisk mere udfordrende, og individuelle kloner skal vælges og sekvenseres for at sikre knockout af det ønskede gen. Den nye reagenslinje kan dog gøre CRISPR/Cas9 til den foretrukne metode til funktionstabsforsøg i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

D.H. støttes af National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) og frøfinansiering fra Leni & Peter W. May Department of Orthopedics, Icahn School of Medicine at Mt. Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Tags

Genetik ADAMTS proteases ADAMTS-lignende proteiner C2C12 myoblaster ekstracellulære matrix skeletmuskulatur differentiering myogenese shRNA
Stabil knockdown af gener kodning Ekstracellulære Matrix Proteiner i C2C12 Myoblast Cell Line Ved hjælp af Small-Hairpin (sh)RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. … More

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter