Summary
以下に概説する方法は、三次元(3D)印刷法とMRIデータ抽出の新しい組み合わせを用いた非ヒト霊長類(NHP)脳神経外科の調製のための包括的なプロトコルを提供することを目的とする。
Abstract
本論文では、磁気共鳴画像(MRI)から抽出したデータを用いて、NHPにおける様々な神経外科の実用計画を可能にする外科的準備の方法を概説する。このプロトコルは、脳と頭蓋骨の3Dプリント解剖学的に正確な物理モデルの生成だけでなく、脳の機械的特性の一部をモデル化脳のアガロースゲルモデルを可能にします。これらのモデルは、脳のモデルのための脳抽出ソフトウェアを使用してMRIから抽出することができ、頭蓋骨のモデルのためのカスタムコード。準備の議定書は、最先端の3D印刷技術を利用して、脳の脳モデルにインターフェースする脳、頭蓋骨、および型を作ります。頭蓋骨と脳のモデルは、カスタムコードに頭蓋切り出しを加えて頭蓋骨内の脳組織を視覚化するために使用することができ、脳を直接含む手術のためのより良い準備を可能にする。これらの方法の適用は、神経学的刺激および記録および注入に関与する手術のために設計されているが、システムの多様性は、手術のより広い範囲にプロトコル、抽出技術、およびモデルの将来の拡大を可能にする。
Introduction
霊長類研究は、動物モデルからヒト試験への医学研究の進展における重要なステップである 1,2.これは、げっ歯類の脳と非ヒト霊長類の脳(NHP)1、2、3の間に大きな生理学的および解剖学的不一致があるので、神経科学と神経工学の研究において特にそうである。神経細胞の遺伝子組み換えが必要な化学遺伝学、光遺伝学、カルシウムイメージングなどの新たな遺伝子技術により、NHPにおける神経機能を研究する神経工学研究は、脳機能2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16を理解するための前臨床モデルとして特別な注目を集めている。ほとんどのNHP神経科学実験では、ヘッドポスト、刺激および記録室、電極アレイおよび光学窓4、5、6、7、10、11、13、14、15、17、18などの様々なデバイスの移植に神経外科的措置が必要である。
現在のNHPラボは、頭部ポストの脚に合わせて動物を鎮静させ、頭蓋骨切開部位の周りの頭蓋骨の湾曲を近似するなど、しばしば効果のない慣行を含む様々な方法を使用しています。他の研究室は、手術で頭蓋骨に頭部ポストをフィットさせるか、NHP脳アトラスと磁気共鳴(MR)スキャンを分析して頭蓋骨湾曲を推定しようとするような移植に必要な測定を得るより高度な方法を採用しています2,10,11,16.NHPの神経外科も体液注射を伴い、実験室では立体的測定とMRスキャンとの比較のみに依存する脳内の予想射出位置を視覚化する方法が多い。これらの方法は、インプラントのすべての複雑なコンポーネントの物理的適合性をテストすることができないことから避けられない不確実性の程度を有する。
したがって、NHPにおける脳神経外科計画のための正確な非侵襲的な方法が必要である。ここでは、これらの動物の移植および注射手術の準備のためのプロトコルと方法論を提示する。全体のプロセスは、MRIスキャンに由来し、脳と頭蓋骨をデータから抽出して3Dプリントできる3次元(3D)モデルを作成します。頭蓋骨と脳のモデルは、頭蓋骨切脳手術だけでなく、精度の高いレベルのヘッドポストの準備に組み合わせることができます。脳モデルはまた、脳の解剖学的に正確なゲルモデルの鋳造のための金型を作成するために使用することができます。ゲル脳単独で、抽出された頭蓋骨と組み合わせて、様々な注射手術の準備に使用できます。以下では、脳神経外科製剤のためのMRIベースのツールボックスに必要な各ステップについて説明する。
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Protocol
すべての動物の手順は、動物のケアと使用のためのワシントン大学研究所委員会によって承認されました.2匹の雄のアカゲザル(サルH:14.9kgと7歳、サルL:14.8kgおよび6歳)が使用された。
1. 画像の取得
- サルを3T MRIスキャナに輸送し、MR互換のステレオタキシックフレーム(材料表)に動物を配置します。
- 標準T1(反転角度=8°、繰り返し時間/エコー時間=7.5/3.69s、マトリックスサイズ=432 x 432 x 80、取得期間= 103.7 s、マルチコイル(材料表)、平均数=1、スライス厚=1mm)解剖学的MR画像を記録します。
注: 頭蓋骨の分離を成功させるには、ここで適用される MRI 取得パラメータを使用して、頭蓋骨と脳の分離を最大化します。
2. 脳の抽出
- 脳抽出用のMRイメージングソフトウェアで [オープン|イメージを開く。ステップ1.2で取得したT1クイック磁化準備高速勾配エコー(MPRAGE)スキャンをMRイメージングソフトウェア(材料表)にロードします。
