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Developmental Biology

एक मानव आईपीएससी आधारित रक्त मस्तिष्क बाधा चिप की पीढ़ी

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60925
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5,6, 4, 1,2,3
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक बहुकोशिकीय न्यूरोवैस्कुलर यूनिट है जो मस्तिष्क होमोस्टोसिस को कसकर विनियमित करती है। मानव आईपीएससी और ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियों के संयोजन से, हमने एक व्यक्तिगत बीबीबी चिप उत्पन्न की है, जो रोग मॉडलिंग और सीएनएस दवा पेनेट्रेबिलिटी भविष्यवाणियों के लिए उपयुक्त है। बीबीबी चिप के उत्पादन और संचालन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित है।

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) न्यूरोवैस्कुलर इकाइयों (एनवीयू) द्वारा बनाई जाती है जो रक्त में पाए जाने वाले कारकों की एक श्रृंखला से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को ढालती है जो नाजुक मस्तिष्क कार्य को बाधित कर सकती है। जैसे, बीबीबी सीएनएस को चिकित्सीय चिकित्सा के वितरण में एक बड़ी बाधा है। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि बीबीबी न्यूरोलॉजिकल रोगों की शुरुआत और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, एक बीबीबी मॉडल की जबरदस्त आवश्यकता है जो सीएनएस-लक्षित दवाओं के प्रवेश की भविष्यवाणी कर सकता है और साथ ही स्वास्थ्य और रोग में बीबीबी की भूमिका को स्पष्ट कर सकता है।

हमने हाल ही में अंग-ऑन-चिप और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकियों को संयुक्त किया है ताकि मनुष्यों के लिए पूरी तरह से व्यक्तिगत बीबीबी चिप उत्पन्न की जा सके। यह उपन्यास मंच सेलुलर, आणविक और शारीरिक गुणों को प्रदर्शित करता है जो मानव बीबीबी में दवा और अणु परिवहन की भविष्यवाणी के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, रोगी-विशिष्ट बीबीबी चिप्स का उपयोग करके, हमने न्यूरोलॉजिकल रोग के मॉडल उत्पन्न किए हैं और व्यक्तिगत भविष्य कहनेवाला दवा अनुप्रयोगों की क्षमता का प्रदर्शन किया है। यहां प्रदान किया गया एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो आईपीएससी-व्युत्पन्न बीबीबी चिप्स उत्पन्न करने का प्रदर्शन करता है, जिसकी शुरुआत आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क माइक्रोवेस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (iBMECs) के भेदभाव से होती है और जिसके परिणामस्वरूप तंत्रिका जनक होते हैं, विभेदित न्यूरॉन्स, और एस्ट्रोसाइट्स। इसके अलावा वर्णित अंग चिप में कोशिकाओं को सीडिंग और नियंत्रित लैमिनार प्रवाह के तहत बीबीबी चिप्स की संस्कृति के लिए एक प्रक्रिया है । अंत में, बीबीबी चिप विश्लेषणों का विस्तृत विवरण प्रदान किया जाता है, जिसमें चिप के भीतर कोशिका प्रकारों की संरचना का निर्धारण करने के लिए दवा और अणु पारगम्यता के साथ-साथ इम्यूनोसाइटो रासायनिक तरीकों का आकलन करने के लिए पैरासेलुलर पारगम्यता परख शामिल हैं ।

Introduction

बीबीबी एक अत्यधिक चयनात्मक बाधा है जो परिसंचारी रक्त से सीएनएस को अलग करती है। यह संभावित विघटनकारी पदार्थों, कारकों और ज़ेनोबायोटिक्स से महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्यों की रक्षा करता है, जबकि मस्तिष्क होमोस्टेसिस1को बनाए रखने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों और अन्य मेटाबोलाइट्स की आमद की अनुमति देता है। बीबीबी एक बहुकोशिकीय एनवीयू है जिसमें पेरिसाइट्स, एस्ट्रोसाइट एंडफीट और न्यूरोनल प्रक्रियाएं सीधे मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएमईसी) से संपर्क करती हैं। ये बातचीत बीएमईईसी को विशेष बाधा गुण बनाने की अनुमति देती है जो तंग और अनुयायियोंजंक्शनों 2,3द्वारा समर्थित हैं । इस बाधा का गठन अणुओं के पैरासेलुलर मार्ग को सीमित करता है, लेकिन इसमें ध्रुवीकृत ट्रांसपोर्टर होते हैं जो सक्रिय रूप से अणुओं को सीएनएस में ले जाते हैं या रक्त1में वापस आते हैं। इन अद्वितीय बाधा गुणों के कारण, बीबीबी मस्तिष्क में बायोफार्मास्युटिकल्स के वितरण में एक बड़ी बाधा का गठन करता है, और यह अनुमान लगाया गया है कि एफडीए-अनुमोदित छोटे अणुओं में से 5% से भी कम सीएनएस4तक पहुंच सकते हैं।

बीबीबी तपस्या और बीबीबी विकास5में शामिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडलों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है । जबकि पशु मॉडल ईमानदारी से वीवो पर्यावरण में जटिल बहुकोशिकीय का प्रतिनिधित्व करते हैं, बीबीबी ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति और गतिविधि में अंतर के साथ-साथ प्रजातियों में विशिष्टता को प्रमाणित करता है, जो अक्सर मनुष्यों के लिए पशु डेटा के सटीक बहिष्करण को रोकते हैं6। इस प्रकार, मानव आधारित मॉडल मानव बीबीबी का अध्ययन करने और सीएनएस को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई दवाओं के विकास में उपयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह जरूरत दवा विकास के क्षेत्र में जैविक, मानव विशिष्ट दवाओं के बढ़ते प्रभुत्व के साथ और भी स्पष्ट हो जाता है । साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि एक समझौता बीबीबी ब्रेन ट्यूमर और न्यूरोलॉजिकल रोगों7,8,9सहित कई गंभीर सीएनएस विकारों से जुड़ा हुआ है । मानव मॉडल ईमानदारी से इन रोगों को दर्शाती है दोनों 1 करने की क्षमता है) उपन्यास रास्ते है कि दवा के विकास के लिए लक्षित किया जा सकता है और 2) सीएनएस तपस्या की भविष्यवाणी, इस प्रकार पूर्व नैदानिक अध्ययन में समय और संसाधनों को कम करने और संभवतः नैदानिक परीक्षणों में विफलता दर कम ।

इन विट्रो मॉडलों को व्यापक रूप से BMECs और एनवीयू की अन्य कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने और संभावित BBB-permeable दवाओं10के लिए स्क्रीन आचरण करने के लिए लागू किया गया है । मानव बीबीबी के प्रमुख पहलुओं को फिर से बनाने के लिए, इन विट्रो मॉडलों को एंडोथेलियल मोनोलेयर में शारीरिक रूप से प्रासंगिक गुणों (यानी, कम पैरासेलुलर पारगम्यता और शारीरिक रूप से प्रासंगिक ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस [टीईईआर] प्रदर्शित करना चाहिए। इसके अलावा, इन विट्रो प्रणाली के आणविक प्रोफ़ाइल में प्रतिनिधि कार्यात्मक परिवहन प्रणालियों की अभिव्यक्ति शामिल होनी चाहिए। आमतौर पर, इन विट्रो मॉडल एंडोथेलियल कोशिकाओं से बने होते हैं जो बीबीबी गुणोंकोबढ़ाने के लिए अन्य एनवीयू कोशिकाओं के संयोजन के साथ एक अर्धनिर्मित झिल्ली पर सह-संस्कारी होते हैं। यह दृष्टिकोण बाधा कार्यक्षमता और अणु स्थायित्व के सरल और अपेक्षाकृत तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस तरह के सेल आधारित बीबीबी मॉडल पशु या मानव कोशिका स्रोतों के साथ स्थापित किया जा सकता है, जिसमें सर्जिकल उत्तेजनाओं या अमर बीएमईसी लाइनों से अलग कोशिकाएं शामिल हैं।

