Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En MR-baseret værktøjskasse til neurokirurgisk planlægning hos ikke-menneskelige primater

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61098
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2, 4, 5, 4, 4, 1,2,3
1Bioengineering Department, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, University of Washington, 3Electrical and Computer Engineering Department, University of Washington, 4Department of Ophthalmology, SUNY Downstate Health Sciences University, 5Radiology Department, University of Washington

Summary

Nedenstående metode har til formål at tilvejebringe en omfattende protokol til fremstilling af ikke-menneskelig primat (NHP) neurokirurgi ved hjælp af en ny kombination af tre-dimensionelle (3D) trykningsmetoder og MR-dataudtræk.

Abstract

I dette papir skitserer vi en metode til kirurgisk præparat, der giver mulighed for praktisk planlægning af en række neurokirurgier i NHPs udelukkende ved hjælp af data udvundet fra magnetisk resonans imaging (MR). Denne protokol giver mulighed for generering af 3D-printede anatomisk præcise fysiske modeller af hjernen og kraniet, samt en agarose gel model af hjernen modellering nogle af de mekaniske egenskaber i hjernen. Disse modeller kan udvindes fra MR ved hjælp af hjerneudvinding software til modellen af hjernen, og brugerdefineret kode til modellen af kraniet. Forberedelsesprotokollen udnytter den nyeste 3D-printteknologi til at lave interfacing hjerner, kranier og forme til gelhjernens modeller. Kraniet og hjernen modeller kan bruges til at visualisere hjernevæv inde i kraniet med tilføjelse af en kraniotomi i den brugerdefinerede kode, giver mulighed for bedre forberedelse til operationer direkte involverer hjernen. Anvendelserne af disse metoder er designet til operationer involveret i neurologisk stimulation og registrering samt injektion, men alsidigheden af systemet giver mulighed for fremtidig udvidelse af protokollen, ekstraktion teknikker, og modeller til et bredere anvendelsesområde af operationer.

Introduction

Primatforskning har været et afgørende skridt i udviklingen af medicinsk forskning fra dyremodeller til forsøg medmennesker 1,2. Dette er især tilfældet i studiet af neurovidenskabogneuralteknik, da der er en stor fysiologisk og anatomisk uoverensstemmelse mellem gnaverhjerner og ikke-menneskelige primater (NHP)1,2,3. Med nye genetiske teknologier såsom kemogenetik, optogenetik, og calcium billeddannelse, der kræver genetisk modifikation af neuroner, neurale engineering forskning studerer neurale funktion i NHP's har fået særlig opmærksomhed som en præklinisk model for forståelse hjernefunktion2,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16. I de fleste NHP neurovidenskab eksperimenter, neurokirurgiske foranstaltninger er nødvendige for implantation af forskellige enheder såsom hoved stillinger, stimulation og optagelse kamre, elektrode arrays og optiske vinduer4,5,6,7,10,11,13,14,15,17,18.

Nuværende NHP labs bruge en række forskellige metoder, der ofte omfatter ineffektive praksis, herunder sedating dyret til at passe benene på et hoved post og omtrentlige krumning af kraniet omkring kraniotomi site. Andre laboratorier passer hovedet post til kraniet i kirurgi eller anvende mere avancerede metoder til at få de nødvendige målinger for implantation som at analysere en NHP hjerne atlas og magnetisk resonans (MR) scanninger for at forsøge at vurdere kraniet krumninger2,10,11,16. Neurokirurgi i NHPs også involverer væskeindsprøjtninger, og laboratorier har ofte ingen måde at visualisere den forventede injektion placering i hjernen2,4,5,13,14 udelukkende bygger på stereotaxic målinger og sammenligning med MR-scanninger. Disse metoder har en vis uundgåelig usikkerhed fra at være ude af stand til at teste den fysiske kompatibilitet af alle de komplekse komponenter i implantatet.

Derfor er der behov for en nøjagtig noninvasive metode til neurokirurgisk planlægning i NHPs. Her præsenterer vi en protokol og metode til fremstilling af implantation og injektion operationer i disse dyr. Hele processen stammer fra MR-scanninger, hvor hjernen og kraniet udvindes fra dataene for at skabe tredimensionelle (3D) modeller, der derefter kan 3D-printes. Kraniet og hjernen modeller kan kombineres for at forberede sig til kraniotomi operationer samt hoved stillinger med en øget grad af nøjagtighed. Hjernen model kan også bruges til at skabe en støbeform til støbning af en anatomisk præcis gel model af hjernen. Gel hjernen alene og i kombination med en ekstraheret kraniet kan bruges til at forberede en række injektion operationer. Nedenfor vil vi beskrive hver af de trin, der kræves for MR-baserede værktøjskasse til neurokirurgisk præparat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Washington Institute for Animal Care and Use Committee. To mandlige rhesus macaques (abe H: 14,9 kg og 7 år gammel, abe L: 14,8 kg og 6 år) blev brugt.

1. Erhvervelse af image

  1. Transporter aben til en 3T MR-scanner og læg dyret i en MR-kompatibel stereoaksisk ramme (Tabel over Materialer).
  2. Optag standard T1 (flip vinkel = 8°, gentagelsestid /ekko tid = 7.5/3.69 s, matrix størrelse = 432 x 432 x 80, erhvervelse varighed = 103.7 s, Multicoil (Tabel over Materialer), antal gennemsnit = 1, skive tykkelse = 1 mm) anatomiske MR-billeder.
    BEMÆRK: For vellykket kraniet isolation, bruge MR-erhvervelse parametre anvendes her for at maksimere adskillelsen mellem kraniet og hjernen.

