Summary
A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.
Abstract
A barreira hematoencefálica (BBB) é formada por unidades neurovasculares (ULS) que protegem o sistema nervoso central (SNC) de uma série de fatores encontrados no sangue que podem interromper a delicada função cerebral. Como tal, o BBB é um grande obstáculo para a entrega terapêutica ao CNS. A acumulação de evidências sugere que o BBB desempenha um papel fundamental no início e progressão de doenças neurológicas. Assim, há uma necessidade tremenda de um modelo BBB que possa prever a penetração de medicamentos direcionados ao CNS, bem como elucidar o papel do BBB na saúde e na doença.
Recentemente combinamos tecnologias de células-tronco pluripotentes e induzidas para gerar um chip BBB totalmente personalizado para humanos. Esta nova plataforma exibe propriedades celulares, moleculares e fisiológicas adequadas para a previsão do transporte de drogas e moléculas através do BBB humano. Além disso, utilizando chips BBB específicos do paciente, geramos modelos de doença neurológica e demonstramos o potencial de aplicações preditivas personalizadas. Fornecido aqui está um protocolo detalhado demonstrando como gerar chips BBB derivados do IPSC, começando com diferenciação de células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas do IPSC (iBMECs) e resultando em culturas neurais mistas contendo progenitores neurais, neurônios diferenciados, e astrócitos. Também é descrito um procedimento para semeader células no chip de órgão e culização dos chips BBB fluxo de laminar controlado. Por fim, são fornecidas descrições detalhadas das análises de chips BBB, incluindo ensaios de permeabilidade paracelular para avaliação da permeabilidade de medicamentos e moléculas, bem como métodos imunocitoquímicos para determinar a composição dos tipos celulares dentro do chip.
Introduction
O BBB é uma barreira altamente seletiva que separa o CNS do sangue circulante. Protege funções cerebrais críticas de substâncias, fatores e xenobióticos potencialmente disruptivos, ao mesmo tempo em que permite o fluxo de nutrientes e outros metabólitos necessários para manter a homeostase cerebral1. O BBB é um NVU multicelular no qual pericytes, pés de ponta astrócitos e processos neuronais entram diretamente em contato com células endoteliais do cérebro (BMECs). Essas interações permitem que os BMECs formem propriedades de barreira especializadas que são suportadas por junções apertadas e aderentes2,3. A formação dessa barreira limita a passagem paracelular das moléculas, mas contém transportadores polarizados para transportar ativamente moléculas para o CNS ou voltar para o sangue1. Devido a essas propriedades de barreira únicas, o BBB constitui um grande obstáculo para a entrega de biofarmacêuticos no cérebro, e estima-se que menos de 5% das pequenas moléculas aprovadas pela FDA podem chegar ao CNS4.
Modelos animais têm sido amplamente utilizados para estudar a penetração do BBB e os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do BBB5. Enquanto os modelos animais representam fielmente o complexo multicelular no ambiente vivo, diferenças de expressão e atividade dos transportadores do BBB, bem como especificidade de substrato entre espécies muitas vezes impedem a extrapolação precisa de dados animais para humanos6. Assim, os modelos de base humana são fundamentais para estudar o BBB humano e para uso no desenvolvimento de medicamentos projetados para atingir o CNS. Essa necessidade torna-se ainda mais evidente com o crescente domínio de medicamentos biológicos e específicos do homem no campo do desenvolvimento farmacêutico. O acúmulo de evidências sugere que um BBB comprometido está associado a uma série de distúrbios graves da SNC, incluindo tumores cerebrais e doenças neurológicas7,8,9. Modelos humanos que refletem fielmente essas doenças têm o potencial de ambos 1) identificar novos caminhos que poderiam ser direcionados para o desenvolvimento de medicamentos e 2) prever a penetração do CNS, reduzindo assim o tempo e os recursos em estudos pré-clínicos e possivelmente diminuindo a taxa de falha nos ensaios clínicos.
Modelos in vitro têm sido amplamente implementados para estudar interações entre BMECs e outras células do NVU e realizar telas para possíveis drogas permeáveis bbb10. Para recriar aspectos-chave do BBB humano, os modelos in vitro devem apresentar propriedades fisiologicamente relevantes (ou seja, baixa permeabilidade paracelular e resistência elétrica tranportelial fisiologicamente relevante [TEER] em toda a monocamada endotelial). Além disso, o perfil molecular de um sistema in vitro deve incluir a expressão de sistemas de transporte funcional representativos. Normalmente, os modelos in vitro são compostos de células endoteliais que são co-cultivadas em uma membrana semipermeável com combinações de outras células NVU para melhorar as propriedades DO BBB11. Essa abordagem permite uma avaliação simples e relativamente rápida da funcionalidade da barreira e permeabilidade das moléculas. Tais modelos BBB baseados em células podem ser estabelecidos com fontes de células animais ou humanas, incluindo células isoladas de excisões cirúrgicas ou linhas BMEC imortalizadas.