हाल ही में, बीएमईसी में मानव pluripotent कोशिकाओं में अंतर करने के प्रोटोकॉल इन विट्रो मानव बीबीबी मॉडल12,13के लिए एक आकर्षक स्रोत के रूप में पेश किए गए थे । प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC)-व्युत्पन्न BMECs (iBMECs) अत्यधिक स्केलेबल हैं, मानव बीबीबी की महत्वपूर्ण रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, और रोगी की आनुवंशिकी ले जाते हैं। संस्कृति में, iBMECs एक मोनोलेयर बनाते हैं जो तंग जंक्शन मार्कर को व्यक्त करता है और वीवो-जैसे तंग जंक्शन परिसरों में प्रदर्शित करता है। ये सेल बीबीबी ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 1 (GLUT1) सहित बीबीबी मार्कर भी व्यक्त करते हैं । महत्वपूर्ण बात, और मानव बीएमईसी के लिए अन्य वैकल्पिक सेल स्रोतों के विपरीत, iBMECs वीवो14में मापा गया मूल्यों के साथ बाधा गुण प्राप्त करता है, बासोलेटरल धुरी के साथ ध्रुवीकरण करता है, और कार्यात्मक एफलक्स पंपों को व्यक्त करता है। इसके अलावा, विभिन्न विषयों से आईपीएससी का उपयोग दोनों 1) एक व्यक्तिगत दवा तरीके से बीबीबी के पहलुओं का परीक्षण करने के अवसर का स्वागत करता है और 2) एनवीयू के अतिरिक्त सेल प्रकार पैदा करने के लिए एक लचीला स्रोत प्रदान करता है। व्यक्तिगत बीबीबी चिप्स बनाने के लिए एक आइसोजेनिक सेल स्रोत से इन कोशिकाओं को उत्पन्न करना भी दवा प्रतिक्रियाओं में अंतर व्यक्तिगत मतभेदों को समझने में सहायता करेगा, जो नैदानिक अध्ययनों में देखे गए उपचार के प्रतिरोध या समझौता प्रतिक्रिया का एक प्रमुख कारण है।

एक डिश में मोनोलेयर के रूप में या अर्ध पारगम्य ट्रांसवेल डालने पर iBMECs का उपयोग बीबीबी मॉडलिंग के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। ये प्रणालियां मजबूत, प्रजनन योग्य और लागत प्रभावी होती हैं। इसके अलावा, TEER और परगम्यता जैसे कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं। हालांकि, दो आयामी (2डी) सिस्टम वीवो ऊतक की 3 डी प्रकृति को फिर से तैयार करने में विफल रहते हैं, और उनके पास रक्त और रक्त कोशिकाओं को प्रसारित करके प्रदान की गई शारीरिक कतरनी तनाव बलों की कमी है। यह आंतरिक बीबीबी गुणों और कार्यों को विकसित करने और बनाए रखने के लिए इन मॉडलों में संवहनी एंडोथेलियम की क्षमता को सीमित करता है।

जीवित कोशिकाओं द्वारा लाइन में खड़ा माइक्रोइंजीनियरसिस्टम अंग-ऑन-चिप्स नामक अवधारणा में विभिन्न अंग कार्यक्षमताओं को मॉडल करने के लिए लागू किया गया है। वीवो-जैसे बहुकोशिकीय वास्तुकला, ऊतक-ऊतक इंटरफेस, भौतिकरासायनिक माइक्रोवातावरण, और संवहनी परफ्यूजन में पुन: निर्माण करके, ये माइक्रोइंजीनियरप्लेटफॉर्म ऊतक और अंग कार्यक्षमता के स्तर को उत्पन्न करते हैं जो संभव नहीं है पारंपरिक 2डी संस्कृति प्रणालियां। वे वीवो ऊतक और अंग संदर्भ में जीवित कोशिकाओं के समान उच्च संकल्प, वास्तविक समय इमेजिंग और जैव रासायनिक, आनुवंशिक और मेटाबोलिक प्रोफाइल के विश्लेषण को भी सक्षम करते हैं। हालांकि, अंग पर चिप की एक विशेष चुनौती यह है कि डिजाइन, निर्माण, और इन माइक्रोइंजीनियर चिप्स के आवेदन विशेष इंजीनियरिंग विशेषज्ञता है कि आम तौर पर जैविक रूप से उंमुख अकादमिक प्रयोगशालाओं में कमी है की आवश्यकता है ।

हमने हाल ही में आईपीएससी और ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियों को एक व्यक्तिगत बीबीबी चिप मॉडल15,16उत्पन्न करने के लिए संयुक्त किया है । वर्णित तकनीकी चुनौतियों को दूर करने के लिए, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध चिप-S1 का उपयोग संस्कृति मॉड्यूल के साथ किया जाता है, जो चिप्स के रखरखाव को सरल और मजबूत तरीके से स्वचालित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक उपकरण (इंक का अनुकरण) करता है। बीबीबी चिप तंत्रिका और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच बातचीत को फिर से बनाता है और शारीरिक रूप से प्रासंगिक TEER मूल्यों को प्राप्त करता है, जिसे एकीकृत सोने के इलेक्ट्रोड17के साथ कस्टम मेड ऑर्गन चिप्स द्वारा मापा जाता है। इसके अतिरिक्त, बीबीबी चिप कम पैरासेलुलर पारगम्यता प्रदर्शित करता है, अंग स्तर पर भड़काऊ संकेतों का जवाब देता है, सक्रिय प्रभावलों पंपों को व्यक्त करता है, और घुलनशील बायोमार्कर और बायोफार्मास्युटिकल्स के भविष्य कहनेवाला परिवहन को प्रदर्शित करता है। विशेष रूप से, कई व्यक्तियों से उत्पन्न बीबीबी चिप्स स्वस्थ व्यक्तियों और न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगियों के बीच अपेक्षित कार्यात्मक मतभेदों को कैप्चर करता है15।

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में गतिशील प्रवाह की स्थितियों के तहत मानव आईपीएससी आधारित बीबीबी चिप्स की पीढ़ी के लिए एक विश्वसनीय, कुशल और प्रजनन योग्य विधि का वर्णन किया गया है। मार्गदर्शन परख ों और एंडपॉइंट विश्लेषण ों के प्रकार पर प्रदान किया जाता है जो सीधे बीबीबी चिप में या नमूना प्रवाह से किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल तकनीकों के स्पेक्ट्रम को दर्शाता है जिसे मानव-प्रासंगिक मॉडल में जैविक और कार्यात्मक गुणों और प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है।

यहां आईपीएससी स्थित बीबीबी चिप का संक्षिप्त विवरण दिया गया है। मानव आईपीएससी शुरू में अंतर और तंत्रिका जनक ों के मुक्त फ्लोटिंग समुचने के रूप में ऊतक संस्कृति फ्लास्क में प्रचारित कर रहे हैं, ईज़ी क्षेत्रों कहा जाता है । चिप-S116,18,19 के शीर्ष चैनल को अलग-अलग ईज़ी-क्षेत्रों से वरीयता प्राप्त है जो चिप के "मस्तिष्क पक्ष" बनाते हैं, क्योंकि कोशिकाएं 7 दिनों में तंत्रिका जनक कोशिकाओं (आईएनपीसी), iAstrocytes और iAstros की मिश्रित संस्कृति में अंतर करती हैं। मानव आईपीएससी भी ऊतक संस्कृति प्लेटों में iBMECs में अंतर कर रहे हैं । चिप के नीचे चैनल iBMECs के साथ वरीयता प्राप्त करने के लिए "रक्त की ओर" के रूप में वे एक एंडोथेलियल ट्यूब(चित्रा 1)बनाने के लिए विकसित है । असुरक्षित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) - लेपित झिल्ली जो ऊपर और नीचे चैनलों को अलग करती है 1) चैनलों और 2 के बीच सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के गठन की अनुमति देती है) उपयोगकर्ता को पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके या तो चैनल में पर्मायिबिलिटी परख और छवि कोशिकाओं को चलाने की अनुमति देती है।

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Protocol

1. आईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका जनक कोशिकाओं (iNPCs) की पीढ़ी