2. Hjerneudvinding

  1. I MR-billedbehandlingssoftwaren til hjerneudtræk skal du vælge Open | Åbn billede. Indlæs T1 Quick Magnetization Prepared Rapid Gradient Echo (MPRAGE) scanning erhvervet i trin 1.2 i en MR-billedbehandlingssoftware (Tabel over Materialer).
  2. Hvis du vil udtrække hjernen, skal du vælge Extract Brain (BET) under rullemenuen Plugins. Der udvindes ved en intensitetstærskel på ca. 0,5− 0,7, og tærskelgradientværdien indstilles til 0. Brug gentagne gange ekstraktionsfunktionen ved successivt lavere intensitetstærskler, indtil scanningen kun indeholder den kortikale anatomi (Figur 1B).
    BEMÆRK: Dette er en iterativ proces, fordi softwaren ikke er designet til NHP hjerner og ekstraktion er ikke præcis
  3. Under menuen interesseområde skal du vælge Tærskel for investeringsafkast og vælge indstillingen for Shrink Wrap og 3D for at oprette et bitmap af hjernen. Dette konverterer diskenheden til binære bits fra et forløb, hvilket strømliner fremtidige modelgenereringsprocesser. Vælg en tærskel (normalt omkring 600) for at isolere hjernen fra det omgivende væv. Denne grænse kan findes ved at holde markøren over det grå stof. Vælg OK for at danne bitmap'en.
  4. Hvis du vil oprette en overflade, skal du vælge Byg overflade under billedmenuen og indtaste den tærskel, der bruges til at udtrække hjernen i trin 2.3. Vælg derefter OK. Den resulterende overflade kan bruges som reference til justering af tærskelværdien for at opnå den højeste kvalitetsrepræsentation af den målrettede anatomi (figur 1C).
  5. Under fanen Filer skal du vælge Gem eller gem som, og gemme det udtrukne hjerneafkast som en .nii- eller .nii.gz-fil til brug ved oprettelse af hjernens model.

3. Hjernemodellering

  1. Vælg Indlæs data | Vælg Filer for at tilføje og indlæse den udtrukne hjerne, der er gemt i .nii.gz- eller filtypen i medicinsk billedbehandlingssoftware (Materialetabel).
  2. Hold markøren over velkomstmenuen til udsnitsværktøj på værktøjslinjen og flyt til alle moduler. Vælg editorfunktionaliteten i den menu. Klik på OK på pop op-advarslen.
  3. Vælg Tærskeleffekt i menuen i editormodulet, og juster skyderne for tærskelområdet, så den del af bitmapen, der indeholder hjernen, fremhæves i alle tre udsnit. Når du indlæser en bitmap, vælger justering af begge skydere til en værdi på 1 hele hjernen. Vælg Anvend.
  4. Åbn modelproducentmodulet, og vælg den bitmapfil, der blev genereret i trin 3.3, i rullemenuen inputdiskenheder. Vælg Opret nyt modelhierarki under Modeller. Når du har tildelt navnet på modellen til hierarkiet, skal du vælge Anvend for at oprette diskenheden.
  5. Gem filen i .stl-formatet.
  6. For yderligere at ændre hjernen model, indlæse .stl fil som en grafik krop i computer aided design software (Tabel over Materialer)
    BEMÆRK: Dette kan tage et stykke tid, da de importerede mesh hjerneoverflader ofte er ret komplekse.
  7. Når filen er importeret, i funktionen træet på venstre side af skærmen klik på børnene i den grafiske krop og undertrykke unødvendige grafiske funktioner, indtil kun de funktioner, der indeholder hjernen er tilbage i filen. Gem den resterende fil som en .prt til yderligere manipulation og som en .stl til 3D-udskrivning. Gem den resterende fil som en .prt til yderligere manipulation og som en .stl til 3D-udskrivning.