Recentemente, protocolos para diferenciar células pluripotentes humanas em BMECs foram introduzidos como uma fonte atraente para os modelos BBB12,13. As BMECs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são altamente escaláveis, demonstram características morfológicas e funcionais cruciais do BBB humano e carregam a genética do paciente. Na cultura, os iBMECs formam um monocamada que expressa marcadores de junção apertados e exibe em complexos de junção apertados como vivo. Essas células também expressam marcadores BBB, incluindo o transportador de glicose BBB, transporte de glicose 1 (GLUT1). É importante ressaltar, e ao contrário de outras fontes alternativas de células para BMECs humanos, os iBMECs adquirem propriedades de barreira com valores tão altos quanto os medidos no vivo14,polarizam ao longo do eixo basolateral e expressam bombas de efflux funcionais. Além disso, o uso de iPSCs de diversos assuntos, ambos 1) saúda a oportunidade de testar aspectos do BBB de forma personalizada e 2) fornece uma fonte flexível para gerar tipos celulares adicionais do NVU. Gerar essas células a partir de uma fonte de célula sogênica para criar chips BBB personalizados também ajudaria na compreensão das diferenças interindividuais nas respostas medicamentosas, que é uma das principais causas de resistência ou resposta comprometida ao tratamento observado em estudos clínicos.
O uso de iBMECs como monocamadas em um prato ou em uma inserção transwell semi-permeável representa uma abordagem poderosa para a modelagem BBB. Esses sistemas tendem a ser robustos, reprodutíveis e econômicos. Além disso, análises funcionais como TEER e permeabilidade são relativamente simples de realizar. No entanto, os sistemas bidimensionais (2D) não conseguem recapitular a natureza 3D do tecido vivo, e eles não têm as forças de estresse fisiológicos fornecidas pelo sangue e células sanguíneas circulantes. Isso limita a capacidade do endotelo vascular nesses modelos de desenvolver e manter propriedades e funções intrínsecas do BBB.
Sistemas microengenheiros forrados por células vivas foram implementados para modelar várias funcionalidades de órgãos em um conceito chamado organ-on-chips. Ao recriar em arquitetura multicelular semelhante ao vivo, interfaces teciduais, microambientes físicoquímicos e perfusão vascular, essas plataformas microprojetadas geram níveis de funcionalidade tecidual e órgão sem possível com sistemas convencionais de cultura 2D. Também permitem alta resolução, imagem em tempo real e análise de perfis bioquímicos, genéticos e metabólicos semelhantes às células vivas no contexto in vivo de tecido e órgão. No entanto, um desafio particular do órgão-on-chip é que o design, fabricação e aplicação desses chips microengenheiros exigem experiência sapateira especializada que geralmente não tem em laboratórios acadêmicos biologicamente orientados.
Recentemente, combinamos tecnologias iPSC e organ-on-chip para gerar um modelo personalizado de chips BBB15,16. Para superar os desafios tecnológicos descritos, o Chip-S1 disponível comercialmente é usado em conjunto com o módulo cultural, um instrumento projetado para automatizar a manutenção dos chips de forma simples e robusta (Emulate Inc.). O chip BBB recria interações entre células neurais e endoteliais e alcança valores TEER fisiologicamente relevantes, que é medido por chips de órgãofeitos feitos medida com eletrodos de ouro integrados17. Além disso, o chip BBB exibe baixa permeabilidade paracelular, responde a sinais inflamatórios no nível do órgão, expressa bombas de efflux ativas e exibe transporte preditivo de biomarcadores solúveis e biofarmacêuticos. Notavelmente, os chips BBB gerados a partir de diversos indivíduos capturam as diferenças funcionais esperadas entre indivíduos saudáveis e pacientes com doenças neurológicas15.
O protocolo detalhado abaixo descreve um método confiável, eficiente e reprodutível para a geração de chips BBB humanos baseados em iPSC em condições dinâmicas de fluxo. A orientação é fornecida sobre o tipo de ensaios e análises de endpoint que podem ser realizadas diretamente no chip BBB ou a partir de efluentes amostrais. Assim, o protocolo demonstra o espectro de técnicas que podem ser aplicadas para avaliação de propriedades biológicas e funcionais e respostas em um modelo humano-relevante.
Uma breve descrição do chip BBB baseado no IPSC é fornecida aqui. Os iPSCs humanos são inicialmente diferenciados e propagados em frascos de cultura tecidual como agregados flutuantes livres de progenitores neurais, denominados EZ-spheres. O canal superior do Chip-S116,18,19 é semeado com esferas de EZ dissociadas que formam o "lado cerebral" do chip, pois as células se diferenciam ao longo de 7 dias em uma cultura mista de células progenitoras neurais (iNPCs), iAstrocitos e iNeurons. Os iPSCs humanos também são diferenciados em placas de cultura tecidual em iBMECs. O canal inferior do chip é semeado com iBMECs para formar o "lado sanguíneo" à medida que se desenvolvem para formar um tubo endotelial(Figura 1). A membrana porosa extracelular (ECM) revestida que separa os canais superior e inferior 1) permite a formação de interações celular-celular entre canais e 2) permite que o usuário execute ensaios de permeabilidade e células de imagem em ambos os canais usando um microscópio de luz convencional.
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Protocol
1. Geração de células progenitoras neurais derivadas do IPSC (iNPCs)
- Produzir ez-esferas de colônias do IPSC como descrito abaixo e como publicado anteriormente20,21,22.
- Colônias culturais do IPSC à confluência na membrana do porão revestida 6 placas de poço (0,5 mg/placa) em mTESR1 ou outros meios comerciais (ver Tabela de Materiais).
- Remova o meio iPSC e substitua por 2 mL de ez-sphere médio [ESM; DMEM:F12 7:3 complementado com fator de crescimento básico do fibroblasto básico de 100 ng/mL (bFGF), fator de crescimento epidérmico de 100 ng/mL, 5 μg/mL heparina e 2% de suplemento B27].
- Raspe a parte inferior de cada confluente bem com a parte de trás de uma ponta de pipeta estéril de 1000 μL ou raspador de células.