  1. नीचे वर्णित और जैसा कि पहले20,21,22प्रकाशित किया गया है , आईपीएससी उपनिवेशों से ईज़ी-क्षेत्रों का उत्पादन करें ।
    1. संस्कृति आईपीएससी कालोनियों mTESR1 या अन्य वाणिज्यिक मीडिया में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटें (०.५ मिलीग्राम/प्लेट) पर प्रवाहित करने के लिए (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. आईपीएससी माध्यम निकालें और ईज़ी-गोला माध्यम के 2 एमसीएल के साथ बदलें [ईएसएम; DMEM: F12 7:3 १०० एनजी/mL बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF), १०० एनजी/mL एपिडर्मल विकास कारक, 5 μg/mL heparin, और 2% B27 पूरक के साथ पूरक ] ।
    3. एक बाँझ 1000 μL पिपेट टिप या सेल स्क्रैपर के पीछे के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक confluent के नीचे परिमार्जन।
    4. मुक्त-फ्लोटिंग क्षेत्रों के सहज गठन की अनुमति देने के लिए सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें और अल्ट्रा-कम अटैचमेंट टी-25 फ्लास्क में रखें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. हर 2-3 दिनों में गोले खिलाएं जब मध्यम आधे माध्यम को ताजा ईएसएम के साथ बदलकर पीला हो जाता है। यह क्षेत्रों को वातानुकूलित माध्यम में रहने की अनुमति देता है, जो उनके विकास और रखरखाव के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है।
      1. एक ट्यूब रैक पर फ्लास्क दुबला और क्षेत्रों 1-2 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने के लिए फ्लास्क के कोने में नीचे की अनुमति देते हैं ।
      2. एक बार बसे, 5 मिलील या 10 मीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ सुपरनेटेंट का आधा एस्पिरेट और ताजा, पूर्व-गर्म ईएसएम के साथ बदलें।
    6. 23,20,21के रूप में पहले वर्णित 200 माइक्रोन व्यास के लिए क्षेत्रों काट कर ईज़ी-क्षेत्रों साप्ताहिक मार्ग । ईज़ी-क्षेत्रों को 25 मार्गों के लिए बनाए रखा जा सकता है और जब मार्ग 8-25 के बीच उपयोग किया जाता है तो आदर्श होते हैं।
  2. आईएनपीसी का सिंगल सेल सस्पेंशन तैयार करें:
    1. तंत्रिका भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, ईज़ी-क्षेत्र को एकल कोशिकाओं में अलग करना।
    2. एक T75 फ्लास्क से काटके के बाद 3-4 दिनों के बाद क्षेत्रों को इकट्ठा करें और 15 मिलील शंकुमें स्थानांतरित करें, फिर इसे 2 मिन के लिए या जब तक सभी क्षेत्रों को नीचे बसा न दें।
    3. धीरे-धीरे बसे क्षेत्रों को बाधित किए बिना 5 एमएल पिपेट के साथ ईएसएम को हटा दें। विघटन समाधान के 1 mL जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 min के लिए इनक्यूबेट।
    4. किसी भी बसे क्षेत्रों का इलाज सुनिश्चित करने के लिए 5 मिन के बाद वियोजन समाधान और क्षेत्रों को भंवर करें।
    5. धीरे-धीरे वियोजन समाधान निकाल ें। तंत्रिका भेदभाव माध्यम के 1 mL जोड़ें [एनडीएम; DMEM: 2% B27 माइनस विटामिन ए, 1% N2 पूरक, और मानव मस्तिष्क से व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक कारक (hBDNF, 20 एनजी/mL) के साथ F12 ] ।
    6. 200 माइक्रोन पिपेट के बाद 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एकल कोशिकाओं में क्षेत्रों को ट्रायकरेंट करें, जब तक कि सभी क्षेत्र ों को अलग नहीं किया जाता है। त्रिचरन प्रक्रिया के दौरान बुलबुला गठन से बचें।
    7. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर विसोशिएट कोशिकाओं की गणना और 1 x 106 कोशिकाओं/mL के अंतिम घनत्व के लिए कोशिकाओं को पतला । आवेदन के आधार पर घनत्व को बदलना संभव है।
      नोट: उच्च घनत्व (6 x 106 कोशिकाओं/mL तक) 3 दिनों तक की अल्पकालिक संस्कृतियों के लिए सिफारिश की जाती है, और 3 सप्ताह तक के दीर्घकालिक अनुप्रयोगों के लिए कम घनत्व की सिफारिश की जाती है ।
      नोट: कोशिकाओं को अब चिप के शीर्ष चैनल में बीज के लिए "मस्तिष्क पक्ष" फार्म के लिए तैयार हैं ।

2. आईपीएससी में भेदभाव का विषय

  1. एक 6 अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेट में एक 1:6 अनुपात में एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक ही शंख अच्छी तरह से से पारित आईपीएससी । कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए पालन करने दें आईपीएससी माध्यम को रोजाना बदलें।
  2. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके रोजाना कोशिकाओं की गणना करें।
  3. जब कोशिकाएं 1.5-3.0 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व तक पहुंचती हैं, तो बीएफजीएफ [डीएमईएम: F12 1:1, 10% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR), 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईए) के साथ, 0.5% ग्लूटामाइन सप्लीमेंट(सामग्री की तालिका)और 1000 माइक्रोएम-मेरिनेल के बिना 3 एमएल के साथ आईपीएससी माध्यम की जगह लें। 6 दिनों24के लिए रोजाना मध्यम की जगह ।
  4. 6 दिन में, एंडोथेलियल सेल (ईसी) माध्यम [मानव एंडोथेलियल सीरम मुक्त माध्यम (एचएसईएसएफ) के साथ मध्यम की जगह 1% प्लेटलेट-खराब प्लाज्मा-व्युत्पन्न गोजातीय सीरम, 20 एनजी/एमएल बीएफएफएफएफ, और 10 माइक्रोन ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (आरए)] के साथ पूरक है। 2 दिनों के लिए मध्यम छोड़ दें।
  5. ईसी माध्यम निकालें और प्रति अच्छी तरह से वियोजन समाधान के 1 mL जोड़ें । 35 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: हालांकि यह यहां इस्तेमाल किया वियोजन समाधान में एक लंबा ऊष्मायन समय माना जाता है, iBMECs सेल व्यवहार्यता के साथ इस उपचार को 90% से अधिक सह सकता है।
  6. कोशिका निलंबन को धीरे-धीरे पाइपकर और सभी कोशिकाओं को 15 मिलीस शंकुट्यूब में एकत्र करके अच्छी तरह से कोशिकाओं को अलग करें।
    नोट: कठोर पाइपिंग से बचें। यदि कोशिकाएं आसानी से अलग नहीं होती हैं, तो अतिरिक्त 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. एसीक्यूटेज को निष्क्रिय करने के लिए 15 mL शंकुमें ईसी माध्यम की 1 मात्रा जोड़ें, 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री, मध्यम हटादें, और ईसी माध्यम के 1 mL (बीएफजीएफ एफऔर आरए के बिना) से बदलें।
  8. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करकोशिकाओं की गणना करें और सेल घनत्व को 14-20 x 106 कोशिकाओं/mL में समायोजित करें।
    नोट: कोशिकाओं को अब चिप के नीचे चैनल में वरीयता प्राप्त करने के लिए "रक्त की ओर" फार्म के लिए तैयार हैं ।

3. अंग चिप का माइक्रोफैब्रिकेशन

  1. बीबीबी चिप मॉडल और इसके उत्पादन के लिए अंग चिप का प्रयोग करें जैसा कि पहले16,18,19किया गया था । लंबा चैनल ऑर्गन चिप (सामग्री की तालिकादेखें) एक अत्यधिक लचीला पॉलीडिमेथिलसिलोक्सनल (पीडीएफ) इलास्टोमर से निर्मित है जिसमें एक लचीला असुरक्षित झिल्ली से अलग दो अतिरंजित और समानांतर सूक्ष्म पैमाने के चैनल होते हैं। ऊपर और नीचे माइक्रोचैनल आकार क्रमशः 1 मिमी x 1 मिमी और 1.0 मिमी x 0.2 मिमी हैं। दोनों चैनलों को 50 माइक्रोन मोटी पीडीएमसे निर्मित लचीली असुरक्षित झिल्ली से अलग किया जाता है, जिसमें 40 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ 7 माइक्रोन व्यास के छिद्र होते हैं। चैनलों को अलग करने वाली छिद्रपूर्ण झिल्ली का सतही क्षेत्र 0.171 सेमी2है।

4. चिप तैयारी

  1. अंग चिप्स चिप वाहक के भीतर प्रीपैकेज्ड की आपूर्ति की जाती है, हैंडलिंग के दौरान चिप संरेखण को परेशान या विकृत करने की आवश्यकता को नष्ट कर दिया जाता है। इसके अलावा, चिप वाहक एक पोर्टेबल मॉड्यूल ("पॉड") से सुरक्षित रूप से जुड़ता है जो संस्कृति मॉड्यूल और चिप के बीच इंटरफेस के रूप में कार्य करता है।
    1. चिप्स की पैकेजिंग को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और बायोसेफ्टी कैबिनेट (बीएससी) में लाएं।
    2. पैकेजिंग खोलें और एक बाँझ पेट्री डिश में अंग चिप बाहर रखना। चिप के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए केवल पक्षों द्वारा चिप वाहक को संभालें।
    3. सुनिश्चित करें कि वाहक का टैब सही(चित्रा 2)का सामना कर रहा है, और जब कई चिप्स का उपयोग कर रहा है, तो उन सभी को एक ही अभिविन्यास में संरेखित करें।
    4. वाहक टैब पर प्रत्येक चिप लेबल (पूरी चिप तैयारी और कार्यप्रवाह चित्रा 3में दिखाया गया है)।