- 脳を抽出するには、プラグインドロップダウンメニューで[脳を抽出(BET)]を選択します。0.5~ 0.7 前後の強度しきい値で抽出し、しきい値の勾配値を 0 に設定します。スキャンに皮質解剖学のみが含まれるまで、連続的に低い強度の閾値で抽出関数を繰り返し使用する(図1B)。
注:ソフトウェアはNHPの脳のために設計されておらず、抽出は正確ではないので、これは反復プロセスです - 対象領域 (ROI) メニューの [ROI に対するしきい値 ] を選択し、[ 縮小ラップ ] と [3D] オプションを選択して、脳のビットマップを作成します。これにより、このボリュームはグラデーションからバイナリビットに変換され、将来のモデル生成プロセスが合理化されます。周囲の組織から脳を分離するしきい値(通常は約600)を選択します。このしきい値は、グレーの問題の上にマウスを置くことによって見つけることができます。 [OK] を 選択してビットマップを作成します。
- サーフェスを作成するには、イメージメニューの下で[サーフェスを構築]を選択し、ステップ2.3で脳を抽出するために使用するしきい値を入力します。次に、[OK] をクリックします。結果として得られた表面は、閾値を調整するための基準として使用して、標的解剖学の最高品質表現を生成することができる(図1C)。
- ファイルタブで 保存または名前 を 付けて保存を選択し、脳のモデルを作成する際に使用するために、抽出した脳 ROI を .nii または .nii.gz ファイルとして保存します。
3. 脳モデリング
- [ データの読み込み] |の選択追加するファイルを選択 し、医療画像処理ソフトウェア(資料表)で.niiまたは.nii.gzファイルタイプに保存された抽出された脳をロードします。
- モジュールツールバーの「ようこそ」の「スライサー」ドロップダウンメニューにカーソルを合わせ、すべてのモジュールに移動します。そのメニューから 、エディタ 機能を選択します。ポップアップ警告で [OK] をクリックします 。
- [エディタモジュール] メニューで[しきい値効果]を選択し、しきい値範囲のスライダを調整して、3 つのスライスすべてで、脳を含むビットマップの部分がハイライト表示されるようにします。ビットマップをロードする場合、両方のスライダを 1 の値に調整すると、脳全体が選択されます。[適用 ] を選択します。
- モデル メーカー モジュールを開き、入力ボリューム ドロップダウン メニューで、手順 3.3 で生成されたビットマップ ファイルを選択します。[モデル] で、[新しいモデル階層の作成] を選択します。モデルの名前を階層に割り当てた後、[適用]を選択してボリュームを作成します。
- ファイルを .stl 形式で保存します。
- 脳モデルをさらに変更するには、コンピュータ支援設計ソフトウェアでグラフィックスボディとして .stl ファイルをロードします (材料表)
注: インポートされたメッシュの脳の表面は非常に複雑であることが多いので、これは、しばらく時間がかかる場合があります。 - ファイルがインポートされたら、画面左側のフィーチャ ツリーでグラフィック ボディの子をクリックし、脳を含むフィーチャだけがファイルに残るまで不要なグラフィック フィーチャを非表示にします。残りのファイルを .prt として保存し、さらに操作を行う場合は .stl として 3D 印刷します。残りのファイルを .prt として保存し、さらに操作を行う場合は .stl として 3D 印刷します。
4. 脳成形
- .prtファイルを開いて、セクション3から抽出された脳モデルをコンピュータ支援設計ソフトウェアにロードします。挿入メニューのフィーチャーセクションで、メッシュボディに変換 を選択します。脳のグラフィックボディを選択し、それを変換します。
- 完全な脳の右と左の金型を作成します。
- [ スケッチ ]ボタンをクリックし、スケッチ平面として上部平面を選択します。脳の右半球または左半球の全体を含む長方形を描きます。スケッチ中に押し出しボス/ベースフィーチャーを選択し、3 次長方形を押し出して脳の上部を含めます。
注: 半球全体を含めるには、立方体を 2 方向に押し出す必要があります。これは、押し出しの平面が配置されているゼロ点が脳モデル内に入る可能性があるためです。両方向に押し出すと、金型が対象のボリューム全体を包含します。 - [挿入] メニューの [フィーチャ ] セクションで、[ メッシュ ボディに変換] を選択します。ソリッド ボディ フォルダで立ち上げ立方体を選択し、変換します。負のスペースを作成するには、 結合 機能を使用して新しく押し出された立方体から脳のモデルを減算し、減算オプションを選択します。
- 脳の他の半球(左または右)に対して手順4.2.1と4.2.2を繰り返し、結果のファイルを3D印刷用の.stl、さらに操作するための.prtとして保存します。