- Colete todas as células e coloque em um frasco T25 ultra-baixo para permitir a formação espontânea de esferas flutuantes livres. Incubar durante a noite a 37 °C.
- Alimente as esferas a cada 2-3 dias quando o médium ficar amarelo substituindo metade do meio por ESM fresco. Isso permite que as esferas permaneçam em meio sedífero, o que é altamente importante para o seu crescimento e manutenção.
- Incline o frasco em um rack de tubo e permita que as esferas se acomodem pela gravidade por 1-2 min até o canto do frasco.
- Uma vez resolvido, aspirava metade do supernatante com uma pipeta sorológica de 5 mL ou 10 mL e substitua por ESM fresco e pré-aquecido.
- Passagem EZ-esferas semanalmente cortando esferas para 200 μm diâmetros como descrito anteriormente23,20,21. As esferas ez podem ser mantidas para até 25 passagens e são ideais quando usadas entre as passagens 8-25.
- Prepare a suspensão celular única dos iNPCs:
- Para induzir a diferenciação neural, dissociar a esfera ez em células únicas.
- Colete esferas de 3 a 4 dias após o corte de um frasco T75 e transfira para um cônico de 15 mL, em seguida, deixe-o ficar por 2 min ou até que todas as esferas sejam estabelecidas na parte inferior.
- Remova lentamente o ESM com uma pipeta de 5 mL sem interromper as esferas estabelecidas. Adicione 1 mL de solução de dissociação (ver Tabela de Materiais)e incubar por 10 min a 37 °C.
- Gire a solução de dissociação e as esferas após 5 min de incubação para garantir que quaisquer esferas assentadas sejam tratadas.
- Remova lentamente a solução de dissociação. Adicione 1 mL de diferencial neural médio [NDM; DMEM: F12 com 2% b27 menos vitamina A, suplemento de 1% N2 e fator neurotrófico derivado do cérebro humano (hBDNF, 20 ng/mL)].
- Triturar as esferas em células únicas, canalizando usando uma pipeta de 1 mL seguida de pipeta de 200 μL, até que todas as esferas tenham dissociado. Evite a formação de bolhas durante o procedimento de trituração.
- Conte células dissociadas usando um hemocímetro e células diluir para uma densidade final de 1 x 106 células/mL. É possível alterar a densidade dependendo da aplicação.
NOTA: Densidades mais altas (até 6 x 106 células/mL) são recomendadas para culturas de curto prazo de até 3 dias, e densidades mais baixas são recomendadas para aplicações de longo prazo de até 3 semanas.
NOTA: As células estão prontas para semear no canal superior do chip para formar o "lado cerebral".
2. Diferenciação de iPSCs em iBMECs
- IPSCs de passagem de um único poço confluente de uma placa de 6 poços a uma razão de 1:6 em uma placa bem revestida de membrana de porão. Deixe as células aderirem por 24 h. Mude o iPSC médio diariamente.
- Conte células diariamente usando um hemocímetro.
- Quando as células atingem uma densidade de 1,5-3,0 x 105 células/bem, substitua o meio iPSC por 3 mL de meio não condicionado sem bFGF [DMEM:F12 1:1, com 10% de substituição de soro nocaute (KOSR), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), suplemento de glutamina de 0,5%(Tabela de Materiais)e 100 μM-βto-mercap. Substitua o médio-diário por 6 diase 24.
- No 6º dia, substitua o meio por célula endotelial (CE) média [média endotelial de soro humano livre de soro (hESFM) complementada com 1% de soro bovino derivado de plasma, 20 ng/mL bFGF e ácido retinóico (RA)]. Deixe o meio por 2 dias.
- Remova o meio EC e adicione 1 mL de solução de dissociação por poço. Incubar a 37 °C por 35 min.
NOTA: Embora este seja considerado um longo tempo de incubação na solução de dissociação utilizada aqui, os iBMECs podem suportar esse tratamento com viabilidade celular superior a 90%. - Retire as células do poço, canalizando suavemente a suspensão celular e coletando todas as células em um tubo cônico de 15 mL.
NOTA: Evite tubulações duras. Se as células não se desprenderem facilmente, incubam por mais 5 min. - Adicione 1 volume de meio EC no cônico de 15 mL para inativar Accutase, centrífuga a 200 x g por 5 min, remova o meio e substitua por 1 mL de meio EC (sem bFGF e RA).
- Conte células usando um hemocímetro e ajuste a densidade celular para 14-20 x 106 células/mL.
NOTA: As células estão prontas para serem semeadas no canal inferior do chip para formar o "lado sanguíneo".
3. Microfabricação do chip de órgão
- Use um chip de órgão para o modelo de chip BBB e sua produção como feito anteriormente16,18,19. O chip de órgão de canal alto (ver Tabela de Materiais) é fabricado a partir de um elastômero de polidimetilsiloxano altamente flexível (PDMS) que contém dois canais de microescala sobrepostos e paralelos separados por uma membrana porosa flexível. Os tamanhos de microcanal superior e inferior são de 1 mm x 1 mm e 1,0 mm x 0,2 mm, respectivamente. Os dois canais são separados por uma membrana porosa flexível feita porosa de 50 μm de espessura, contendo poros de 7 μm de diâmetro com espaçamento de 40 μm. A superfície da membrana porosa que separa os canais é de 0,171 cm2.
4. Preparação de chip
- Os chips de órgão são fornecidos pré-embalados dentro da operadora de chips, eliminando a necessidade de perturbar ou distorcer o alinhamento do chip durante o manuseio. Além disso, a operadora de chips se conecta com segurança a um módulo portátil ("Pod") que funciona como a interface entre o módulo de cultura e o chip.