5. सतह सक्रियण और ईसीएम कोटिंग

  1. सतह सक्रियण समाधान की तैयारी
    1. 5 मिलीग्राम वाली शीशी में प्रदान किए गए रिएजेंट 1 (ईआर-1) का अनुकरण करना प्रकाश-संवेदनशील है। उपयोग से तुरंत पहले ताजा ईआर-1 समाधान तैयार करें। ईआर-1 अखंडता चिप्स की सफल तैयारी में महत्वपूर्ण है।
    2. ईआर-1 को संभालते समय बीएससी में लाइट बंद कर दें।
      नोट: ईआर-1 एक आंख अड़चन है और उचित दस्ताने और आंखों की सुरक्षा के साथ बीएससी में संभाला जाना चाहिए ।
    3. ईआर-1 और ईआर-2 अभिकर्ताओं को उपयोग से पहले कमरे के तापमान (आरटी) तक संतुलन बनाने की अनुमति दें।
    4. पन्नी के साथ एक खाली बाँझ 15 मिलील शंकुट्यूब लपेटकर प्रकाश से समाधान की रक्षा करें।
    5. बीएससी में पाउडर को नीचे बसने के लिए संक्षेप में ईआर-1 शीशी पर टैप करें।
    6. शीशी में ईआर-2 बफर का 1 मिलील जोड़ें, और तुरंत अपनी सामग्री को 15 मिलील लिपटे शंकुट्यूब के नीचे स्थानांतरित करें। मिश्रण करने के लिए पिपेट न करें। शंकुट्यूब में स्थानांतरित समाधान का रंग लाल होगा।
    7. दोहराएं चरण 5.1.6 3x। अंतिम दौर पर, ढक्कन से किसी भी शेष पाउडर को इकट्ठा करने के लिए ईआर-1 शीशी और उलटा कैप करें, फिर समाधान को शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें; यह ईआर-1 समाधान के 4 mL के लिए कुल मात्रा लाएगा।
    8. 0.5 मिलीग्राम/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए 15 मिलीग्राम शंकुई ट्यूब में ईआर-1 समाधान के 4 mL के लिए ईआर-2 समाधान के 6 mL जोड़ें। ईआर-1 को ईआर-2 समाधान के भीतर पूरी तरह से भंग किया जाना चाहिए।
  2. सतह सक्रियण
    1. एक P200 पिपेट और एक बाँझ 200 μL फ़िल्टर पाइपेट टिप का उपयोग, ईआर-1 मिश्रण के 200 μL ले लो।
    2. नीचे के इनलेट में पिपेट रखें और नीचे चैनल के माध्यम से ईआर-1 मिश्रण के 20 μL धक्का जब तक मिश्रण नीचे चैनल आउटलेट से बाहर प्रवाह शुरू होता है ।
    3. ईआर-1 मिश्रण के लगभग 50 माइक्रोन जोड़ें और इसे शीर्ष चैनल इनलेट में रखें। शीर्ष चैनल के माध्यम से मिश्रण पुश जब तक यह शीर्ष चैनल आउटलेट से बाहर प्रवाह शुरू होता है ।
    4. कोमल आकांक्षा द्वारा चिप की सतह से सभी अतिरिक्त ईआर-1 मिश्रण को हटा दें। कुछ बनाएं ईआर-1 मिश्रण केवल चिप सतह से हटा दिया जाता है न कि चैनलों से।
    5. सत्यापित करें कि चैनल पराबैंगनी (यूवी) सक्रियण से पहले हवा के बुलबुले से मुक्त हैं। यदि हवा के बुलबुले का पता लगाया जाता है, तो ईआर-1 मिश्रण के साथ चैनल धोकर बुलबुले हटा दें।
    6. चिप्स युक्त खुली डिश को यूवी लाइट बॉक्स (अनुकरण इंक द्वारा प्रदान किया गया) में रखें।
    7. यूवी लाइट बॉक्स के पीछे स्विच को "सुसंगत" सेटिंग में सेट करें। पावर चालू करें और यूवी सक्रियण शुरू करें। 20 मिन के लिए यूवी लाइट के नीचे चिप्स छोड़ दें।
      नोट: यूवी प्रकाश के लिए कर्मियों के जोखिम से बचें।
    8. दोनों चैनलों से ईआर-1 मिश्रण निकालें।
    9. प्रत्येक चैनल को ईआर-2 समाधान के 200 माइक्रोन के साथ धोएं।
    10. दोनों चैनलों से ईआर-2 निकालें।
    11. प्रत्येक चैनल को बाँझ ठंडे Dulbecco के फॉस्फेट-बफर लवण (DPBS) के 200 माइक्रोन के साथ धोलें।
    12. अगले चरण पर आगे बढ़ने तक चैनलों के अंदर ठंडा DPBS छोड़ दें।
  3. एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) तैयारी और कोटिंग
    1. अंतिम कार्य सांद्रता के लिए ठंडे डीपीबीएस, पानी या अन्य विलायक के साथ व्यक्तिगत ईसीएम घटकों को मिलाकर ईसीएम समाधान तैयार करें। ईसीएम समाधान हर बार उपयोग होने पर ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
    2. ईसीएम के साथ चिप के ऊपर और नीचे दोनों चैनलों को कोट करें, संरचना के साथ, जैसा कि सेल प्रकार द्वारा निर्धारित किया जाता है। ईसीएम मिश्रण का उपयोग होने तक बर्फ पर बनाए रखा जाना चाहिए।
    3. "मस्तिष्क पक्ष" कोट करने के लिए टुकड़े टुकड़े (50 μg/mL) का उपयोग करें, और कोलेजन चतुर्थ और फाइब्रोनेक्टिन को 4:1 अनुपात (320:80 μg/mL) पर मिश्रित करने के लिए "रक्त की ओर" कोट के रूप में धारा 5.6 में वर्णित है।
  4. ईसीएम एलिकोस की तैयारी
    1. कोल्ड डीपीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल लैमिनिन को 50 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें। अलीकोट और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 0.1% एसिटिक एसिड में कोलेजन चतुर्थ को 1 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता में भंग करें। समाधान को रात भर 2-8 डिग्री सेल्सियस या आरटी पर 1-3 घंटे के लिए या पूरी तरह से भंग होने तक इनक्यूबेट करते हैं।
    3. कोलेजन चतुर्थ का 1 मिलील मिश्रण तैयार करें: फाइब्रोनेक्टिन (कोलेजन चतुर्थ का 320 माइक्रोन, फाइब्रोनेक्टिन का 80 माइक्रोन, बाँझ डबल-आसुत एच2ओ का 600 माइक्रोन)। मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  5. ईसीएम के साथ चिप्स कोटिंग
    1. पूरी तरह से दोनों चैनलों से ठंड े डीपीबीएस aspirate। कोलेजन चतुर्थ: फाइब्रोनेक्टिन समाधान के 100 माइक्रोन लेने के लिए एक P200 पिपेट सेट करें।
    2. आउटलेट पर एक छोटी बूंद रूपों तक नीचे चैनल इनलेट के माध्यम से समाधान पेश करें। पिपेट टिप को हटाने के बाद इनलेट पर एक छोटी सी बूंद छोड़ दें।
    3. आउटलेट पर एक छोटी बूंद रूपों तक शीर्ष चैनल इनलेट के माध्यम से लैमिनिन समाधान पेश करें। पिपेट टिप को हटाने के बाद इनलेट पर एक छोटी सी बूंद छोड़ दें।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए चैनलों को बारीकी से देखें कि कोई बुलबुला मौजूद न हो। यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो चैनल को उचित ईसीएम समाधान के साथ तब तक धोएं जब तक कि सभी बुलबुले हटा न न दें।
    5. प्रत्येक चिप के लिए चरण 5.5.1-5.5.4 दोहराएं।
    6. 15 मीटर शंकुई ट्यूब की टोपी में डीपीबीएस का 1.5 एमएल जोड़ें। अतिरिक्त आर्द्रता प्रदान करने और पैराफिल्म के साथ पकवान को सील करने के लिए चिप्स के साथ 150 मिमी संस्कृति पकवान में डीपीबीएस कैप रखें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, चिप्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि वांछित है, कोशिकाओं चिप सक्रियण और ईसीएम कोटिंग के रूप में एक ही दिन वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि रात भर ऊष्मायन पसंद है । चिप्स 37 डिग्री सेल्सियस पर ईसीएम और इनक्यूबेटिंग चिप्स जोड़ने के बाद 4 घंटे सीडिंग के लिए तैयार हो सकता है।