- [ スケッチ ]ボタンをクリックし、スケッチ平面として上部平面を選択します。脳の右半球または左半球の全体を含む長方形を描きます。スケッチ中に押し出しボス/ベースフィーチャーを選択し、3 次長方形を押し出して脳の上部を含めます。
- 脳の上半分の左右の型を作成します。
- 上面にスケッチを作成し、脳の右半球または左半球全体を含む長方形を描きます。スケッチ内で押し出しボス/ベース フィーチャーを選択し、[ 平面からのオフセット ]フィーチャーを選択して押し出します。脳の解剖学に張り出した輪郭がない距離まで押出しをオフセットし、上層の解剖学だけをキャプチャします。[挿入] メニューの [フィーチャ] セクションで、[ メッシュ ボディに変換] を選択します。ソリッド ボディ フォルダで立ち上げ立方体を選択し、変換します。
- 負のスペースを作成するには、 結合 機能を使用して新しく押し出された立方体から脳のモデルを減算し、減算オプションを選択します。
- 金型の裏側にスケッチ平面を作成し、[ エンティティを変換 ]を選択してから、ステップ 4.3.1 からスケッチを選択します。
- スケッチ中に押し出しボス/ベース フィーチャーを選択し、ブラインド押し出しオプションを選択した状態で、ソリッド ボディを約 5 mm 押し出して、引いた脳の解剖学を金型内で完全に囲みます。
- 脳の他の半球(左または右)に対して手順4.3.1-4.3.4を繰り返し、結果のファイルを3Dプリント用の.stl、さらに操作するための.prtとして保存します。
- キューブの寸法と位置を変更し、同じプロトコル(手順 4.1 と 4.2)に従って、脳のさまざまな部分を含む金型を作成します。
- 3D印刷の場合は、成形材料の漏れを最小限に抑えるために、充填密度を70%程度にし、印刷物の外殻の厚さを増やします。印刷物に隙間や欠陥がある場合は、マニキュアまたは他の結合剤を使用してそれらを埋めます。
5. スカルモデリング
- ステップ 1.2 から、クイック MPRAGE MRI を DICOM ファイルとしてマトリックス操作ソフトウェアにインポートします。DICOM ファイルは、別々の 2D フレームに配置できます。この場合は、すべてのフレームを 3D マトリックスに結合します。マトリックスの各 2D フレームにコロナ スライスが表示されていることを確認します。
- 個々のピクセル値に対して「より大きい」演算子を使用して 3D 行列をしきい値にして、バイナリマスクを作成します。頭蓋骨の解剖学がマスクによってキャプチャされるようなしきい値を調整します ( 補足コーディングファイルの「キャリブレートマスク」を参照)。
注: マスクには 4 つの異なるレイヤーが含まれます。外から見ると、それらは「外部」、「筋肉」、「頭蓋骨」、「脳」と呼ばれます。この段階では、マスク内の「外側」と「頭蓋骨」は0、筋肉と脳は1です。 - 「筋」レイヤーを削除するには、マスクから2Dスライス(すなわち、3D_Mask(::,1))を繰りつばることによって、3Dマスクから各フレームを別々に処理します。
- 各フレームについて、「外側」レイヤーのフレームの角から「シード」として 0 ピクセルを選択します。その後、1ピクセルに遭遇するまで、隣接する0を検索します。0 が見つからないまで検索を続けます。接続されている 0 の値をすべて 1 に変換します。これは、入力と出力が[MASK2]=インフィル(MASK1、LOCATIONS、CONNECTIVITY)であり、MASK1が元のマスクであり、MASK2がマスクで塗りつぶされた状態で、Matlab関数「imfill」を使用して行われます( 補足コーディングファイルFillExteriorを参照)。
- 一部の頭蓋骨情報は、除去中に失われます。情報の損失を軽減するには、データの 3 つのディメンションすべてで手順 5.3 を実行し、それらを分離します。
注:今、「外側」と「筋肉」の両方が1のであり、「外部」とみなされます。マスクには、「外側」、「頭蓋骨」、「脳」の3つの異なる層が含まれています。「外側」と「脳」は1、頭蓋骨は0です。 - ~ 演算子を使用してマスクの値を反転します (つまり、MASK2 = ~MASK1)。今「頭蓋骨」は1で、「外側」と「脳」は0です。
- 各マスクで互いに接触している1は「オブジェクト」とみなすことができます。各マスク内のすべてのオブジェクトのインデックスを作成するには、Matlab 関数 "bwconncomp"を使用して、入力と出力が [CC] = bwconncomp(MASK)、MASK は 3D マスク行列、CC は各オブジェクトのインデックス値、オブジェクトの数、行列のサイズを含む構造オブジェクトです。各マスクについて、小さい方のオブジェクトの値を 0 に設定して、最も大きなボクセルを含むオブジェクト以外のすべてのオブジェクトを削除します ( 補足コーディング ファイル RemoveNoiseを参照)。
- 各パスから作成されたマスクを一緒に追加 します (「追加コーディングファイル MergeMasks」を参照)。