- Pulverizar a embalagem dos chips com 70% de etanol e trazer para o gabinete de biossegurança (BSC).
- Abra a embalagem e coloque o chip de órgão em uma placa de Petri estéril. Manuseie o porta-chip somente pelas laterais para evitar contato direto com o chip.
- Certifique-se de que a guia da transportadora esteja voltada para a direita (Figura 2),e ao usar vários chips, alinhe-os todos na mesma orientação.
- Rotular cada chip na guia da operadora (preparação completa do chip e fluxo de trabalho é mostrado na Figura 3).
5. Ativação superficial e revestimento ECM
- Preparação da solução de ativação da superfície
- Emular o reagente 1 (ER-1), fornecido em um frasco contendo 5 mgs, é sensível à luz. Prepare a solução ER-1 fresca imediatamente antes do uso. A integridade er-1 é crucial na preparação bem sucedida dos chips.
- Abaixe a luz no BSC ao manusear ER-1.
NOTA: ER-1 é um irritante ocular e deve ser manuseado no BSC com luvas adequadas e proteção ocular. - Permita que os reagentes ER-1 e ER-2 equilibrem a temperatura ambiente (RT) antes do uso.
- Proteja a solução da luz embrulhando um tubo cônico de 15 mL estéreo vazio com papel alumínio.
- No BSC, toque brevemente no frasco ER-1 para acomoder o pó na parte inferior.
- Adicione 1 mL de tampão ER-2 ao frasco e transfira imediatamente seu conteúdo para a parte inferior do tubo cônico embrulhado de 15 mL. Não faça pipette para misturar. A cor da solução transferida para o tubo cônico será vermelha.
- Repita o passo 5.1.6 3x. Na última rodada, tampe o frasco ER-1 e inverta para coletar qualquer pó restante da tampa, em seguida, transfira a solução para o tubo cônico; isso levará o volume total para 4 mL de solução ER-1.
- Adicione 6 mL de solução ER-2 à solução ER-1 de 4 mL no tubo cônico de 15 mL a uma concentração final de 0,5 mg/mL. Er-1 deve ser totalmente dissolvido dentro da solução ER-2.
- Ativação da superfície
- Utilizando uma pipeta P200 e uma ponta de pipeta filtrada estéril de 200 μL, absorva 200 μL de mistura ER-1.
- Coloque a pipeta na entrada inferior e empurre 20 μL de mistura ER-1 através do canal inferior até que a mistura comece a fluir para fora da saída do canal inferior.
- Adicione aproximadamente 50 μL de mistura ER-1 e coloque-o na entrada do canal superior. Empurre a mistura através do canal superior até que ela comece a fluir para fora da tomada do canal superior.
- Remova toda a mistura ER-1 excessiva da superfície do chip por aspiração suave. Certifique-se de que a mistura ER-1 só é removida da superfície do chip e não dos canais.
- Verifique se os canais estão livres de bolhas de ar antes da ativação ultravioleta (UV). Se forem detectadas bolhas de ar, remova as bolhas lavando o canal com mistura ER-1.
- Coloque o prato aberto contendo os chips na caixa de luz UV (fornecido pela Emulate Inc.).
- Ajuste o interruptor na parte de trás da caixa de luz UV para a configuração "Consistente". Ligue a energia e inicie a ativação UV. Deixe os chips luz UV por 20 min.
NOTA: Evite a exposição do pessoal à luz UV. - Remova a mistura ER-1 de ambos os canais.
- Lave cada canal com 200 μL de solução ER-2.
- Remova o ER-2 de ambos os canais.
- Lave cada canal com 200 μL de soro soro tampão de fesfato frio estéril (DPBS).
- Deixe o DPBS frio dentro dos canais até seguir para o próximo passo.
- Preparação e revestimento de matriz extracelular (ECM)
- Prepare a solução ECM combinando os componentes ECM individuais com DPBS frios, água ou outro solvente às concentrações finais de trabalho. A solução ECM deve ser preparada de novo a cada vez que for usada.
- Cubra os canais superior e inferior do chip com ECM, com composição determinada pelo tipo de célula a ser semeada. A mistura de ECM deve ser mantida no gelo até o uso.
- Use lamina (50 μg/mL) para revestir o "lado cerebral", e o colágeno IV e fibronectina misturados a uma proporção de 4:1 (320:80 μg/mL) para revestir o "lado sanguíneo" conforme descrito na seção 5.6.
- Preparação das alíquotas do ECM
- Diluir 1 mg/mL laminin em DPBS frio para uma concentração final de 50 μg/mL. Aliquot e armazenamento a -20 °C até o uso.
- Dissolva o colágeno IV em 0,1% de ácido acético a uma concentração de 1 mg/mL. Incubar a solução em 2-8 °C durante a noite ou na RT por 1-3 h ou até dissolver totalmente.
- Prepare uma mistura de 1 mL de colágeno IV:fibronectina (320 μL de colágeno IV, 80 μL de fibronectina, 600 μL de H2O estéreis bidestilados). A mistura pode ser armazenada a -20 °C.
- Revestindo os chips com ECM
- Aspirar totalmente o DPBS frio de ambos os canais. Defina uma pipeta P200 para pegar 100 μL de solução de colágeno IV:fibronectina.
- Introduza a solução através da inlet do canal inferior até que uma pequena gotícula se for na tomada. Deixe uma pequena gota na saída depois de remover a ponta da pipeta.
- Introduza a solução laminada através da primeira saída do canal até que uma pequena gotícula se for na tomada. Deixe uma pequena gota na saída depois de remover a ponta da pipeta.