6. "मस्तिष्क की ओर" चैनल सीडिंग और मिश्रित तंत्रिका संस्कृतियों में ईज़ी क्षेत्रों में अंतर

  1. तैयार चिप्स वाली डिश को बीएससी में लाएं। धीरे से एनडीएम के 200 μL के साथ दोनों चैनलों को धोलें।
  2. बंदरगाहों के साथ संपर्क से बचना, चिप की सतह से अतिरिक्त मीडिया बूंदों को ध्यान से एस्पिरेट करें। एक सजातीय सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चिप बोने से पहले धीरे से सेल निलंबन आंदोलन
  3. "मस्तिष्क पक्ष" उत्पन्न करने के लिए शीर्ष चैनल में iNPCs सीडिंग
    1. चिप के शीर्ष चैनल में कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं/mL) बीज । शीर्ष चैनल इनलेट में 30-100 माइक्रोन सेल निलंबन युक्त P200 टिप जोड़ें और धीरे-धीरे पिपेट से टिप जारी करें। एक खाली P200 पिपेट लें, प्लंजर को दबाएं, शीर्ष चैनल आउटलेट में डालें और चिप के माध्यम से एकल कोशिकाओं के निलंबन को ध्यान से खींचें।
    2. शीर्ष चैनल के भीतर कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व और समरूप वितरण की जांच करने के लिए डिश को कवर करें और माइक्रोस्कोप पर स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे चिप इनलेट और आउटलेट पोर्ट से पिपेट टिप निकालें।
    3. सीडिंग घनत्व 20% कवरेज के रूप में दिखाई देना चाहिए। यदि सीडिंग घनत्व अपेक्षा से अधिक या कम है या असमान है, तो चिप्स को बीएससी में वापस करें, चैनल 2x को ताजा माध्यम के 200 माइक्रोन के साथ धोएं, और 6.3.1 चरण दोहराएं।
    4. सही सेल घनत्व की पुष्टि करने के बाद, चिप्स के प्रत्येक बैच को सीडिंग के बाद तुरंत चिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखें। उन कोशिकाओं को धो लें जो ताजा एनडीएम के साथ संलग्न नहीं हैं।
    5. प्रवाह शुरू करने से पहले कम से कम 48 घंटे के लिए दैनिक एनडीएम प्रतिस्थापन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर परिस्थितियों में कोशिकाओं को रखें। आईएनपीसी के बाद या बाद के दिन आईएनपीसी सीडिंग के बाद आईबीसीईसी को वरीयता दी जा सकती है।

7. "रक्त पक्ष" उत्पन्न करने के लिए नीचे चैनल में iBMECs सीडिंग

  1. तैयार चिप्स वाली डिश को बीएससी में लाएं। धीरे-धीरे नीचे चैनल को ईसी माध्यम के 200 माइक्रोन के साथ धोएं।
  2. बंदरगाहों के साथ संपर्क से बचना, चिप की सतह से अतिरिक्त ईसी माध्यम की सावधानीपूर्वक एस्पिरेट बूंदों को दूर करना, जिससे दोनों चैनलों में माध्यम छोड़ना सुनिश्चित हो ता है। एक सजातीय सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चिप को बोने से पहले धीरे-धीरे सेल निलंबन को उत्तेजित करें।
  3. पी200 पिपेट का उपयोग करके, आईबीएमईसी सेल निलंबन (14-20 x 106 कोशिकाओं/mL) के 30-100 माइक्रोन को आकर्षित करें और टिप को नीचे चैनल इनलेट में रखें। धीरे-धीरे टिप को पिपेट से डिस्कनेक्ट करें, जिससे इनलेट पोर्ट में सेल युक्त टिप छोड़ दें।
  4. एक खाली टिप के साथ एक P200 पिपेट पर प्लंजर दबाना, नीचे चैनल आउटलेट में डालें, और ध्यान से धीरे-धीरे पिपेट प्लंजर जारी करके नीचे चैनल के माध्यम से एकल सेल निलंबन खींचो।
  5. चिप की सतह से Aspirate अतिरिक्त सेल निलंबन। यह सुनिश्चित करने के लिए कि चैनलों से कोई सेल निलंबन नहीं है, इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के साथ सीधे संपर्क से बचें।
  6. चिप को कवर करें और सीडिंग घनत्व का निरीक्षण करने के लिए इसे माइक्रोस्कोप पर स्थानांतरित करें। नीचे चैनल कोशिकाओं के बीच कोई नमूदार अंतराल के साथ भरा जाना चाहिए जब एक माइक्रोस्कोप के तहत 4x या 10x पर मनाया(चित्र4)।
  7. यदि सीडिंग घनत्व 90% कवरेज से नीचे है या असमान रूप से वितरित किया जाता है, तो तदनुसार सेल घनत्व को समायोजित करें और चैनल के भीतर सही घनत्व प्राप्त न होने तक चरण 7.2-7.6 दोहराएं। शेष चिप्स में सही सेल घनत्व(चित्रा 4),बीज कोशिकाओं की पुष्टि करने के बाद। छिद्रित झिल्ली पर कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए, जो नीचे चैनल के शीर्ष पर स्थित है, प्रत्येक चिप को उलटा और एक चिप पालने में आराम करें।
  8. कोशिकाओं के लिए आर्द्रता प्रदान करने के लिए 150 मिमी पकवान के अंदर एक छोटा जलाशय (15 मिलीस शंकुट्यूब कैप युक्त बाँझ डीपीबीएस युक्त) रखें। लगभग 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर चिप्स इनक्यूबेट, या नीचे चैनल में कोशिकाओं को संलग्न किया है जब तक। एक बार iBMECs संलग्न है (~ 3 एच के बाद सीडिंग), चिप्स एक ईमानदार स्थिति को वापस फ्लिप करने के लिए नीचे चैनल के नीचे भाग के लिए सेल लगाव की अनुमति है ।