4. Hjernestøbning

  1. Indlæs den udtrukne hjernemodel fra afsnit 3 til den computerstøttede designsoftware ved at åbne .prt-filen. Vælg Konverter til masketekst under sektionen Funktioner i menuen Indsæt. Vælg den grafiske krop i hjernen og konvertere det.
  2. Oprettelse af en højre og venstre form af den fulde hjerne
    1. Klik på knappen Skitse, og vælg det øverste plan som skitseplanet. Tegn et rektangel, der indeholder enten hele højre eller venstre hjernehalvdel. Vælg extrude boss / base funktion, mens i skitsen og ekstrudere en kubisk rektangel til at indeholde den øverste del af hjernen.
      BEMÆRK: Terningen skal muligvis ekstruderes i to retninger for at indeholde hele halvkuglen. Dette skyldes, at nulpunktet, hvor ekstruderingsplanet er placeret, kan falde ind i hjernemodellen. Ekstrudering i begge retninger sikrer, at formen vil omfatte hele mængden af interesse.
    2. Vælg Konverter til maskekrop under sektionen funktioner i menuen 'Indsæt'. Vælg den ekstruderede kube i mappen Legemer, og konverter den. Hvis du vil oprette det negative rum, skal du trække hjernens model fra den nyligt ekstruderede terning ved hjælp af funktionen Kombiner og vælge indstillingen Træk fra.
    3. Gentag trin 4.2.1 og 4.2.2 for den anden hjernehalvdel (venstre eller højre) og gem de resulterende filer som en .stl til 3D-udskrivning og en .prt til yderligere manipulation.
  3. Oprettelse af en højre og venstre form af den øverste halvdel af hjernen.
    1. Opret en skitse i det øverste plan og tegne et rektangel, der indeholder enten hele højre eller venstre hjernehalvdel. Vælg ekstruderingsbossen/basisfunktionen, mens du er i skitsen, og ekstruder med funktionen Forskydning fra plan markeret. Forskudt ekstrudering op til en afstand, hvor der ikke er nogen overhængende konturer i hjernens anatomi, indfange bare den øvre anatomi. Vælg Konverter til maskekrop under sektionen funktioner i menuen 'Indsæt'. Vælg den ekstruderede kube i mappen Legemer, og konverter den.
    2. Hvis du vil oprette det negative rum, skal du trække hjernens model fra den nyligt ekstruderede terning ved hjælp af funktionen Kombiner og vælge indstillingen Træk fra.
    3. Opret en skitse plan på dorsale side af formen og vælg Konverter enheder og derefter vælge skitsen fra trin 4.3.1.
    4. Vælg extrude boss / base funktion, mens i skitsen og med blind ekstrudering mulighed valgt, ekstrudere den faste krop ca 5 mm til helt at omslutte den subtraherede hjernens anatomi i formen.
    5. Gentag trin 4.3.1−4.3.4 for den anden hjernehalvdel (venstre eller højre) og gem de resulterende filer som en .stl til 3D-udskrivning og en .prt til yderligere manipulation.
  4. Ved at ændre terningens dimensioner og placering og følge den samme protokol (trin 4.1 og 4.2) skal du oprette forme, der indeholder forskellige dele af hjernen.
  5. Til 3D-printning skal du bruge ~70% infill-tæthed og øge tykkelsen af udskriftens ydre skal for at minimere udsivningen af støbematerialet. Hvis der er huller eller mangler i printet, fylde dem ved hjælp af neglelak eller en anden bindende agent.

5. Skull modellering

  1. Importer QUICK MPRAGE MRI fra trin 1.2 til matrixmanipulationssoftwaren som en DICOM-fil. DICOM-filen kan være i separate 2D-rammer. Hvis det er tilfældet, skal du kombinere alle rammer i en 3D-matrix. Sørg for, at hver 2D-ramme af matrixen viser en koronal skive.
  2. Opret en binær maske ved at spærre 3D-matrixen ved hjælp af en operator, der er større end operatoren for individuelle pixelværdier. Juster tærsklen, således at kraniets anatomi bliver fanget af masken (se Supplerende kodningsfil CalibrateMask).
    BEMÆRK: Masken indeholder fire forskellige lag. Udefra i, vil de blive omtalt som "udenfor", "muskulatur", "kranium", og "hjerne". På dette tidspunkt, "udenfor" og "kraniet" er 0's i masken, og "muskulatur" og "hjerne" er 1's.
  3. For at fjerne "muskulatur" lag, behandle hver ramme fra 3D-masken separat ved iterativt snuppe en 2D skive fra masken (dvs. 3D_Mask(:,:,1)).
    1. For hver ramme skal du vælge 0 pixel fra rammens hjørner i "udvendige" lag som "frø". Søg derefter i de omkringliggende 0'er, indtil du støder på en 1 pixel. Fortsæt søgningen, indtil der ikke er fundet flere 0'er. Konverter alle forbundne 0'er til 1'er. Dette gøres ved hjælp af Matlab-funktionen "imfill", hvor input og udgange er [MASK2] = imfill(MASK1,LOCATIONS,CONNECTIVITY), hvor MASK1 er din oprindelige maske, og MASK2 er den udfyldte maske (se Supplerende kodningsfil FillExterior).
  4. Nogle kraniet oplysninger vil gå tabt under fjernelsen. For at afbøde tab af oplysninger skal du udføre trin 5.3 i alle tre dimensioner af dataene og holde dem adskilt.
    BEMÆRK: Nu både "udenfor" og "muskulatur" er 1's, og vil blive betragtet som "udenfor". Masken indeholder nu tre forskellige lag, "udenfor", "kraniet" og "hjernen". "Udenfor" og "hjerne" er 1's, og "kraniet" er 0's.
  5. Inverter maskens værdier ved hjælp af operatoren ~ (dvs. MASK2 = ~MASK1). Nu "kranium" er 1's og "udenfor" og "hjerne" er 0's.
  6. Den 1's, der rører hinanden i hver maske kan betragtes som "objekter". Opret et indeks over alle objekter i hver maske ved hjælp af Matlab-funktionen "bwconncomp", hvor input og udgange er [CC] = bwconncomp(MASK), hvor MASK er 3D-maskematrixen, og CC er et strukturelt objekt, der indeholder indeksværdierne for hvert objekt, antallet af objekter og matrixens størrelse. For hver maske skal du fjerne alle objekter med undtagelse af den største, der indeholder de fleste voxels, ved at indstille værdierne for de mindre objekter til 0'er (se Supplerende kodningsfil RemoveNoise).
  7. Tilføj de masker, der er oprettet fra hvert gennemløb sammen (se Supplerende kodningsfil MergeMasks).
  8. Skaler hjernen til en ensartet opløsning.
    1. Sammenlign trinstørrelsen mellem hver ramme i MR-scanningen fra DICOM-headeren med dimensionerne for hver pixel.
    2. Hvis disse værdier er forskellige, skal du definere en skaleringsfaktor for at kompensere for forskellen i opløsning mellem trinstørrelse og pixelstørrelse for hver voxel. Hvis hver ramme for eksempel er 1 mm fra hinanden, og pixeldimensionen er 0,33 mm x 0,33 mm, vil skalafaktoren være 3.
    3. Føj yderligere tomme voxels til 3D-masken, indtil maskens laveste opløsningsdimension er større af en faktor, der er defineret af skalafaktoren (se Supplerende kodningsfil "ScaleMask").
    4. Interpoler lineært værdier i masken, indtil masken udfylder det nye område.
    5. Eksporter kraniet som en .stl-fil eller en lignende filtype til 3D-udskrivning.