- 一貫した解像度に脳をスケーリングします。
- DICOM ヘッダーから、MRI の各フレーム間のステップ サイズを各ピクセルのサイズと比較します。
- これらの値が異なる場合は、各ボクセルのステップ サイズとピクセル サイズの解像度の差を補正するスケール 係数を定義します。たとえば、各フレームが 1 mm 離れていて、ピクセル寸法が 0.33 mm x 0.33 mm の場合、スケール係数は 3 になります。
- マスクの最低解像度の次元がスケール係数で定義された係数によって大きくなるまで、3D マスクに空のボクセルを追加します( 補足コーディングファイルの「ScaleMask」を参照)。
- マスクが新しいスペースを埋めるまで、マスク内の値を直線的に補間します。
- 3D 印刷用の .stl ファイルまたは同様のファイルタイプとして、頭蓋骨をエクスポートします。
3D頭蓋骨モデルにおける頭蓋骨切り出し
- ステップ5.1のMRIファイルを使用して、マカク脳アトラス(例えば、中央スルカス)19に見られる解剖学的ランドマークから頭蓋開頭術の近似位置を手動で特定する。
- 3D マトリックスの個々のスライスを表示します(ステップ 5.3 と同様)。
- 認識可能な解剖学的ランドマークが見つかるまで、3Dマトリックスを手動で前方または後方にスキャンします。
- フレーム番号を z 座標として保存します (つまり、3D_Mask(::,z)
- データ選択ツールを使用して、このフレーム上の単一点の x 座標と y 座標を保存し、Matlab 関数「getpts」を使用して中心に配置する、入力と出力を [x,y] = getpts にします。"getpts" はユーザー インターフェイスを開き、目的のフレームをクリックします ( 補足的なコーディング ファイル LocateCraniotomyを参照)。
- DICOM ヘッダーの情報を使用して、意図した頭蓋間術の半径を mm からボクセルに変換します。
- ステップ6.1で指定した点を中心として、6.2で定義された半径内のすべてのボクセルを、 補足符号化ファイル「頭蓋骨開頭術」を使用してステップ5.8.4からマスク内でゼロに設定し、入力と出力は[頭蓋骨マスク]=クラニオトミー(マスク、x、y、z、 半径、X、Y、Z、解像度)cranitomyMaskは頭蓋間膜を除去した3D行列、マスクは初期3D行列、x、Y、zは頭蓋間術の中心座標、半径は頭蓋間術の半径、X、Y、Zは3D行列のグリッドベクトル、解像度はステップ6.2の コーディングで定義された半径です。
- 複数の頭蓋切除術の場合は、各固有の頭蓋切除術ごとに手順 6.1~6.3 を繰り返します。
- 3D 印刷用の .stl ファイルまたは同様のファイルタイプとして、頭蓋骨をエクスポートします。
7.3D印刷
メモ:物理プロトタイプ用の3Dプリンタには、2種類の3Dプリンタ(資料表)が使用されています。以下の仕様では、特に記載のない限り、すべての3Dプリンタおよび印刷ソフトウェアの設定がデフォルトである必要があります。
- プロトタイプと金型を印刷するには、標準のPLAプリンタ(材料表)を使用し、次のプリンタとソフトウェア設定でGコードを作成します:内部密度>50%(これは、金型には液体を保持する必要があるため特に重要です)、高速ハニカム内部充填パターン、直流外部フィルパターン、プレート温度= 50°C、および押出温度= 230°C。
- 脳と頭蓋骨のより高い忠実度モデルを印刷するためには、工業用グレードのプリンタを使用して、モデル用のアクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)と解から解決可能な支持材料を組み合わせた印刷物を作ります(材料表)。次に、Gコードを作成し、次のプリンタ設定を使用して塗りスタイルスパース - 高密度。その他の設定はすべて、自動的に適切なデフォルト設定に設定されます。
- モデルを支持溶媒(材料表)で~12時間溶解します。
- 適切なプリンター設定を実装した後 、Start を押して、基本層がきれいで均等であることを確認するために、印刷の最初のレイヤーを見ます。
- 金型を3Dプリントした後、よりタイトなシールを保証するために、マニキュア(材料表)で目に見える穴をパッチします。
注:3Dプリントされた脳と頭蓋骨のモデルは、頭蓋骨の開いた底に脳モデルを挿入することによって組み合わせることができます。眼の解剖学を取り除くことは重要な情報を失うことなく脳モデルの配置を容易にすることができる。頭蓋骨の内側に置くと、脳は解剖学的に正しい位置に自然に整列する。
8. アガロースの準備
- 寒天粉末(材料表)とイナゴのビーンガムパウダー(材料表)を1:4の割合で混ぜます。
- 粉末混合物を1xリン酸緩衝溶液(材料表)と組み合わせて、エルレンマイヤーフラスコ中の0.6%濃度溶液にします。