8. प्रवाह की शुरुआत

  1. फ्लो आमतौर पर iBMECs के 48 घंटे के बाद सीडिंग शुरू की जाती है। इस बार iBMECs के लिए चिप को मजबूती से संलग्न करने के लिए आवश्यक है ।
  2. चिप के माध्यम से लैमिनार प्रवाह को बनाए रखने के लिए, मध्यम के तापमान को डिगास और समतुल्य करना महत्वपूर्ण है। मध्यम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पूर्व गर्म किया जाना चाहिए।
  3. गर्म माध्यम के 50 मीटर तक 15 मिन के लिए वैक्यूम-चालित निस्पंदन प्रणाली के तहत ऊष्मायन द्वारा डिगास किया जा सकता है।
  4. पोर्टेबल मॉड्यूल का भड़काना
    1. 70% इथेनॉल के साथ पोर्टेबल मॉड्यूल पैकेजिंग और ट्रे के बाहरी को साफ करें, पोंछें, और बीएससी में स्थानांतरित करें। पैकेज खोलें और मॉड्यूल को ट्रे में रखें। उन्हें ट्रे के पीछे की ओर जलाशयों के साथ उन्मुख करें।
    2. प्रत्येक इनलेट जलाशय के लिए पूर्व-समतुल्य, गर्म मीडिया का पिपेट 3 mL। शीर्ष चैनल(चित्रा 5)के शीर्ष चैनल इनलेट जलाशय में नीचे चैनल और एनडीएम के इनलेट जलाशय में ईसी संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    3. पिपेट 300 माइक्रोन ऑफ प्री-समतुल्य, प्रत्येक आउटलेट जलाशय के लिए गर्म मीडिया, सीधे प्रत्येक आउटलेट बंदरगाह(चित्रा 5)पर।
    4. प्रत्येक ट्रे पर छह पोर्टेबल मॉड्यूल तक रखें। इनक्यूबेटर के लिए ट्रे लाओ और ट्रे बाहर का सामना करना पड़ संभाल के साथ संस्कृति मॉड्यूल में पूरी तरह से स्लाइड ।
    5. संस्कृति मॉड्यूल पर "प्राइम" चक्र का चयन करें और चलाएं। इनक्यूबेटर दरवाजा बंद करें और संस्कृति मॉड्यूल को पोर्टेबल मॉड्यूल को प्राइम करने की अनुमति दें (~ 1 मिन लेता है)। भड़काना चक्र पूरा हो गया है जब स्थिति बार पढ़ता है "तैयार" । डिट को कल्चर मॉड्यूल से निकालकर बीएससी में लाएं।
    6. सत्यापित करें कि बीएससी में प्रत्येक पोर्टेबल मॉड्यूल के नीचे का निरीक्षण करके पोर्टेबल मॉड्यूल को सफलतापूर्वक प्रिमेड किया गया था। सभी चार बंदरगाहों पर छोटी बूंदों की उपस्थिति के लिए देखो।
      1. यदि कोई पोर्टेबल मॉड्यूल बूंदों को नहीं दिखाता है, तो उन मॉड्यूल पर प्राइम साइकिल को फिर से चलाना। यदि कोई मीडिया ट्रे पर टपका (यह आउटलेट बंदरगाहों द्वारा अधिक बार हो सकता है), तो 70% इथेनॉल के साथ साफ ट्रे।
  5. पोर्टेबल मॉड्यूल, विनियमन, और प्रवाह की शुरुआत के लिए चिप्स का कनेक्शन
    1. चैनल में किसी भी संभावित बुलबुले को हटाने और प्रत्येक इनलेट और आउटलेट बंदरगाह के शीर्ष पर मीडिया की छोटी बूंदों (चैनल में मीडिया के अनुसार) को हटाने के लिए प्रत्येक चिप के दोनों चैनलों को गर्म, समतुल्य सेल-विशिष्ट संस्कृति माध्यम के साथ धीरे से धोएं।
    2. पोर्टेबल मॉड्यूल में वाहक के साथ चिप्स डालें और प्रत्येक ट्रे पर छह तक रखें। संस्कृति मॉड्यूल में ट्रे डालें। संस्कृति मॉड्यूल पर उपयुक्त अंग चिप संस्कृति की स्थिति (प्रवाह दर और खिंचाव) कार्यक्रम करें।
    3. "विनियमित" चक्र पूरा होते ही प्रोग्राम की गई स्थितियां शुरू हो जाएंगी।
      नोट: प्रत्येक चैनल के लिए प्रवाह दरों को स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जा सकता है और 0-1,000 μL/h से लेकर दरों के लिए सेट किया जा सकता है । BBB चिप आम तौर पर 30 μL/h पर सुसंस्कृत है । जब 30 μL/h और १००० μL/h पर चुनाव आयोग मीडिया या ESM के रूप में मीडिया बह, कतरनी बलों ०.०१ dyn/सेमी2 और ०.३३ dyn/cm2,क्रमशः कर रहे हैं ।
    4. "विनियमित" चक्र चलाएं, जिसमें लगभग 2 घंटे लगते हैं, जिसके बाद संस्कृति मॉड्यूल पूर्व निर्धारित अंग चिप संस्कृति की स्थिति में प्रवाह शुरू हो जाएगा।

9. रक्त से मस्तिष्क पैरासेलुलर पारगम्यता आकलन

  1. 10 μg/mL dextran-FITC (4 केडीए) के साथ पूरक एनडीएम तैयार करें । इस समाधान का उपयोग "रक्त पक्ष" चैनल के इनपुट के रूप में किया जाएगा।
  2. डीएक्सटीएन-फिटसी के साथ पूरक एनडीएम के साथ पोर्टेबल मॉड्यूल के निचले चैनल जलाशयों को भरें। शीर्ष चैनल जलाशयों को बिना ट्रेसर के एनडीएम से भरें।
  3. दोनों Perfuse, 30 μL/h की प्रवाह दर पर ऊपर और नीचे चैनलों के लिए कम से 4 घंटे के लिए जब तक पर्याप्त मीडिया के लिए एक थाली पाठक में फ्लोरेसेंस के आकलन के लिए एकत्र किया जा जमा (आम तौर पर १०० μL) ।
  4. ऊपर और नीचे चैनलों के इनपुट और आउटपुट जलाशयों से मीडिया के नमूने एकत्र करें। नमूनों को प्रकाश से बचाएं।
  5. 10-12 पॉइंट कैलिब्रेशन कर्व जेनरेट करने के लिए बिना ट्रेसर के एनडीएम का उपयोग करके 10 μg/mL dextran-FITC 1:1 के साथ पूरक एनडीएम को क्रमिक रूप से पतला करें।
  6. अंशांकन वक्र सहित प्रत्येक नमूने के 100 माइक्रोन लें, एक काले 96 अच्छी प्लेट में और प्लेट रीडर (485 एनएम उत्तेजना, 530 एनएम उत्सर्जन) का उपयोग करके फ्लोरेसेंस पढ़ें।
  7. इस प्रकार पीऐप मूल्यों की गणना करने के लिए मापा मानों का उपयोग करें:

Equation 1

  1. बाधा गुणों का आकलन करने के लिए दैनिक माप लें और पुष्टि करें कि बीबीबी चिप अभी भी कार्यात्मक है।

10. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. एक रासायनिक धुएं हुड के लिए चिप्स लाओ। पी 200 पिपेट का उपयोग करना, डीपीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 माइक्रोन के साथ दोनों चैनलों को परफ्यूज करके कोशिकाओं को ठीक करें और आरटी में 10 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. निर्धारण के बाद, प्रत्येक चैनल को डीपीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ परफ्यूज करें और 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। 2x धोने वाले डीपीबीएस को दोहराएं।
  3. प्राथमिक अवरुद्ध समाधान (पीबीएस, 5% सामान्य गधे सीरम और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पूरक) द्वारा चिप पर कोशिकाओं को ब्लॉक और परमीबिलाइज करें। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
  4. प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करना और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट। BMECs मार्कर भरमार-1 (1:100 कमजोर पड़ने), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250) हैं; सीडी31), और वीई-कैथेरिन (1:200)। तंत्रिका मार्कर हैं III-ट्यूबलिन (1:1000; Tuj1α), S100ο (1:500), नेटिन (1:1000) और GFAP (1:1000) ।
  5. चिप्स 3x को कोल्ड डीपीबीएस से धोलें।
  6. माध्यमिक अवरुद्ध समाधान में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (ट्राइटन-एक्स के बिना 5% सामान्य गधे सीरम के साथ डीपीबीएस)।
  7. दोनों चैनलों के माध्यम से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को पर्प्रोव करें। आमतौर पर, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी 1:1000 पतला होते हैं। आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट प्रकाश से संरक्षित।
  8. चिप्स 3x को डीपीबीएस से धोलें।
  9. DAPI समाधान के 100 μL के साथ चिप perfusing द्वारा दाग सेल नाभिक। 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  10. चिप्स 3x को डीपीबीएस से धोलें।
  11. चिप या तो एक ईमानदार या एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इमेजिंग के लिए तैयार है । पीडीएम ट्रांसपेरेंसी अक्षुण्ण अंग चिप में इमेजिंग की अनुमति देता है। 10x से ऊपर आवर्धन अंग चिप की मोटाई के कारण लंबी काम करने की दूरी के उद्देश्यों की आवश्यकता हो सकती है ।

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Representative Results

चित्रा 6ए, बी, सी "मस्तिष्क की ओर" शीर्ष चैनल और iBMECs पर "रक्त की ओर" नीचे चैनल पर ईज़ी क्षेत्रों के साथ वरीयता प्राप्त एक बीबीबी चिप का प्रतिनिधित्व करता है । iBMECs पहले वरीयता प्राप्त की और रातोंरात संलग्न करने की अनुमति दी गई, जिसके बाद ईज़ी क्षेत्रों वरीयता प्राप्त थे । चिप्स तो सात दिनों के लिए दैनिक मीडिया प्रतिस्थापन के साथ स्थिर परिस्थितियों में सुसंस्कृत थे । बीबीबी चिप तो 10 मिन के लिए आरटी में 4% पीएफए का उपयोग कर तय किया गया था और DPBS के साथ 3x धोया । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री को बीबीबी चिप पर 1) नेटिन का उपयोग करके न्यूरल प्रोजेनिटर कोशिकाओं के लिए मार्कर के रूप में किया गया था, 2) एस्ट्रोसाइट्स के लिए मार्कर के रूप में S100ο या GFAP, और 3) न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर के रूप में III-ट्यूबलिन। GLUT-1 और Pecam-1 BMECs के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । इमेजिंग 20x पर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था और इमेजजे सॉफ्टवेयर के लिए फिजी का उपयोग करके छवियों को संसाधित किया गया था।