6. Kraniotomi skabelse i 3D kraniet model

  1. Ved hjælp af MR-filen fra trin 5.1, manuelt identificere den omtrentlige placering af kraniotomi fra anatomiske vartegn findes i makak hjernen atlas (f.eks centrale sulcus)19.
    1. Få vist et enkelt udsnit af 3D-matrixen (svarende til trin 5.3).
    2. Scan manuelt frem eller tilbage gennem 3D-matrixen, indtil genkendelige anatomiske landemærker er placeret.
    3. Gem rammenummeret som z-koordinat (dvs. 3D_Mask::,,z)
    4. Brug et datavalgsværktøj til at gemme x- og y-koordinaterne for et enkelt punkt på denne ramme, så kraniotomien skal centreres på ved hjælp af Matlab-funktionen "getpts", hvor input og udgange er [x,y] = getpts. "getpts" åbner en brugergrænseflade, skal du klikke på den ønskede ramme (se Supplerende kodning fil LocateCraniotomy).
  2. Omregn radius af den tilsigtede kraniotomi fra mm til voxels ved hjælp af oplysningerne i DICOM-headeren.
  3. Ved hjælp af det punkt, der er angivet i trin 6.1 som et midtpunkt, skal du indstille alle voxels inden for den radius, der er defineret i 6,2, til nul i masken fra trin 5.8.4 ved hjælp af supplerende kodningsfil Craniotomy, hvor indgange og udgange er [craniotomyMask] = Craniotomy(maske, x, y, z, radius, X, Y, Z, opløsning), hvor cranitomyMask er en 3D-matrix med en kraniotomi fjernet, maske er den oprindelige 3D-matrix, x,y,z er centrumpunkt koordinaterne af kraniotomi, radius er radius af kraniotomi, X, Y, Z er gitter vektorer af 3D matrix, og opløsning er din radius defineret i trin 6.2 (se supplerende kodning fil Craniotomy).
  4. For flere kraniotomier gentages trin 6.1−6.3 for hver unik kraniotomi.
  5. Eksporter kraniet som en .stl-fil eller en lignende filtype til 3D-udskrivning.

7.3D udskrivning

BEMÆRK: Der anvendes to typer 3D-printere til fysiskeprototyper( Materialetabel). For følgende specifikationer skal alle indstillinger for 3D-printer og udskrivningssoftware være standard, medmindre andet er nævnt.

  1. For at udskrive prototyper og forme, skal du bruge en standard PLA printer(Tabel af materialer)og skabe G-kode med følgende printer og software indstillinger: indre tæthed > 50% (dette er især vigtigt for forme, da de skal holde væske), hurtig honeycomb interne fylde mønster, retlinede eksternt fyld mønster, plade temperatur = 50 °C, og ekstruder temperatur = 230 °C.
  2. For at udskrive højere troskab modeller af hjernen og kraniet bruge en industriel kvalitet printer til at gøre en kombineret print af acrylonitrile butadiene styren (ABS) for modellen og en opløselig støtte materiale (Tabel af Materialer). Opret derefter G-koden og med følgende printerindstillinger: Fyldtypisk Sparse - High Density. Alle andre indstillinger indstilles automatisk til den relevante standardindstilling.
    1. Opløs modellen i støtte opløsningsmiddel (Tabel over Materialer) for ~ 12 h.
  3. Når du har implementeret de relevante printerindstillinger, skal du trykke på Start og se det første lag af udskriften for at sikre, at basislaget er rent og jævnt.
  4. Efter 3D udskrivning af forme, lappe eventuelle synlige huller med neglelak (Tabel af materialer) for at sikre en strammere forsegling.
    BEMÆRK: 3D-printede hjerne- og kraniemodeller kan kombineres ved at indsætte hjernemodellen i kraniets åbne bund. Fjernelse af øjet anatomi kan lette placeringen af hjernen model uden at miste vigtige oplysninger. Når den placeres inde i kraniet, hjernen naturligt tilpasser sig den anatomisk korrekte position.