注: 他のラボで使用される濃度は、0.5%~0.6%20, 21の範囲に収まっています。 - マイクロ波を最大電力に設定し、溶液を含むフラスコを電子レンジに2分間置きます。
- 解決策を確認します。溶液が泡立ち始めると、電子レンジとタイマーを停止し、フラスコを取り出し、激しく旋回します。フラスコを電子レンジに戻し、電子レンジとタイマーを再開します。
注:目的は、沸騰中の蒸発のために大幅にボリュームを減らすことなく、溶液を加熱することです。 - 2 分が完了するまで、ステップ 8.4 を繰り返します。
- フラスコを取り出し、フラスコに溶液が設定されないように旋回を維持します。
- フラスコの外側に冷たい水を流し、渦巻きながら溶液を冷却します。フラスコの外側が触れるまで溶液を冷却し、かつ許容可能で安全であり、次の手順で溶液がプラスチックモールドを変形するのを防ぎます。
- 早すぎる硬化を避けるために、金型に溶液を輸送しながらフラスコを旋回します。
9. アガロース成形
注:以下に概説するアガロース成形プロセスは、完全半球と上半半球の金型で同じです
- アガロース溶液を脳の型の1つに注ぎます。フラスコに残った溶液を旋回し続ける。
- 金型内の溶液のレベルを漏れがないか監視します。設定アガロースは、金型内の漏れをシールするので、必要に応じて金型を補充します。
- 金型中の溶液を室温で安定させて、溶液が固まるまで固まる。
メモ:待ち時間は、ソリューションの量やその他の要因によって異なる場合がありますが、2時間は信頼性の高い待ち時間であることがわかりました。 - ヘラを使用して、金型からゲルモデルをそっと取り除きます。金型の表面に潜在的な変形を防ぐために、金型へのヘラ挿入の場所を戦略的に取り入れてください。
- 自然蒸発プロセスと生物学的薬剤への暴露を遅くするには、ゲルモデルを冷蔵庫の密閉容器に入れます。
10. アガロースゲルモデルへの注入
- 注入のためのポンプを準備し、ステレオタックスフレーム(材料のテーブル)上の立体タクシーの腕でそれを修正します。ポンプをセクション9からゲルモデルの表面に垂直な正しい射出軌道と位置に置きます。
- 250 μL のシリンジ (材料表) に DI 水を充填します。スポイトをポンプに取り付けます(材料表)。
注:任意の染料を描画する前に、DI水は完全に注入カニューレ(材料表)を埋める必要があります。このようにして、色素がカニューレを介して描画されるとき、注入量に影響を与える可能性のあるプランジャーによる空気の圧縮または膨張はありません。 - ポンプドライバ(材料表)を使用して、注入用のターゲットボリュームに対する注射器に食品着色料(材料表)を引き出します。小さなビーズがカニューレの先端に形成されるまでゆっくりと食品着色を注入し、気泡がゲルに注入されるのを防ぎます。カニューレの先端からビーズを乾かします。
- カニューレの下にゲルモデルを配置します。先端がゲルモデルの表面に触れるまでカニューレを下げます。ステレオタキシックアームの測定値に注意してください。
- カニューレをゲルモデルに素早くスムーズに下げて、ターゲットの注入深度に下げ、カニューレの周りにゲルの表面が密封されていることを確認します。
- ポンプを実行し、ターゲットのボリュームが注入されるまで、食品着色の広がりを観察します。1 μL/minの流量から始め、毎分1μL/分のステップで5μL/minに増加します。ゲル中の食品着色の広がりは、脳内のウイルスベクターの広がりの近似である。
- ゲルからカニューレを素早く滑らかに取り出します。
- 写真装置(表)を用いて食品着色の広がりを画像撮影し、注入の楕円体容積を計算するために、塞栓症の寸法を物理的に測定する。このアプローチは、ゲルの透明な性質のために可能です。
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Representative Results
術前頭蓋術計画の尺度としてのMRIの操作と分析は、過去2、5、10、16で正常に使用されています。しかし、このプロセスは、脳、頭蓋骨、頭蓋切脳の3Dモデリングの追加によって大幅に強化されました。研究の関心領域を反映した脳の解剖学的に正確な物理モデルを作り出すことができた(図1)。MR画像から抽出した霊長類の頭蓋骨の解剖学的に正確な物理モデルを作成することができた(図2)。
頭蓋骨と脳の2つの物理モデルは、密な干渉適合と組み合わされ、互いに対して2つのモデルの精度を検証し、外挿されたMRI分析データを正当化する(図3A,B)。組み合わせモデルを使用して、印刷前に頭蓋骨に頭蓋骨切り出し術を挿入し、頭蓋骨切り出しの予測解剖学を視覚化することができました(図3)。頭蓋切除術における予測解剖学の精度は、物理モデルとMRI分析による予測頭蓋切除の比較を通じて検証された(図3B)。さらに、例のインターフェースの全ての部分を組み合わせて、頭蓋骨と脳に関する様々なコンポーネントの幾何学を評価することができました(図3C,D)。