चित्रा 6डी एक पैरासेलुलर पारगम्यता परख का प्रतिनिधित्व करता है जो iBMECs और ईज़ी-क्षेत्रों, अकेले iBMECs (ईज़ी-क्षेत्रों के बिना), या अकेले ईज़ी-क्षेत्रों (iBMECs के बिना) के साथ आबादी वाले अंग चिप्स पर किया गया था। एक "विनियमित" चक्र के बाद, एक 4 केडीए Dextran-FITC ट्रेसर "रक्त पक्ष" के जलाशय में 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया था, और चिप्स 30 μL/h रातोंरात पर व्याप्त थे । इसके बाद, मीडिया को ऊपर और नीचे दोनों चैनलों के इनलेट और आउटलेट जलाशयों से एकत्र किया गया था। प्रत्येक नमूने के 100 माइक्रोन एकत्र और एक प्लेट रीडर का उपयोग कर फ्लोरेसेंस के लिए जांच की गई थी।

महत्वपूर्ण बात यह है कि फ्लोरेन फिच के एकाग्रता मूल्यों में फ्लोरेसेंस मूल्यों को बदलने के लिए 1:1 अंशांकन वक्र का उपयोग किया गया था। मूल्यों तो स्थायित्व (पीएप्लिकेशन)की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इन परिणामों से पता चलता है कि iBMECs कार्यात्मक बाधा गुण बनाते हैं, जिन्हें तब और कड़ा किया जाता है जब iBMECs को ईज़ी-क्षेत्रों के साथ सह-संस्कारित किया जाता है। केवल ईज़ी-क्षेत्रों के साथ सुसंस्कृत चिप्स, एक बाधा बनाने में विफल। एक समान दृष्टिकोण बीबीबी चिप में किसी भी अणु के परिवहन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक उपलब्ध माप विधि (जैसे, फ्लोरेसेंस, एलिसा, या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री) के आधार पर।

Figure 1
चित्रा 1: आईपीएससी स्थित बीबीबी चिप की योजनाबद्ध । चिप पर सीडिंग से पहले, आईपीएससी संस्कृति प्लेटों में (i) ईज़ी-क्षेत्रों (तंत्रिका जनक कोशिकाओं, iNPCs) में अंतर कर रहे हैं, जो क्षेत्रों के रूप में निलंबन में उगाए जाते हैं, और (ii) मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (iBMECs) में। ईज़ी-क्षेत्रों को एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है, जो अंग चिप के शीर्ष चैनल पर वरीयता प्राप्त होते हैं, जहां वे "मस्तिष्क पक्ष" बनाने के लिए मिश्रित तंत्रिका संस्कृतियों में आगे अंतर करते हैं। iBMECs अंग चिप के नीचे चैनल में वरीयता प्राप्त करने के लिए "रक्त की ओर" पर एक रक्त वाहिका की तरह संरचना फार्म कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: चिप वाहक में चिप के शीर्ष दृश्य की योजनाबद्ध, लेबल बंदरगाहों के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आईपीएससी स्थित बीबीबी चिप तैयार करने और कार्यप्रवाह का फ्लोचार्ट। कार्यप्रवाह शुरू करने से पहले आईपीएससी से तंत्रिका और एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों का पूर्व-भेदभाव आवश्यक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: नीचे चैनल में iBMECs की सीडिंग । कोशिकाओं के संलग्न होने के तुरंत बाद नीचे चैनल(ए)में वरीयता प्राप्त iBMECs की ब्राइटफील्ड छवियां या(बी)24 घंटे के बाद सीडिंग, संलग्न होने के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लेबल इनलेट और आउटलेट मीडिया जलाशयों के साथ जुड़े चिप और पोर्टेबल मॉड्यूल की योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि परिणाम। आईपीएससी स्थित बीबीबी चिप पर इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री 7 दिन बाद सीडिंग । ईज़ी-क्षेत्रशीर्ष "मस्तिष्क की ओर" चैनल में मिश्रित तंत्रिका कोशिका आबादी में विभेदित होते हैं, जिनमें(ए)S100ο+ (ग्रीन) एस्ट्रोसाइट्स, नेटिन + (लाल) तंत्रिका जनक कोशिकाओं के साथ-साथ(बी)जीएफएपी + (लाल) एस्ट्रोसाइट्स और एIII-ट्यूबलिन + (लाल) न्यूरॉन्स शामिल हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन (सी)iBMECs नीचे "रक्त की ओर" चैनल में वरीयता प्राप्त GLUT-1 और (हरे) PECAM-1 (सीडी 31, लाल) व्यक्त किया। स्केल बार = 200 माइक्रोन (डी)बीबीबी चिप परगना का मूल्यांकन नीचे चैनल के जलाशय में dextran-FITC (4 kDa) जोड़कर किया गया था। परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि iBMECs और ईज़ी-क्षेत्रों के साथ वरीयता प्राप्त अंग चिप्स अकेले iBMECs (* पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०५) के साथ वरीयता प्राप्त अंग चिप्स की तुलना में एक तंग बाधा प्रदर्शित करते हैं । अकेले ईज़ी-क्षेत्रों के साथ वरीयता प्राप्त अंग चिप्स किसी भी बाधा गुण (*** पी एंड एलटी; 0.001; तुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA) प्रदर्शित नहीं करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एनवीयू में ऑर्गन-ऑन-चिप तकनीक और आईपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का संयोजन मानव बीबीबी की सटीक मॉडलिंग के लिए वादा करता है। यहां, हम हाल ही में प्रकाशित iPSC आधारित BBB चिप16के सरल और मजबूत आवेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । सीडिंगप्रतिमान का अवलोकन और समय चित्र 3 में दिखाया गया है । बीबीबी मॉडलिंग के लिए उपयुक्त बाधा कार्यों को प्राप्त करने और बनाए रखने के लिए, एक समरूप iBMEC मोनोलेयर पैदा करना और इसकी अखंडता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। एक कार्यात्मक मोनोलेयर की पीढ़ी की दिशा में पहला कदम गैर ध्रुवीय पीडीएफएस सतह का रासायनिक सक्रियण शामिल है जो ईसीएम प्रोटीन के लगाव की अनुमति देता है। सतह सक्रियण अभिकर्मक पुनर्गठन पर तेजी से नीचा दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंततः कोशिकाओं का उप-इष्टतम लगाव हो सकता है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि अभिकर्मकों को ताजा रखा जाए और पूरे प्रक्रिया में प्रकाश से सुरक्षित रखा जाए ।

यूवी सक्रियण (धारा 5.2) के दौरान, लगातार ईसीएम कोटिंग और समरूप सेल अटैचमेंट प्राप्त करने के लिए प्रत्येक चैनल के भीतर अभिकर्मकों को समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जाने वाली ईसीएम रचनाएं और सांद्रता को विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं(यानी, आईबीमेक्स और ईज़ी-गोला-व्युत्पन्न तंत्रिका जनक कोशिकाओं) के लिए अनुकूलित किया गया था। सेल संरचना बदलना संभव है लेकिन अंतर ईसीएम स्थितियों की आवश्यकता हो सकती है, जिसके लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। ईसीएम कोटिंग के बाद, iBMECs को ठीक से बीज के लिए महत्वपूर्ण है। एक पूर्ण मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए उच्च सेल सीडिंग घनत्व (>14 x 106 कोशिकाएं/mL) आवश्यक है। यदि पूर्ण कोशिका प्रवाह प्राप्त करने में विफल रहता है, तो सीडिंग के दौरान 20 x 106 कोशिकाओं/mL तक सेल निलंबन के घनत्व को और बढ़ाने की सलाह दी जाती है ।

लैमिनार प्रवाह को पहले आईबीएमईसी परिपक्वता15 को बढ़ाने का सुझाव दिया गया था और माइक्रोफ्लूइडिक प्लेटफॉर्म द्वारा प्रदान किए गए फायदों को पूरा करने के लिए अपरिहार्य है। हालांकि, चिप के चैनलों के माध्यम से बहने वाले माइक्रोबबल शारीरिक रूप से तनाव और अलग निवासी कोशिकाओं को कर सकते हैं, जो बीबीबी चिप अखंडता के विनाश का कारण बन सकते हैं। लैमिनार प्रवाह के दौरान माइक्रोबबल गठन से बचने के लिए, परफ्यूजन शुरू होने से पहले माध्यम को समतुल्य करना महत्वपूर्ण है। समतुल्यता के लिए उपयोग करने से पहले मध्यम के पूर्व वार्मिंग और degassing की आवश्यकता होती है ।