- Olhe atentamente para os canais para garantir que nenhuma bolha esteja presente. Se as bolhas estiverem presentes, lave o canal com a solução ECM apropriada até que todas as bolhas sejam removidas.
- Repita os passos 5.5.1-5.5.4 para cada chip.
- Adicione 1,5 mL de DPBS à tampa de um tubo cônico de 15 mL. Coloque a tampa DPBS no prato de cultura de 150 mm com os chips para proporcionar umidade extra e selar o prato com parafilme. Para obter melhores resultados, incubar os chips a 4 °C durante a noite.
NOTA: Se desejar, as células podem ser semeadas no mesmo dia que ativação de chip e revestimento ECM, embora a incubação noturna seja preferida. Os chips podem estar prontos para semeada 4 h depois de adicionar o ECM e incubar chips a 37 °C.
6. Semeando o canal "lado cerebral" e diferenciando esferas ez em culturas neurais mistas
- Leve o prato contendo os chips preparados para o BSC. Lave suavemente ambos os canais com 200 μL de NDM.
- Evitando o contato com as portas, aspirar cuidadosamente o excesso de gotículas de mídia da superfície do chip. Agita suavemente a suspensão celular antes de semear cada chip para garantir uma suspensão celular homogênea
- Semeaos os iNPCs no canal superior para gerar o "lado cerebral"
- Sementeas as células (1 x 106 células/mL) no canal superior do chip. Adicione uma ponta P200 contendo 30-100 μL de suspensão de células para a inlet do canal superior e solte suavemente a ponta da pipeta. Pegue uma pipeta P200 vazia, deprima o êmbolo, insira na tomada do canal superior e puxe cuidadosamente a suspensão de células únicas através do chip.
- Cubra o prato e transfira para o microscópio para verificar a densidade de semeadura e distribuição homogênea das células dentro do canal superior. Remova delicadamente a ponta da tubulação das portas de entrada e saída do chip.
- A densidade de sementes deve aparecer como 20% de cobertura. Se a densidade de semeação for maior ou menor do que o esperado ou desigual, devolva os chips ao BSC, lave o canal 2x com 200 μL de meio fresco e repita a etapa 6.3.1.
- Depois de confirmar a densidade celular correta, coloque imediatamente os chips na incubadora por 2 h a 37 °C após semear cada lote de chips. Lave as células que não se prendem com NDM fresco.
- Mantenha as células em condições estáticas a 37 °C com uma substituição diária de NDM por pelo menos 48 h antes de início do fluxo. Os iBMECs podem ser semeados após os iNPCs terem anexado ou em um dia subsequente após a semeadura do iNPC.
7. Semeadores iBMECs no canal inferior para gerar o "lado sanguíneo"
- Leve o prato contendo os chips preparados para o BSC. Lave suavemente o canal inferior com 200 μL de meio EC.
- Evitando o contato com as portas, cuidadosamente aspirando gotículas de excesso de ec médio da superfície do chip, certificando-se de deixar médio em ambos os canais. Agita suavemente a suspensão celular antes de semear cada chip para garantir uma suspensão celular homogênea.
- Usando uma pipeta P200, desenhe 30-100 μL da suspensão celular do iBMEC (14-20 x 106 células/mL) e coloque a ponta na entrada do canal inferior. Desconecte delicadamente a ponta da pipeta, deixando a ponta contendo celular na porta de entrada.
- Deprima o êmbolo em uma pipeta P200 com uma ponta vazia, insira na saída do canal inferior e puxe cuidadosamente a suspensão de uma única célula através do canal inferior liberando lentamente o êmbolo pipette.
- Aspirar suspensão celular em excesso da superfície do chip. Evite contato direto com as portas de entrada e saída para garantir que nenhuma suspensão celular seja aspirada fora dos canais.
- Cubra o chip e transfira-o para o microscópio para observar a densidade de semeadura. O canal inferior deve ser preenchido sem lacunas observáveis entre as células quando observado em 4x ou 10x um microscópio (Figura 4).
- Se a densidade de semeadura estiver abaixo de 90% ou for distribuída de forma desigual, ajuste a densidade celular de acordo e repita as etapas 7.2-7.6 até que a densidade correta seja alcançada dentro do canal. Após a confirmação da densidade celular correta (Figura 4),as células de sementes nos chips restantes. Para anexar células na membrana porosa, que está localizada na parte superior do canal inferior, inverta cada chip e descanse em um berço de chip.
- Coloque um pequeno reservatório (15 mL tampa de tubo cônico contendo DPBS estéreis) dentro do prato de 150 mm para fornecer umidade para as células. Incubar chips a 37 °C por aproximadamente 3h, ou até que as células do canal inferior tenham anexado. Uma vez que os iBMECs tenham anexado (~3 h após a semeade), gire os chips de volta para uma posição vertical para permitir que a fixação do celular na parte inferior do canal inferior.
8. Iniciação do fluxo
- O fluxo é tipicamente iniciado 48 h após a semeade dos iBMECs. Desta vez é necessário para que os iBMECs se conectem firmemente ao chip.
- Para manter o fluxo laminar através do chip, é importante desgascar e equilibrar a temperatura do meio. O meio deve ser pré-aquecido em um banho de água de 37 °C por 1h.
- Até 50 mL de meio aquecido podem ser degaseados por incubação um sistema de filtragem movido a vácuo por 15 min.
- Priming de módulos portáteis
- Higienize o exterior das embalagens e bandejas do módulo portátil com 70% de etanol, limpe e transfira para o BSC. Abra a embalagem e coloque os módulos na bandeja. Oriente-os com os reservatórios em direção à parte de trás da bandeja.
- Pipette 3 mL de mídia pré-equilibrada e quente para cada reservatório de entrada. Adicione o meio de cultura EC ao reservatório de letras do canal inferior e ndm ao reservatório de letras do canal superior (Figura 5).
- Pipette 300 μL de mídia pré-equilibrada e quente para cada reservatório de tomada, diretamente sobre cada porta de tomada (Figura 5).
- Coloque até seis módulos portáteis em cada bandeja. Leve bandejas para a incubadora e deslize completamente para o módulo de cultura com a alça da bandeja voltada para fora.
- Selecione e execute o ciclo "Prime" no módulo de cultura. Feche a porta da incubadora e deixe o módulo de cultura para preparar os módulos portáteis (leva ~1 min). O ciclo de priming é concluído quando a barra de status diz "Pronto". Remova a bandeja do módulo de cultura e leve-a para o BSC.
- Verifique se os módulos portáteis foram preparados com sucesso inspecionando a parte inferior de cada módulo portátil no BSC. Procure a presença de pequenas gotículas nos quatro portos.
- Se algum módulo portátil não mostrar gotículas, recorra o ciclo principal nesses módulos. Se alguma mídia pingou na bandeja (isso pode ocorrer mais frequentemente pelos portos de tomada), limpar bandeja com 70% de etanol.
- Conexão de chips a módulos portáteis, regulação e iniciação do fluxo
- Lave suavemente ambos os canais de cada chip com um meio de cultura quente e equilibrado para remover possíveis bolhas no canal e coloque pequenas gotículas de mídia (de acordo com a mídia no canal) na parte superior de cada porta de entrada e outlet.
- Insira chips com operadoras nos módulos portáteis e coloque até seis em cada bandeja. Insira bandejas no módulo de cultura. Programe as condições adequadas de cultura do chip de órgão (fluxo e estiramento) no módulo cultural.
- As condições programadas começarão assim que o ciclo "Regular" estiver concluído.
NOTA: As taxas de fluxo para cada canal podem ser controladas de forma independente e podem ser definidas em taxas que variam de 0 a 1.000 μL/h. O chip BBB é tipicamente cultivado a 30 μL/h. Ao fluir mídias como mídia EC ou ESM a 30 μL/h e 1000 μL/h, as forças de cisalhamento são 0,01 dyn/cm2 e 0,33 dyn/cm2,respectivamente. - Execute o ciclo "Regular", que leva aproximadamente 2 h, após o qual o módulo cultural começará a fluir nas condições de cultura do chip de órgãopré-set.
9. Avaliação de permeabilidade paracelular sangue-cérebro
- Prepare ndm complementado com 10 μg/mL dextran-FITC (4 kDa). Esta solução será usada como entrada para o canal "lado sanguíneo".
- Preencha os reservatórios inferiores do canal dos módulos portáteis com NDM complementado com dextran-FITC. Encha os reservatórios do canal superior com NDM sem rastreador.
- Perfunda ambos os canais superior escoeados a uma taxa de fluxo de 30 μL/h por pelo menos 4 h até que a mídia suficiente acumule para avaliação da fluorescência em um leitor de placas (tipicamente 100 μL).
- Colete amostras de mídia dos reservatórios de entrada e saída dos canais superior espantados e inferiores. Proteja as amostras da luz.
- Diluir serialmente o NDM complementado com 10 μg/mL dextran-FITC 1:1 usando NDM sem rastreador para gerar uma curva de calibração de 10-12 pontos.
- Tome 100 μL de cada amostra, incluindo a curva de calibração, em uma placa de poço preta de 96 e leia fluorescência usando um leitor de placa (485 nm excitação, emissão de 530 nm).
- Use os valores medidos para calcular os valores doaplicativo P da seguinte forma:
- Faça medições diárias para avaliar as propriedades da barreira e confirme que o chip BBB ainda está funcional.
10. Imunocitoquímica
- Leve batatas fritas para um capuz de fume químico. Utilizando uma pipeta P200, fixe as células perfundindo ambos os canais com 200 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) na DPBS e incubar por 10 min na RT.
- Após a fixação, perfunda cada canal com 200 μL de DPBS e incuba por 5 min. Repita a lavagem do DPBS 2x.
- Bloqueie e permeabilize as células no chip, perfundindo a solução de bloqueio primário (PBS, complementada com 5% de soro de burro normal e 0,1% Triton X-100). Incubar na RT por 1h.
- Diluir anticorpos primários na solução de bloqueio primário e incubar durante a noite a 4 °C. Os marcadores BMECs são GLUT-1 (1:100 diluição), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) e VE-cadherin (1:200). Marcadores neurais são βIII-tubulina (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), Nestin (1:1000) e GFAP (1:1000).
- Lave as fichas 3x com DPBS frios.
- Diluir anticorpos secundários em solução de bloqueio secundário (DPBS com 5% de soro de burro normal sem Triton-X).
- Perfunda a solução secundária de anticorpos através de ambos os canais. Normalmente, anticorpos secundários fluorescentes são diluídos 1:1000. Incubar por 1h no RT protegido contra a luz.
- Lave os chips 3x com DPBS.
- Manchas de núcleos de células perfundindo chip com 100 μL de solução DAPI. Incubar na RT por 5 min.
- Lave os chips 3x com DPBS.
- O chip está pronto para imagem usando um microscópio fluorescente ereto ou invertido. A transparência do PDMS permite imagens no chip de órgão intacto. As ampliações acima de 10x podem exigir objetivos de longa distância de trabalho devido à espessura do chip do órgão.