8. Forberedelse af agarose

  1. Bland agar pulver (Tabel af Materialer) og græshoppe bønne tyggegummi pulver ( Tabel afmaterialer) i en 1:4 forholdet ved masse.
  2. Pulverblandingen kombineres med 1x fosfatbuffer (materialetabel) med en koncentrationsopløsning på 0,6 % i en Erlenmeyerkolbe.
    BEMÆRK: Koncentrationer, der anvendes af andre laboratorier falder i et interval på 0,5%-0,6%20,21.
  3. Mikrobølgeovnen sættes til maksimal effekt, og kolben, der indeholder opløsningen, anbringes i mikrobølgeovnen i 2 min.
  4. Overhold opløsningen. Når opløsningen begynder at boble, skal du stoppe mikrobølgeovnen og timeren, fjerne kolben og hvirvle kraftigt. Sæt kolben tilbage i mikrobølgeovnen og genoptag mikrobølgeovnen og timeren.
    BEMÆRK: Formålet er at opvarme opløsningen uden at reducere volumen betydeligt på grund af fordampning under kogning.
  5. Gentag trin 8.4, indtil de to minutter er færdige.
  6. Kolben fjernes, og der skal være en hvirvel, så opløsningen kan sættes i kolben.
  7. Der skal løbe koldt vand på ydersiden af kolben for at afkøle opløsningen, mens den hvirvler rundt. Afkøl opløsningen, indtil ydersiden af kolben er varm at røre ved, men tålelig og sikker, for at forhindre opløsningen i at deformere plastformen i følgende trin.
  8. Hvirvles kolben, mens du transporterer opløsningen til formen for at undgå for tidlig hærdning.

9. Agarose støbning

BEMÆRK: Den agarose støbning proces skitseret nedenfor er den samme for den fulde halvkugle og øvre halv halvkugle forme

  1. Hæld agarose opløsning i en af hjernen forme indtil fuld. Fortsæt med at hvirvle restopløsning i kolben.
  2. Overvåg niveauet af opløsning i formen for lækager. Genopfyld formen efter behov, da indstillingen agarose vil forsegle eventuelle lækager i formen.
  3. Lad opløsningen i formen sidde uforstyrret ved stuetemperatur, indtil opløsningen er sat og hærdet til et fast stof.
    BEMÆRK: Mens ventetiderne kan variere afhængigt af opløsningens volumen og andre faktorer, er 2 timer at være en pålidelig ventetid.
  4. Brug en spatel til forsigtigt at fjerne gelmodellen fra formen. Vær strategisk med placeringen af spatel indsættelse i formen for at forhindre potentielle deformationer til overfladen af formen.
  5. For at bremse den naturlige fordampningsproces og eksponering for biologiske agenser skal gelmodellen i en forseglet beholder være i køleskab.

10. Injektion i agarose gel model

  1. Forbered pumpen til infusion og fastgør den i en stereoaxic arm på en stereotaxic ramme (Tabel over materialer). Anfør pumpen på den korrekte injektionsbane og placering, der er normal på overfladen af gelmodellen, fra afsnit 9.
  2. Fyld en 250 μL sprøjte (Materialetabel) med DI-vand. Monter sprøjten på pumpen( Materialetabel).
    BEMÆRK: Før du tegner farvestof, skal DI-vand fylde injektionskanlen (Materialetabel) helt. På den måde, når farvestoffet er udarbejdet gennem kanylen er der ingen kompression eller udvidelse af luft af stemplet, der kan påvirke injektion volumen.
  3. Brug pumpedriveren (Materialetabel) til at trække fødevarefarven (materialetabel)ind i sprøjten til målmængden til injektion. Injicer maden farve langsomt, indtil en lille perle former på spidsen af kanylen for at forhindre luftbobler i at blive injiceret i gelen. Tør perle af spidsen af kanylen.
  4. Placer gelmodellen under kanylen. Sænk kanylen, indtil spidsen rører overfladen af gelmodellen. Bemærk målingerne på den stereotaxiske arm.
  5. Sænk kanylen i gelmodellen hurtigt og jævnt til målindsprøjtningsdybden, og sørg for, at overfladen af gelen er forseglet omkring kanylen.
  6. Kør pumpen og observere spredningen af maden farve, indtil målet volumen er injiceret. Start med et flowrate på 1 μL/min. og forøg til 5 μL/min. med 1 μL/min trin hvert minut. Spredningen af fødevarefarve i gelen er en tilnærmelse af spredningen af en viral vektor i hjernen.
  7. Fjern kanylen fra gelen hurtigt og glat.
  8. Tag billeder af spredningen af fødevarefarven med en fotografisk enhed (Tabel over Materialer) og fysisk måle dimensionerne af emboli for at beregne ellipsevolumen af injektionen. Denne fremgangsmåde er mulig på grund af gelens gennemsigtige karakter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Manipulation og analyse af MRI'er som en præoperativ kraniotomiplanlægningsforanstaltning er blevet anvendt med succes i deseneste 2,5,10,16. Denne proces, dog, er blevet stærkt forbedret ved tilsætning af 3D modellering af hjernen, kraniet, og kraniotomi. Vi var i stand til at skabe en anatomisk præcis fysisk model af hjernen, der afspejlede det område af interesse for vores undersøgelser (Figur 1). Vi var ligeledes i stand til at skabe en anatomisk nøjagtig fysisk model af primat kraniet udvundet fra MR-billeder (Figur 2).

De to fysiske modeller af kraniet og hjernen kombineret med en stram interferens pasform, validering af nøjagtigheden af de to modeller i forhold til hinanden og legitimere den ekstrapolerede MR-analyse data (Figur 3A, B). Med den kombinerede model var vi i stand til at indsætte en kraniotomi i kraniet før udskrivning og visualisere den forudsagte anatomi i kraniotomi (Figur 3). Nøjagtigheden af den forudsagte anatomi i kraniotomien blev valideret ved en sammenligning af den fysiske model og den forventede kraniotomi fra MR-analyse (Figur 3B). Derudover var vi i stand til at kombinere alle de dele af vores eksempel interface og evaluere geometri af de forskellige komponenter i forhold til kraniet og hjernen(Figur 3C, D).