頭蓋骨モデルをテストするために、上で概説した方法を用いてMonkey Lの頭蓋骨の物理モデルを抽出し、3Dプリントして移植後手術の計画を立てた。ヘッドポストの足を操作し、移植の位置で頭蓋骨の曲率に取り付けました(図3E)。頭部ポストの術前フィッティングの結果、手術時間は開封から移植まで約2.5時間から1時間(216%速い)に短縮され、術的合併症22のリスクを大幅に低減した。
SolidWorksで脳の3Dモデルを操作することで、MRIから抽出した脳と印刷された脳モデルの両方の解剖学を正確に反映した型を作成することができました(図4A-C)。この金型は、脳のアガロース混合モデルをキャストするために使用された(図4D,E)。これらの脳の型を用いて、脳の異なる領域に注入し、黄色の染料(材料表)でモデル化された注入手順の注入量を推定することができた。脳の半半球ゲルモデルは、モデルウイルス注入における色素の広がりの明確なビューをキャプチャするためにうまく使用され、注入された染料のおおよその量を時間の経過とともに測定することができました(図5A)。脳モデルへの色素の注入は、ウイルスベクター注射手術をモデル化するために3Dプリントされた頭蓋骨と組み合わされた(図5B,C)。これは、手術7,10に備えて移植を導くために注射の上に電気電解術アレイ配置と組み合わせた。
図1:抽出された脳のモデル。
()メソッドセクションで概説されているように、モンキーHの脳のT1-QuickMPRAGEコロナスライスの層シリーズ(B)BETプラグインとマンゴーソフトウェアを使用してモンキーHの抽出された脳のMRスライスの層シリーズ。(C) マンゴーの表面建物機能を使用して作成されたモンキー H の灰色の物質のモデルの軸、矢状、および歪んだビュー。(D) Dremel 3D45 押し出しプリンタを使用して作成されたMonkey Hのグレーの問題の3Dプリントモデルの軸、矢状、および歪んだビュー。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:頭蓋骨抽出。
(A)単純な閾値MRスライス後の、モンキーH.(B)バイナリマスクの層状の一連のT1-QuickMPRAGEコロナスライスの階層シリーズ。(C)「筋膜層」を除去した後のバイナリマスクの層状のシリーズ。(D) メソッドセクションで概説されているように、処理後の頭蓋骨の二項マスクの層状のシリーズ。(E)バイナリマスクから生成された3Dモデル。(F)3D モデルで、模擬頭蓋間膜を除去した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3Dプリントプロトタイプを用いた手術準備
(A) 方法セクションで概説されているようにモンキーLのMRIから抽出された3Dプリントされた頭蓋骨の中にマンゴーと抽出された3Dプリント脳の組合せ。(B) モンキーLにおける3DモデルとMR計画との頭蓋切り出しの比較 (C,D) 室内用の準備用にツールボックスを使用した例 (C) およびアレイ (D) 移植15.(E)手術前に頭部を前に曲げるために使用されるモンキーLの頭蓋骨の3Dプリントモデル。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゲル脳モデリング。
(A, B)モンキー H. (C) AとBからの 3D プリント金型の 3D モデル A. 写真左は右半球の上部を作成するために使用される金型です。写真右は右半球(D)の上半球(左)と右半球全体(右)のアガロースモデルを作成する金型です。(E)右半球のアガロースモデルは、モンキーLから抽出された頭蓋骨の3Dプリントの中に置かれ、脳と頭蓋切除術の正確な表現を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:射出モデリング。
(A)注射手順のタイムラプス画像。左上のパネルの挿入前。右上のパネルの挿入後。下の4つのパネルは、時間の経過とともに染料の広がりを示しています。(B)3Dプリントされた頭蓋骨内に位置する脳の一部のゲルモデルは、皮質構造および電極配置に関連して食品着色の注射が観察される可能性があるというように、頭蓋骨切除術を有する。(C)チャンバーの3Dプリントは、頭蓋骨にフィットし、電極アレイ、ゲルモデル、および注入に関連して観察される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、MRスキャンから抽出された頭蓋骨と脳解剖学の物理モデルとCADモデルを使用したNHPの神経外科の準備のためのツールボックスについて説明します。