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Representative Results
A Figura 6A,B,C representa um chip BBB semeado com ez-spheres no canal superior do "lado cerebral" e iBMECs no canal inferior "lado do sangue". os iBMECs foram semeados primeiro e autorizados a anexar durante a noite, após o qual as esferas ez foram semeadas. Os chips foram então cultivados em condições estáticas com substituição diária da mídia por sete dias. O chip BBB foi então fixado utilizando 4% de PFA na RT por 10 min e lavado 3x com DPBS. A imunocitoquímica foi realizada no chip BBB usando 1) nestin como marcador para células progenitoras neurais, 2) S100β ou GFAP como marcadores para astrócitos, e 3) βIII-tubulina como marcador para neurônios. GLUT-1 e Pecam-1 foram usados como marcador para BMECs. A imagem foi realizada em 20x usando um microscópio confocal e imagens foram processadas usando Fiji para software ImageJ.
A Figura 6D representa um ensaio de permeabilidade paracelular que foi realizado em chips de órgãos povoados com iBMECs e ez-spheres, iBMECs sozinho (sem ez-esferas) ou ez-spheres sozinho (sem iBMECs). Após um ciclo "Regular", um rastreador Dextran-FITC de 4 kDa foi adicionado ao reservatório do "lado sanguíneo" a uma concentração final de 10 μg/mL, e os chips foram perfundidos a 30 μL/h durante a noite. Em seguida, a mídia foi coletada de reservatórios de ida e saída dos canais superior e inferior. Foram coletados 100 μL de cada amostra e examinados para fluorescência usando um leitor de placas.
É importante ressaltar que foi utilizada uma curva de calibração 1:1 para transformar valores de fluorescência em valores de concentração do Dextran FITC. Os valores foram então utilizados para calcular permeabilidade(aplicativoP). Esses resultados demonstram que os iBMECs formam propriedades de barreira funcionais, que são ainda mais reforçadas quando os iBMECs são co-cultivados com esferas EZ. Chips cultivados apenas com esferas EZ, não conseguem formar uma barreira. Uma abordagem semelhante pode ser usada para examinar o transporte de qualquer molécula através do chip BBB, dependendo de um método de medição disponível (por exemplo, fluorescência, ELISA ou espectrofotometria em massa).
Figura 1: Esquemática do chip BBB baseado no IPSC. Antes da semeada no chip, os iPSCs são diferenciados em placas culturais em (i) ez-spheres (células progenitoras neurais, iNPCs), que são cultivadas em suspensão como esferas, e em células endoteliais endoteliais cerebrais (iBMECs). As esferas ez são dissociadas em células únicas, semeadas no canal superior do chip de órgãos, onde se diferenciam ainda mais em culturas neurais mistas para formar o "lado cerebral". os iBMECs são semeados no canal inferior do chip de órgão para formar uma estrutura semelhante a um vaso sanguíneo no "lado sanguíneo". Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Schematic da visão superior do chip na operadora de chips, com portas rotuladas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Fluxograma da preparação e fluxo de trabalho do BBB baseado no iPSC. A pré-diferenciação de células neurais e endoteliais das iPSCs é necessária antes do início do fluxo de trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Semeade dos iBMECs no canal inferior. Imagens de brightfield de iBMECs semeadas no canal inferior (A)imediatamente após a semeadura ou (B) 24 h pós-semeadura, após as células se apegarem. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Esquema do chip conectado e módulo portátil com reservatórios de mídia de ida e saída rotulados. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Resultados representativos. Imunocitoquímica no chip BBB baseado no IPSC 7 dias após a semeada. EZ-esferas diferenciadas em uma população de células neurais mistas no canal superior "lado cerebral", incluindo os atrócitos(A)S100β+ (verde), células progenitoras neurais Nestin+ (vermelhas) bem como astrócitos(vermelho)GFAP+ (vermelho) e neurônios βIII-tubulin+ (vermelho). Barras de escala = 200 μm.(C) iBMECs semeados no canal inferior "lado sanguíneo" expressavam GLUT-1 e (verde) PECAM-1 (CD31, vermelho). Barra de escala = 200 μm.(D) A avaliação da permeabilidade do chip BBB foi realizada adicionando dextran-FITC (4 kDa) no reservatório do canal inferior. Os resultados demonstram que os chips de órgãos semeados com iBMECs e ez-spheres exibem uma barreira apertada em comparação com chips de órgãos semeados apenas com iBMECs (*p < 0,05). Chips de órgãos semeados apenas com esferas EZ não exibem propriedades de barreira (***p < 0,001; ANOVA unidirecional com o teste de várias comparações de Tukey). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
A combinação de tecnologia organ-on-chip e células derivadas do IPSC no NVU mantém a promessa de modelagem precisa do BBB humano. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para aplicação simples e robusta do recém-publicado chip BBB16. Uma visão geral e um tempo do paradigma de semeade é mostrado na Figura 3. Para obter e manter funções de barreira adequadas para a modelagem BBB, gerar uma monocamada homogênea do iBMEC e manter sua integridade são fundamentais. O primeiro passo para a geração de um monocamada funcional inclui a ativação química da superfície PDMS não polar que permite a fixação de proteínas ECM. Os reagentes de ativação da superfície degradam-se rapidamente após a reconstituição, o que pode eventualmente resultar em apego subideal das células. Por isso, é importante manter os reagentes frescos e protegidos da luz durante todo o processo.