For at teste kraniet model, en fysisk model af kraniet af Monkey L blev udvundet ved hjælp af de metoder, der er skitseret ovenfor og 3D trykt til at planlægge et hoved post implantation kirurgi. Fødderne af hovedet post blev derefter manipuleret og monteret på krumning af kraniet på placeringen af implantationen (Figur 3E). Som et resultat af den præoperative montering af hovedet post, kirurgi tid blev reduceret fra ca 2,5 timer til 1 time (216% hurtigere) fra åbning til implantation, hvilket i høj grad reducerer risikoen for operative komplikationer22.

Ved at manipulere 3D-modellen af hjernen i SolidWorks, vi var i stand til at skabe en støbeform, der præcist afspejlede anatomi af både den trykte hjerne og hjernen model udvundet fra MR (Figur 4A-C). Denne skimmel blev brugt til at kaste en agarose blanding model af hjernen (Figur 4D, E). Ved hjælp af disse forme i hjernen, vi var i stand til at injicere i forskellige områder af hjernen og anslå mængden af infusion af en injektion procedure modelleret med et gult farvestof (Tabel af Materialer). Den halve halvkugle gel model af hjernen blev med succes brugt til at fange et klart overblik over spredningen af farvestoffet i en model virus injektion, giver os mulighed for at måle en omtrentlig mængde af farvestoffet over tid, da det blev injiceret (Figur 5A). Injektion af farvestof i hjernen model blev kombineret med en 3D trykt kranium til model viral vektor injektion kirurgi (Figur 5B, C). Dette blev kombineret med en elektrokortikografi array placering på toppen af injektionen til at guide implantation som forberedelse til kirurgi7,10.

Figure 1
Figur 1: Modeller af udvundet hjerne.
(A)Lagdelt serie af T1-QuickMPRAGE koronale skiver af hjernen i Monkey H. (B) Lagdelt serie af MR skiver af den ekstrahertede hjerne Monkey H ved hjælp af BET plugin og Mango software som beskrevet i afsnittet Metoder. (C)Axial, sagittal, og skæv visning af en model af den grå stof Monkey H skabt ved hjælp af overfladebygning funktionalitet i Mango. (D)Axial, sagittal, og skæv visning af en 3D-trykt model af den grå stof Monkey H skabt ved hjælp af en Dremel 3D45 ekstrudering printer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kranieudtrækning.
(A)Lagdelt serie af T1-QuickMPRAGE koronale skiver af hjernen af Monkey H. (B) Lagdelt serie af binære maske efter simpel tærskel MR skiver. (C) Lagdelt serie af binær maske efter fjernelse af "muskulatur lag". (D)Lagdelt serie af binær maske af kraniet efter behandling som beskrevet i afsnittet Metoder. (E) 3D-model genereret fra binær maske. (F) 3D-model med simuleret kraniotomi fjernet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Kirurgisk præparat ved hjælp af 3D-printede prototyper.
(A)Kombination af 3D-printet hjerne udvundet med Mango inde i en 3D trykt kranium udvundet fra MR af Monkey L som skitseret i afsnittet Metoder. (B) Sammenligning af kraniotomi målretning mellem vores 3D-modeller og MR planlægning i Monkey L. (C, D) Et eksempel på at bruge vores værktøjskasse til at forberede kammer(C)og array (D) implantation15. (E) 3D trykt model af kraniet af Monkey L anvendes til pre-bøjning hovedet-post før operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Gel hjerne modellering.
(A, B)3D-model af formen for Monkey H. (C) 3D trykte forme fra A og B. Billedet til venstre er en form, der anvendes til at skabe den øverste del af højre halvkugle. Billedet til højre er en støbeform til at skabe den højre halvkugle(D)Agarose modeller af den øverste del af højre halvkugle (venstre) og hele højre halvkugle (højre). (E)Agarose model af højre halvkugle placeret inde i en 3D print af en udvundet kranium fra Monkey L, viser den nøjagtige repræsentation af hjernen og kraniotomi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Indsprøjtningsmodellering.
(A) Tidsforfald billeder af injektionsproceduren. Øverste venstre panel forudindsættelse. Øverst til højre panel efter indsættelse. Lavere fire paneler viser spredningen af farvestoffet over tid. (B)Gel model af en del af hjernen placeret i en 3D trykt kranium med en kraniotomi sådan, at injektioner af fødevarer farve kan observeres i forhold til de kortikale strukturer og elektrode placering. (C) 3D print af et kammer passer til kraniet og observeret i forhold til elektrode array, gel model, og injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende kodningsfiler. Klik her for at downloade disse filer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel beskriver en værktøjskasse til forberedelse til neurokirurgi i NHPs ved hjælp af fysiske og CAD modeller af kraniet og hjernens anatomi udvundet fra MR-scanninger.