抽出され、3Dプリントされた頭蓋骨と脳モデルは、頭蓋切除手術と頭部ポスト移植の準備のために特別に設計されましたが、方法論は他のいくつかのアプリケーションに適しています。前に説明したように、頭蓋骨の物理的なモデルは、手術前に頭部ポストの前折り曲げを可能にし、頭蓋骨に適しています。さらに、MRIから抽出された頭蓋骨は、頭蓋骨解剖学に対してより高い忠実度を持つ3D設計のヘッドポストを生成するために使用することができる。CTイメージングは伝統的に頭蓋骨抽出のためのより良いモダリティであるが、提案された方法では、脳と頭蓋骨の解剖学は同じイメージングモダリティから来ており、骨と軟部組織モデルの間の解剖学的一貫性の強化に寄与する可能性がある。この解剖学的一貫性は、精度を高め、頭蓋骨切開術が関心のある皮質領域をカバーし、刺激や記録室などのすべての埋め込みコンポーネントが頭蓋骨の湾曲に適合することを保証することができます。これは、MRI抽出された頭蓋骨の地形を他のスキャンタイプ23,24からの抽出と定量的に比較した現存研究によって支持されている。この分野の他の研究では、ヘッドポスト注入25、26のためのモデルと3Dプリントプロトタイプの作成方法を概説していますが、ヘッドポスティングと頭蓋骨外術の両方の準備のための適応可能なモデルを作成するためにMRスキャンのみを使用していません。ここで使用されるMRI取得パラメータは、プロトコルで概説されているように、頭蓋骨抽出の成功に不可欠であることに注意することが重要です。脳抽出と頭蓋骨ストリッピングの分野での以前の研究は、このプロトコル27で使用される広く利用可能なBET脳抽出に代わるものを提供しています。同様に、スカル抽出カスタムスクリプトが存在するが、完全に自動化されたプロトコル28と比較して、非頭蓋骨ボクセルの手動除去が必要である。ここでは、いくつかの例を示していますが、これらのツールは、NHP2、4、5、7、10、15、18、29、30、ならびに他の動物モデル31、32の電極およびチャンバーの移植のような様々な他の手術に適用可能です。
アガロース混合物脳モデルと組み合わせると、手術用調製ツールボックスは、光遺伝学および化学遺伝学2、4、5、10、33、34などの流体注射を含む外科的処置の準備のために適用することができる。ここではPLAを使用して金型を3Dプリントすることに成功しましたが、成形プロセスをより効率的にするガラス転移温度が高いABSフィラメントを使用することで、このプロセスをさらに改善することができます。以前の研究は、流体注入20、21に関連する脳の機械的特性の一部を模倣することができる人工材料としてアガロースゲルを提案している。しかし、以前の研究は、手術用調製ツールを提供するために脳現実的な金型とアガロースを組み合わせていません。成形アガロース混合物ゲル脳は、注射部位に定性的皮質コンテキストを与え、流体拡散の体積と位置を可視化するために使用することができる。ゲルの脳はまた、立体的フレーム内の射出動作と位置を練習するために使用することができます。これは光遺伝学だけでなく、脳への注射を必要とする他の実験に翻訳することができます2,4,34.このモデルは、射出速度とカニューレの厚さを最適化することで、現在のCED標準練習を強化するためにも使用できます。このモデルはまた、脳内の拡散および対流流を正確に表すアガロースゲル混合物の定量的検証によって強化することができる5,10.今後の取り組みでは、射出計画に関する重要な情報を提供できるイメージング手順に対比強化されたイメージングを含めることで、血管構造情報を3Dモデルに組み込むことも可能です。
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Disclosures
著者らは、現時点で開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、エウニス・ケネディ・シバー国立小児保健人間研究所が受賞番号K12HD073945、ワシントン国立霊長類研究センター(WaNPCR、P51 OD010425)、神経工学センター(CNT、グラントEEC-102872)の下で国立科学財団工学研究センター(CNT)によって支援されました。このプロジェクトのためのマックニクとマルティネス・コンデの研究室への資金は、BRAINイニシアチブNSF-NCS賞1734887、NSFアワード1523614&1829474、SUNYエンパイア・イノベーター奨学金から各教授に資金を提供しました。私たちは、アガロースの準備に彼の助けをしてくれたカラム・カティーブに感謝し、トニJ Huanは技術的な助けを求めました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printing Software (GrabCAD Print) | Stratasys | Version 1.36 | Used for High quality 3D printing |
| 3D Printing Software (Simplify 3D) | Simplify3D | Version 4.1 | Used for PLA 3D printing |
| Agarose | Benchmark Scientific | A1700 | Used for making gel brains |