Durante a ativação UV (seção 5.2), os reagentes devem ser distribuídos uniformemente dentro de cada canal, a fim de alcançar revestimento ECM consistente e apego homogêneo da célula. Composições e concentrações de ECM fornecidas neste protocolo foram otimizadas para os tipos específicos de células (ouseja, iBMECs e células progenitoras neurais derivadas da ez-sphere). A mudança da composição celular é possível, mas pode exigir condições diferenciais de ECM, o que exigirá otimização. Após o revestimento ECM, é crucial semearinar iBMECs corretamente. A alta densidade de sementes de células (>14 x 106 células/mL) é essencial para obter um monocamada completo. Se não conseguir alcançar a confluência celular completa, é aconselhável aumentar ainda mais a densidade da suspensão celular até 20 x 106 células/mL durante a semeade.
O fluxo laminar foi previamente sugerido para melhorar o amadurecimento do iBMEC15 e é indispensável para o cumprimento das vantagens proporcionadas pela plataforma microfluida. No entanto, microbolhas fluindo pelos canais do chip podem estressar fisicamente e desprender células residentes, o que pode levar à destruição da integridade do chip BBB. Para evitar a formação de microbolhas durante o fluxo de laminar, é fundamental equilibrar o meio antes da perfusão ser iniciada. O equilíbrio requer pré-aquecimento e desgasagem do meio antes do uso.
A geração de chips personalizados é possível utilizando iBMECs derivados do IPSC humano e iNPCs. Embora a diferenciação dos iBMECs seja curta e bastante simples24,22, diferenciação de iPSCs em células neurais21,25 é mais desafiadora. No entanto, as células neurais que residem no "lado cerebral" do chip podem ser substituídas por qualquer tipo de célula neural, como células neurais primárias ou neurônios motores derivados do IPSC16. Da mesma forma que as células endoteliais "bona fide", os iBMECs exibem plasticidade na expressão genética em resposta a diferentes coculturas neurais. Assim, essa flexibilidade pode resultar no desenvolvimento futuro de vários NVUs no chip. Flexibilidade adicional do sistema pode ser obtida ajustando o tempo e a ordem de semeadeda celular. Os iBMECs podem ser semeados antes ou depois das células neurais, possibilitando semear iBMECs imediatamente após a semeadura e fixação de células neurais, ou depois que as esferas ez se diferenciaram em culturas neurais mais maduras no ambiente de chips. Isso é de particular importância, dada a natureza imatura das células neurais derivadas do IPSC. Dado que as esferas ez são progenitoras neurais iniciais, períodos de diferenciação mais longos também podem resultar em uma porcentagem aumentada de astrócitos e neurônios.
Um componente que está faltando no protocolo são os perivasculares, que fornecem um componente crucial no NVU fisiológico. Os recentes avanços na diferenciação do iPSCs em células semelhantes a pericyte26,27 permitirão a introdução desse tipo celular adicional, fornecendo assim uma réplica melhorada do BBB, preservando sua natureza personalizada.
Os IBMECs já demonstraram diversas propriedades que são fundamentais para a modelagem bbb, incluindo expressão de marcadores celulares, o estabelecimento de TEER e atividade funcional de bombas efflux28,24,5. No entanto, análises moleculares revelaram que essas células também expressam vários marcadores epiteliais15. Avanços na geração do IBMEC mostrando melhor função e expressão de marcador endotelial foram recentemente descritos29,30. Seguindo o paradigma aqui apresentado, essas células potencialmente melhoradas podem ser facilmente incorporadas ao modelo de chip BBB para aplicações futuras. A plataforma flexível, porém robusta, descrita aqui, pode facilitar tanto a modelagem da doença quanto o desenvolvimento e avaliação de novos medicamentos CNS.
Embora este protocolo dependa de um produto comercialmente específico disponível, empresas comerciais adicionais oferecem diversas plataformas microfisiológicas, que podem oferecer vantagens alternativas31. Além disso, os protocolos para a fabricação "internamente" de chips de órgãomicrofluidos também estão disponíveis32 e podem oferecer mais modularidade, incluindo a integração dos eletrodos TEER17, o que está faltando na plataforma aqui utilizada.
Os organ-on-chips foram introduzidos como uma abordagem alternativa para melhorar o contexto fisiológico das culturas celulares atuais33. No entanto, a aplicação dessa tecnologia requer habilidades especializadas de engenharia, que muitas vezes são carentes de laboratórios biologicamente orientados. Uma plataforma de chips comercialmente disponível, como a empregada aqui, fornece menos modularidade e maior robustez e reprodutibilidade, que podem ser aplicadas por uma gama mais ampla de usuários. Além disso, a aplicação do fluxo laminar em um chip microfluido depende da aplicação de seringas ou bombas peristálticas, que introduz outro nível de complexidade. Esse obstáculo agora é mais fácil de superar com a aplicação do módulo cultural, o que facilita a perfusão simultânea de vários chips.
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Disclosures
A Cedars-Sinai possui um interesse minoritário em Ações em Emulate, a empresa que produz os chips de órgãomicrofluidos do estudo. Um oficial da Cedars-Sinai também atua no Conselho de Administração de Emulate. A Emulate não forneceu apoio financeiro para esta pesquisa. Cedars-Sinai e Emulate têm patentes arquivadas relacionadas a este trabalho.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pela Fundação israelista de Ciência1 1621/18, pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST), Israel 3-15647, pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia, o ID DISC1-08800, a Sherman Family Foundation, nih-NINDS grant 1UG3NS105703, e a Associação ALS conceder 18-SI-389. AH foi financiada pela Wallenberg Foundation (grant number 2015.0178).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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