व्यक्तिगत चिप्स की पीढ़ी मानव iPSC-व्युत्पन्न iBMECs और iNPCs दोनों का उपयोग कर के लिए संभव बनाया है । जबकि iBMECs का भेदभाव छोटा और बल्कि सरल24,22है, तंत्रिका कोशिकाओं में आईपीएससी का भेदभाव21,25 अधिकचुनौतीपूर्ण है । हालांकि, चिप के "मस्तिष्क पक्ष" में रहने वाली तंत्रिका कोशिकाओं को किसी भी तंत्रिका कोशिका प्रकार द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जैसे प्राथमिक तंत्रिका कोशिकाएं या आईपीएससी-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स16। इसी तरह "सदाशयी" एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए, iBMECs विभिन्न तंत्रिका सह संस्कृतियों के जवाब में जीन अभिव्यक्ति में प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करते हैं । इस प्रकार, इस लचीलेपन के परिणामस्वरूप चिप पर विभिन्न एनवीयू का भविष्य में विकास हो सकता है। सेल सीडिंग टाइमिंग और ऑर्डर को एडजस्ट करके सिस्टम का अतिरिक्त लचीलापन हासिल किया जा सकता है। iBMECs को तंत्रिका कोशिकाओं से पहले या बाद में वरीयता दी जा सकती है, जिससे तंत्रिका कोशिकाओं के सीडिंग और लगाव के तुरंत बाद iBMECs को बीज करना संभव हो जाता है, या ईज़ी-क्षेत्रों के बाद चिप वातावरण में अधिक परिपक्व तंत्रिका संस्कृतियों में अंतर हो जाता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं की अपरिपक्व प्रकृति को देखते हुए यह विशेष महत्व रखता है । यह देखते हुए कि ईज़ी-क्षेत्र प्रारंभिक तंत्रिका जनक हैं, लंबे समय तक भेदभाव अवधि के परिणामस्वरूप एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स का प्रतिशत भी बढ़ सकता है।

प्रोटोकॉल से गायब एक घटक पेरिवेस्कुलर पेरिसाइट्स है, जो शारीरिक एनवीयू में एक महत्वपूर्ण घटक प्रदान करता है। 26,27 की तरह परिसियट कीतरह कोशिकाओं में आईपीएससी भेदभाव में हाल ही में प्रगति इस अतिरिक्त सेल प्रकार की शुरूआत की अनुमति होगी, जिससे BBB की एक बेहतर प्रतिकृति प्रदान करते हुए अपनी व्यक्तिगत प्रकृति के संरक्षण ।

आईबीएमईसी को पहले विभिन्न गुणों को प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है जो बीबीबी मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं जिनमें सेलुलर मार्कर की अभिव्यक्ति, टीईआर की स्थापना और एफलक्स पंपों की कार्यात्मक गतिविधि28,24,5शामिल हैं। हालांकि, आणविक विश्लेषणों से पता चला है कि ये कोशिकाएं कई एपिथेलियल मार्कर15को भी व्यक्त करती हैं। आईबीएमईसी पीढ़ी में उन्नति और एंडोथेलियल मार्कर अभिव्यक्ति को दिखाते हुए हाल ही में29,30का वर्णन किया गया है । यहां प्रस्तुत प्रतिमान के बाद, इन संभावित बेहतर कोशिकाओं को आसानी से भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए BBB चिप मॉडल में शामिल किया जा सकता है । यहां वर्णित लचीला अभी तक मजबूत मंच रोग मॉडलिंग और नई सीएनएस दवाओं के विकास और मूल्यांकन दोनों की सुविधा प्रदान कर सकता है ।

हालांकि यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद पर निर्भर करता है, अतिरिक्त वाणिज्यिक कंपनियां विविध माइक्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म प्रदान करती हैं, जो वैकल्पिक लाभ31की पेशकश कर सकती हैं। इसके अलावा, माइक्रोफ्लूइडिक ऑर्गन चिप्स के "इन हाउस" विनिर्माण के लिए प्रोटोकॉल भी32 उपलब्ध हैं और टीईआर इलेक्ट्रोड17के एकीकरण सहित अधिक मॉड्यूलरिटी प्रदान कर सकते हैं, जो यहां उपयोग किए जाने वाले मंच से गायब है।

वर्तमान सेल संस्कृतियों33के शारीरिक संदर्भ में सुधार करने के लिए ऑर्गन-ऑन-चिप्स को एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में पेश किया गया था। हालांकि, इस तकनीक के अनुप्रयोग के लिए विशेष इंजीनियरिंग कौशल की आवश्यकता होती है, जो अक्सर जैविक रूप से उन्मुख प्रयोगशालाओं में कमी होती है। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिप प्लेटफॉर्म, जैसे कि यहां नियोजित, कम मॉड्यूलरता और बढ़ी हुई मजबूती और प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, जिसे उपयोगकर्ताओं की एक व्यापक सरणी द्वारा लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लूइडिक चिप पर लैमिनार प्रवाह का अनुप्रयोग सिरिंज या पेरिस्टेलिटिक पंपों के अनुप्रयोग पर निर्भर करता है, जो जटिलता के एक और स्तर का परिचय देता है। इस बाधा को अब संस्कृति मॉड्यूल के आवेदन के साथ दूर करना आसान है, जो कई चिप्स के एक साथ perfusion की सुविधा प्रदान करता है।

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Disclosures

देवदार-सिनाई अनुकरण में एक अल्पसंख्यक शेयर ब्याज का मालिक है, कंपनी है कि अध्ययन के माइक्रोफ्लूइडिक अंग चिप्स का उत्पादन । देवदार-सिनाई का एक अधिकारी अनुकरण के निदेशक मंडल में भी कार्य करता है । अनुकरण इस शोध के लिए कोई वित्तीय सहायता प्रदान की है । देवदार-सिनाई और अनुकरण इस काम से संबंधित पेटेंट दायर किया है ।

Acknowledgments

हम डॉ सोशना स्वेंडसेन को क्रिटिकल एडिटिंग के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को इजराइल साइंस फाउंडेशन ग्रांट 1621/18, मिनिस्ट्री ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (मोस्ट), इजराइल 3-15647, कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रिजेनरेटिव मेडिसिन ग्रांट आईडी डिस्क1-08800, शेरमेन फैमिली फाउंडेशन, एनआईएच-निंडीएस ग्रांट 1UG3NS105703 और एएलएस ग्रांट एसोसिएशन 18-एसआई-389 ने सपोर्ट किया। एएच को वॉलनबर्ग फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 2015.0178) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase EMD Millipore SCR005 Dissociation solution
B27 Gibco 12587010
Bfgf Peprotech 100-18B
Chip-S1 Emulate Inc Chip-S1 Organ-Chip
Collagen IV Sigma C5533
DAPI Invitrogen D3571
Dextran-FITC Sigma 46944
DMEM: F12 Thermo Fisher Scientific 31330038
Donkey serum Sigma D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1) Emulate Inc ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2) Emulate Inc ER-2
Fibronectin Sigma F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334
GLUT-1 Invitrogen MA5-11315
Glutamax Life Technologies 35050038 Glutamine supplement
hBDNF Peprotech 450-02
KOSR Thermo Fisher Scientific 10828028
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 354234 Basement membrane matrix
mTeSR1 StemCell Technologies, Inc. 85851
NEAA Biological industries 01-340-1B
Nestin Millipore MAB353
NutriStem Biological industries 05-100-1A Alternate media
PECAM-1 Thermo Fisher Scientific 10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) Biomedical Technologies J64483AB
Retinoic acid (RA) Sigma R2625
S100β Abcam ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SCGP00525
Triton X-100 Sigma X100
ZO-1 Monoclonal Antibody Invitrogen 33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α) Sigma T8660
β-mercaptoethanol Life Technologies 31350010

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References

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Jagadeesan, S., Workman, M. J.,… More

Jagadeesan, S., Workman, M. J., Herland, A., Svendsen, C. N., Vatine, G. D. Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip. J. Vis. Exp. (157), e60925, doi:10.3791/60925 (2020).

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