Mens de ekstraherede og 3D trykte kraniet og hjernen modeller blev designet specielt til fremstilling af kraniotomi operationer og hoved post implantationer, metoden egner sig til flere andre applikationer. Som beskrevet før, den fysiske model af kraniet giver mulighed for pre-bøjning af hovedet post før operationen, hvilket skaber en god pasform med kraniet. Desuden kan det udtrukne kranium fra MR bruges til at generere en 3D designet hoved post med en højere troskab til kraniet anatomi. Mens CT-billeddannelse traditionelt er en bedre modalitet for kranieekstraktion, i den foreslåede metode, hjernen og kraniet anatomi kommer fra den samme billeddannelse modalitet, som kan bidrage til øget anatomisk konsistens mellem knoglen og blødt væv modeller. Denne anatomiske konsistens kan øge præcisionen og sikre, at kraniotomien dækker den kortikale region af interesse, og at alle implantationskomponenter, såsom stimulering og optagelse kamre, passer kraniet krumning. Dette understøttes af eksisterende undersøgelser, der kvantitativt sammenlignede MR-udvundet kraniet topografi til ekstraktioner fra andre scanningstyper23,24. Andet arbejde på området har skitseret metoder til oprettelse af modeller og 3D trykte prototyper til hoved post implantation25,26, men de bruger ikke udelukkende MR-scanninger til at skabe en fleksibel model for forberedelse til både hoved udstationering og kraniotomi. Det er vigtigt at bemærke, at MR-anskaffelsesparametrene, der anvendes her, er kritiske i vellykket kranieudvinding som beskrevet i protokollen. Tidligere arbejde inden for hjerneudvinding og kraniestribe tilbyder alternativer til den bredt tilgængelige BET hjerneudvinding, der anvendes i denneprotokol 27. Tilsvarende kraniet udvinding brugerdefinerede scripts findes, men de kræver manuel fjernelse af ikke-kraniet voxels i forhold til en helt automatiseret protokol28. Mens her viser vi kun et par eksempler, disse værktøjer er gældende for en række andre operationer såsom elektrode og kammer implantationer i NHPs2,4, 5,7,10,15,18,29,30,samt andre dyremodeller31,32.