| Black Nail Polish | L.A. Colors | CNP637 | Used for gel molding |
| Cannula (ID 450 um, OD 666 um) | Polymicro Technologies | 1068150625 | Used to inject dye into gel brain |
| Catheter Connector | B Braun | PCC2000 | Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50 |
| Dremel 3D Digilab 3D45 printer | Dremel | F0133D45AA | Used for prototyping in PLA |
| ECOWORKS | Stratasys | 300-00104 | Used to dissolve QSR support structures |
| Erlymeyer flask | Pyrex | 4980 | Used for gel molding |
| Ethyl cyanoacrylate | The Original Super Glue Corp. | 15187 | Used to make combined cannula |
| Graduated cylinder | 3023 | Used for gel molding | |
| HATCHBOX PLA 3D Printer Filament | HATCHBOX | 3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK | 1kg Spool, 1.75mm, Red/Black |
| Locust Bean Gum | Modernist Pantry | 1018 | Gumming agent for gel brain mixtures |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Used for skull extraction |
| McCormick Yellow Food Color | McCormick | Used for dye injection | |
| Microwave | Panasonic | NN-SD975S | Used for agarose curing |
| MR Imaging Software (3D Slicer) | 3D Slicer | Version 4.10.2 | Used for 3D model generation |
| MR Imaging Software (Mango with BET plugin) | Reasearch Imaging Institute | Version 4.1 | Used for brain extraction |
| Philips Acheiva MRI System | Philips | 4522 991 19391 | Used to image non-human primates |
| Phosphate Buffered Solution | Gibco | 70011-044 | 10X diluted with DI water to 1X |
| Pump | WPI | UMP3T-1 | Used for dye injection |
| Pump driver | WPI | UMP3T-1 | Used for dye injection |
| Refrigerator | General Electric | Used to preserve agarose gel | |
| Scientific Spatula | VWR | 82027-494 | Used to extract gel molds |
| SolidWorks | Dassault Systemes | 2019 | |
| Stratasys ABS-M30 filament | Stratasys | 333-60304 | Used for high quality 3D printing |
| Stratasys F170 3D printer | Stratasys | 123-10000 | Used for high quality 3D printing |
| Stratasys QSR support | Stratasys | 333-63500 | Used to create supports with ABS model |
| Syringe | SGE | SGE250TLL | Used for dye injection |
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