Når det kombineres med agarose blandingen hjernemodeller, den kirurgiske forberedelse værktøjskasse kan anvendes til at forberede kirurgiske procedurer, der involverer væskeindsprøjtninger såsom optogenetikogkemogenetik2,4,5,10,33,34. Selv her havde vi succes med at bruge PLA til 3D udskrive forme, kan denne proces forbedres yderligere ved hjælp af en ABS glødetråd, som har en højere glas overgang temperatur, der vil gøre støbning processen mere effektiv. Tidligere arbejde har foreslået agarose gel som et kunstigt materiale, der kan efterligne nogle af de mekaniske egenskaber i hjernen er relevante for væske infusion20,21. Men tidligere arbejde har ikke kombineret agarose med en hjerne-realistisk skimmel til at give en kirurgisk forberedelse værktøj. Den støbte agarose blanding gel hjerner kan bruges til at give kvalitative kortikale sammenhæng til injektion placering og visualisere volumen og placering af væskediffusion. Gelhjernerne kan også bruges til at øve injektionsbevægelse og placering inden for den stereoaksiske ramme. Dette kan ikke kun anvendes på optogenetik, men omsættes til andre eksperimenter, der kræver injektion i hjernen2,4,34. Modellen kan også bruges til at forbedre den nuværende CED standard praksis ved at optimere injektion hastighed og kanyle tykkelse. Denne model kan også styrkes ved kvantitativ validering af agarosegelblandingen for præcist at repræsentere diffust og konvektivt flow i hjernen5,10. I den fremtidige indsats kan vi også indarbejde vaskulaturoplysninger i vores 3D-modeller ved at inkludere kontrastforbedret billedbehandling til vores billedbehandlingsprocedure, som kan give vigtige oplysninger om injektionsplanlægning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre på nuværende tidspunkt.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development of the National Institutes of Health under Award Number K12HD073945, Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), Center for Neurotechnology (CNT, en National Science Foundation Engineering Research Center under Grant EEC-1028725) og University of Washington Royalty Research Funds. Finansiering til Macknik og Martinez-Conde labs for dette projekt kom fra en BRAIN Initiative NSF-NCS Award 1734887, samt NSF Awards 1523614 & 1829474, og SUNY Empire Innovator Stipendier til hver professor. Vi takker Karam Khateeb for hans hjælp med agarose forberedelse, og Toni J Huan for teknisk hjælp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printing Software (GrabCAD Print) Stratasys Version 1.36 Used for High quality 3D printing
3D Printing Software (Simplify 3D) Simplify3D Version 4.1 Used for PLA 3D printing
Agarose Benchmark Scientific A1700 Used for making gel brains
Black Nail Polish L.A. Colors CNP637 Used for gel molding
Cannula (ID 450 um, OD 666 um) Polymicro Technologies 1068150625 Used to inject dye into gel brain
Catheter Connector B Braun PCC2000 Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50
Dremel 3D Digilab 3D45 printer Dremel F0133D45AA Used for prototyping in PLA
ECOWORKS Stratasys 300-00104 Used to dissolve QSR support structures
Erlymeyer flask Pyrex 4980 Used for gel molding
Ethyl cyanoacrylate The Original Super Glue Corp. 15187 Used to make combined cannula
Graduated cylinder 3023 Used for gel molding
HATCHBOX PLA 3D Printer Filament HATCHBOX 3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK 1kg Spool, 1.75mm, Red/Black
Locust Bean Gum Modernist Pantry 1018 Gumming agent for gel brain mixtures
MATLAB MathWorks R2019b Used for skull extraction
McCormick Yellow Food Color McCormick Used for dye injection
Microwave Panasonic NN-SD975S Used for agarose curing
MR Imaging Software (3D Slicer) 3D Slicer Version 4.10.2 Used for 3D model generation
MR Imaging Software (Mango with BET plugin) Reasearch Imaging Institute Version 4.1 Used for brain extraction
Philips Acheiva MRI System Philips 4522 991 19391 Used to image non-human primates
Phosphate Buffered Solution Gibco 70011-044 10X diluted with DI water to 1X
Pump WPI UMP3T-1 Used for dye injection
Pump driver WPI UMP3T-1 Used for dye injection
Refrigerator General Electric Used to preserve agarose gel
Scientific Spatula VWR 82027-494 Used to extract gel molds
SolidWorks Dassault Systemes 2019
Stratasys ABS-M30 filament Stratasys 333-60304 Used for high quality 3D printing
Stratasys F170 3D printer Stratasys 123-10000 Used for high quality 3D printing
Stratasys QSR support Stratasys 333-63500 Used to create supports with ABS model
Syringe SGE SGE250TLL Used for dye injection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Phillips, K. A., et al. Why primate models matter. American Journal of Primatology. 76 (9), 801-827 (2014).
  2. Macknik, S. L., et al. Advanced Circuit and Cellular Imaging Methods in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8267-8274 (2019).
  3. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  4. Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biol. 16 (8), 2005839 (2018).
  5. Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
  6. Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in nonhuman primates. Elife. 7, (2018).
  7. Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
  8. Yao, Z., Yazdan-Shahmorad, A. A Quantitative Model for Estimating the Scale of Photochemically Induced Ischemic Stroke. Conference proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 2744-2747 (2018).
  9. Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Sabes, P. N. Novel techniques for large-scale manipulations of cortical networks in nonhuman primates. Conference proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 5479-5482 (2018).
  10. Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
  11. Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in nonhuman primates. SPIE BiOS. , (2015).
  12. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Progress in Brain Research. 196, 215-233 (2012).
  13. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), 7297-7306 (2016).
  14. May, T., et al. Detection of optogenetic stimulation in somatosensory cortex by nonhuman primates--towards artificial tactile sensation. PLoS One. 9 (12), 114529 (2014).
  15. Griggs, D. J., K, K., Philips, S., Chan, J. W., Ojemann, W. K. S., Yazdan-Shahmorad, A. Optimized large-scale optogenetic interface for nonhuman primates. SPIE BiOS. , (2019).
  16. Khateeb, K., Griggs, D. J., Sabes, P. N., Yazdan-Shahmorad, A. Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  17. Lucas, T. H., Fetz, E. E. Myo-cortical crossed feedback reorganizes primate motor cortex output. Journal of Neuroscience. 33 (12), 5261-5274 (2013).
  18. Jackson, A., Mavoori, J., Fetz, E. E. Long-term motor cortex plasticity induced by an electronic neural implant. Nature. 444 (7115), 56-60 (2006).
  19. Paxinos, G., Huang, X. F., Petrides, M., Toga, A. W. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd Edition. , Elsevier Science. (2008).
  20. Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
  21. Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
  22. Cheng, H., et al. Prolonged operative duration is associated with complications: a systematic review and meta-analysis. Journal of Surgical Research. 229, 134-144 (2018).
  23. Michikawa, T., et al. Automatic extraction of endocranial surfaces from CT images of crania. PLoS One. 12 (4), 0168516 (2017).
  24. Soliman, A. S., et al. A realistic phantom for validating MRI-based synthetic CT images of the human skull. Medical Physics. 44 (9), 4687-4694 (2017).
  25. Blonde, J. D., et al. Customizable cap implants for neurophysiological experimentation. Journal of Neuroscience Methods. 304, 103-117 (2018).
  26. Overton, J. A., et al. Improved methods for acrylic-free implants in nonhuman primates for neuroscience research. Journal of Neurophysiology. 118 (6), 3252-3270 (2017).
  27. Lohmeier, J., Kaneko, T., Hamm, B., Makowski, M. R., Okano, H. atlasBREX: Automated template-derived brain extraction in animal MRI. Scientific Reports. 9 (1), 12219 (2019).
  28. Ortiz-Rios, M., et al. Improved methods for MRI-compatible implants in nonhuman primates. Journal of Neuroscience Methods. 308, 377-389 (2018).
  29. Nishimura, Y., Perlmutter, S. I., Eaton, R. W., Fetz, E. E. Spike-timing-dependent plasticity in primate corticospinal connections induced during free behavior. Neuron. 80 (5), 1301-1309 (2013).
  30. Seeman, S. C., Mogen, B. J., Fetz, E. E., Perlmutter, S. I. Paired Stimulation for Spike-Timing-Dependent Plasticity in Primate Sensorimotor Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1935-1949 (2017).
  31. Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 122 (4), 1502-1517 (2019).
  32. Schweizer-Gorgas, D., et al. Magnetic resonance imaging features of canine gliomatosis cerebri. Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 180-187 (2018).
  33. Galvan, A., et al. Nonhuman Primate Optogenetics: Recent Advances and Future Directions. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10894-10903 (2017).
  34. Galvan, A., Caiola, M. J., Albaugh, D. L. Advances in optogenetic and chemogenetic methods to study brain circuits in nonhuman primates. Journal of Neural Transmission. 125 (3), 547-563 (2018).

Tags

Denne måned i JoVE ikke-menneskelige primater magnetisk resonans imaging neurokirurgisk planlægning 3D-print viral vektor levering optogenetik
En MR-baseret værktøjskasse til neurokirurgisk planlægning hos ikke-menneskelige primater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ojemann, W. K. S., Griggs, D. J.,… More

Ojemann, W. K. S., Griggs, D. J., Ip, Z., Caballero, O., Jahanian, H., Martinez-Conde, S., Macknik, S., Yazdan-Shahmorad, A. A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates. J. Vis. Exp. (161), e61098, doi:10.3791/61098 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter