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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Una caja de herramientas basada en RMN para la planificación neuroquirúrgica en primates no humanos

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61098
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2, 4, 5, 4, 4, 1,2,3
1Bioengineering Department, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, University of Washington, 3Electrical and Computer Engineering Department, University of Washington, 4Department of Ophthalmology, SUNY Downstate Health Sciences University, 5Radiology Department, University of Washington

Summary

El método descrito a continuación tiene como objetivo proporcionar un protocolo completo para la preparación de neurocirugía de primates no humanos (NHP) utilizando una novedosa combinación de métodos de impresión tridimensionales (3D) y extracción de datos por resonancia magnética.

Abstract

En este documento, delineamos un método para la preparación quirúrgica que permite la planificación práctica de una variedad de neurocirugías en los PNA utilizando únicamente datos extraídos de imágenes por resonancia magnética (RM). Este protocolo permite la generación de modelos físicos anatómicamente precisos impresos en 3D del cerebro y el cráneo, así como un modelo de gel de agarosa del cerebro modelando algunas de las propiedades mecánicas del cerebro. Estos modelos se pueden extraer de la RMN utilizando software de extracción cerebral para el modelo del cerebro, y código personalizado para el modelo del cráneo. El protocolo de preparación aprovecha la tecnología de impresión 3D de última generación para hacer que los cerebros, cráneos y moldes que interconectan para modelos de cerebro de gel. Los modelos de cráneo y cerebro se pueden utilizar para visualizar el tejido cerebral dentro del cráneo con la adición de una craneotomía en el código personalizado, lo que permite una mejor preparación para las cirugías que involucran directamente el cerebro. Las aplicaciones de estos métodos están diseñadas para cirugías involucradas en la estimulación neurológica y el registro, así como la inyección, pero la versatilidad del sistema permite la futura expansión del protocolo, técnicas de extracción y modelos a un alcance más amplio de cirugías.

Introduction

La investigación de primates ha sido un paso fundamental en la progresión de la investigación médica de modelos animales a ensayos en humanos1,2. Esto es especialmente así en el estudio de la neurociencia y la ingeniería neuronal, ya que hay una gran discrepancia fisiológica y anatómica entre los cerebros de roedores y los de los primates no humanos (NHP)1,2,3. Con tecnologías genéticas emergentes como la quimiogenética, la optogenética y las imágenes de calcio que requieren la modificación genética de las neuronas, la investigación de ingeniería neuronal que estudia la función neuronal en los NHP ha ganado especial atención como modelo preclínico para entender la función cerebral2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. En la mayoría de los experimentos de neurociencia nhP, se requieren medidas neuroquirúrgicas para la implantación de diversos dispositivos tales como postes de cabeza, cámaras de estimulación y grabación, matrices de electrodos y ventanas ópticas4,5,6,7,10,11,13,14,15,17,18.

Los laboratorios actuales de NHP utilizan una variedad de métodos que a menudo incluyen prácticas ineficaces, incluyendo sedar al animal para que se ajuste a las piernas de un poste de la cabeza y aproximar la curvatura del cráneo alrededor del sitio de craneotomía. Otros laboratorios ajustan el poste de la cabeza al cráneo en la cirugía o emplean métodos más avanzados para obtener las mediciones necesarias para la implantación como el análisis de un atlas cerebral NHP y resonancia magnética (MR) para tratar de estimar las curvaturas del cráneo2,10,11,16. Las neurocirugías en los PNA también implican inyecciones de fluidos, y los laboratorios a menudo no tienen manera de visualizar la ubicación de inyección proyectada dentro del cerebro2,4,5,13,14 que dependen únicamente de las mediciones estereotaxicas y la comparación con las exploraciones por RMN. Estos métodos tienen un grado de incertidumbre inevitable al no poder probar la compatibilidad física de todos los componentes complejos del implante.

Por lo tanto, hay una necesidad de un método no invasivo preciso para la planificación neuroquirúrgica en los PNA. Aquí, presentamos un protocolo y metodología para la preparación de cirugías de implantación e inyección en estos animales. Todo el proceso proviene de las resonancias magnéticas, donde el cerebro y el cráneo se extraen de los datos para crear modelos tridimensionales (3D) que luego se pueden imprimir en 3D. Los modelos de cráneo y cerebro se pueden combinar para prepararse para cirugías de craneotomía, así como postes de cabeza con un mayor nivel de precisión. El modelo cerebral también se puede utilizar para crear un molde para la fundición de un modelo de gel anatómicamente preciso del cerebro. El cerebro de gel solo y en combinación con un cráneo extraído se puede utilizar para prepararse para una variedad de cirugías de inyección. A continuación describiremos cada uno de los pasos necesarios para la caja de herramientas basada en RMN para la preparación neuroquirúrgica.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington. Se utilizaron dos ésos macacos machos (mono H: 14,9 kg y 7 años, mono L: 14,8 kg y 6 años).

1. Adquisición de imágenes

  1. Transporte el mono a un escáner de RMN 3T y coloque al animal en un marco estereotaxico compatible con RMN (Tabla de materiales).
  2. Registre el T1 estándar (ángulo de volteo a 8o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 7,5/3,69 s, tamaño de la matriz a 432 x 432 x 80, duración de adquisición a 103,7 s, Multicoil(Tabla de materiales),número de promedios a 1, grosor de la rebanada a 1 mm) imágenes de RM anatómicas.
    NOTA: Para un aislamiento exitoso del cráneo, utilice los parámetros de adquisición de RMN aplicados aquí para maximizar la separación entre el cráneo y el cerebro.

2. Extracción cerebral

  1. En el software de imágenes MR para extracción cerebral, seleccione Abrir | Abrir imagen. Cargue el escaneo T1 Quick Magnetization Prepared Rapid Gradient Echo (MPRAGE) adquirido en el paso 1.2 en un software de imágenes MR (Table of Materials).
  2. Para extraer el cerebro, en el menú desplegable Plugins seleccione Extraer cerebro (BET). Extraiga en un umbral de intensidad alrededor de 0,5 x 0,7 y establezca el valor de gradiente de umbral en 0. Utilice repetidamente la función de extracción en umbrales de intensidad sucesivamente inferiores hasta que el análisis contenga solo la anatomía cortical (Figura 1B).
    NOTA: Este es un proceso iterativo porque el software no está diseñado para cerebros NHP y la extracción no es precisa
  3. En el menú Región de interés (ROI), seleccione Umbral a ROI y seleccione la opción para Shrink Wrap y 3D para crear un mapa de bits del cerebro. Esto convertirá el volumen en bits binarios a partir de un degradado, lo que simplifica los procesos de generación de modelos futuros. Elija un umbral (generalmente alrededor de 600) para aislar el cerebro del tejido circundante. Este umbral se puede encontrar pasando el ratón sobre la materia gris. Seleccione Aceptar para formar el mapa de bits.
  4. Para crear una superficie, seleccione Crear superficie en el menú de imagen e introduzca el umbral utilizado para extraer el cerebro en el paso 2.3. A continuación, seleccione Aceptar. La superficie resultante se puede utilizar como referencia para ajustar el valor umbral para producir la representación de mayor calidad de la anatomía objetivo (Figura 1C).
  5. En la pestaña de archivo, seleccione Guardar o Guardar comoy guarde el ROI cerebral extraído como un archivo .nii o .nii.gz para su uso en la creación del modelo del cerebro.

3. Modelado cerebral

  1. Seleccione Cargar datos | Elija Archivos para agregar y cargar el cerebro extraído guardado en el tipo de archivo .nii o .nii.gz en el software de procesamientode imágenes médicas( Tabla de materiales ).
  2. Pase el cursor sobre el menú desplegable Welcome to slicer en la barra de herramientas de módulos y desplácese a todos los módulos. En ese menú, seleccione la funcionalidad Editor. Haga clic en Aceptar en la advertencia emergente.
  3. En el menú del módulo Editor, seleccione Efecto umbral y ajuste los controles deslizantes de rango de umbral para que la parte del mapa de bits que contiene el cerebro se resalte en los tres sectores. Al cargar un mapa de bits, ajustar ambos controles deslizantes a un valor de 1 selecciona todo el cerebro. Seleccione Aplicar.
  4. Abra el módulo del fabricante del modelo y, en el menú desplegable de volúmenes de entrada, seleccione el archivo de mapa de bits generado en el paso 3.3. En Modelos, seleccione Crear nueva jerarquía de modelos. Después de asignar el nombre del modelo a la jerarquía, seleccione Aplicar para crear el volumen.
  5. Guarde el archivo en el formato .stl.
  6. Para modificar aún más el modelo cerebral, cargue el archivo .stl como un cuerpo de gráficos en un software de diseño asistido por ordenador (Tabla de materiales)
    NOTA: Esto puede tomar un tiempo, ya que las superficies cerebrales de malla importadas son a menudo bastante complejas.
  7. Una vez importado el archivo, en el árbol de entidades del lado izquierdo de la pantalla, haga clic en los elementos secundarios del cuerpo gráfico y suprima las entidades gráficas innecesarias hasta que solo queden en el archivo las entidades que contienen el cerebro. Guarde el archivo restante como un archivo .prt para su posterior manipulación y como un archivo .stl para la impresión 3D. Guarde el archivo restante como un archivo .prt para su posterior manipulación y como un archivo .stl para la impresión 3D.

4. Moldeo cerebral

  1. Cargue el modelo cerebral extraído de la sección 3 al software de diseño asistido por ordenador abriendo el archivo .prt. En la sección de operaciones del menú insertar, seleccione Convertir en sólido de malla. Seleccione el cuerpo gráfico del cerebro y conviértalo.
  2. Crear un molde derecho e izquierdo del cerebro completo
    1. Haga clic en el botón Croquis y seleccione el plano superior como plano de croquis. Dibuja un rectángulo que contenga la totalidad del hemisferio derecho o izquierdo del cerebro. Seleccione la operación de extrusión de saliente/base mientras está en el croquis y extruya un rectángulo cúbico para que contenga la parte superior del cerebro.
      NOTA: El cubo puede tener que ser extruido en dos direcciones para contener todo el hemisferio. Esto se debe a que el punto cero, donde se encuentra el plano de extrusión, puede caer dentro del modelo cerebral. La extrusión en ambas direcciones garantiza que el molde abarcará todo el volumen de interés.
    2. En la sección de operaciones del menú 'insertar', seleccione Convertir en sólido de malla. Seleccione el cubo extruido en la carpeta Sólidos y conviértalo. Para crear el espacio negativo, reste el modelo del cerebro del cubo recién extruido utilizando la función Combinar y seleccionando la opción de restar.
    3. Repita los pasos 4.2.1 y 4.2.2 para el otro hemisferio del cerebro (izquierda o derecha) y guarde los archivos resultantes como un .stl para la impresión 3D y un .prt para una manipulación adicional.
  3. Creando un molde derecho e izquierdo de la mitad superior del cerebro.
    1. Crea un boceto en el plano superior y dibuja un rectángulo que contenga la totalidad del hemisferio derecho o izquierdo del cerebro. Seleccione la operación de extrusión de saliente/base mientras está en el croquis y extruya con la operación Desfase desde plano seleccionada. Desplaza la extrusión hasta una distancia donde no hay contornos colgantes en la anatomía cerebral, capturando solo la anatomía superior. En la sección de operaciones del menú 'insertar', seleccione Convertir en sólido de malla. Seleccione el cubo extruido en la carpeta Sólidos y conviértalo.
    2. Para crear el espacio negativo, reste el modelo del cerebro del cubo recién extruido utilizando la función Combinar y seleccionando la opción de restar.
    3. Cree un plano de croquis en el lado dorsal del molde y seleccione Convertir entidades y, a continuación, seleccione el croquis en el paso 4.3.1.
    4. Seleccione la operación de extrusión de saliente/base mientras está en el croquis y, con la opción de extrusión ciega seleccionada, extruya el cuerpo sólido aproximadamente 5 mm para encerrar completamente la anatomía cerebral restada en el molde.
    5. Repita los pasos 4.3.1 a 4.3.4 para el otro hemisferio del cerebro (izquierda o derecha) y guarde los archivos resultantes como un .stl para la impresión 3D y un .prt para una manipulación adicional.
  4. Al cambiar las dimensiones y la ubicación del cubo y seguir el mismo protocolo (pasos 4.1 y 4.2), cree moldes que contengan diferentes partes del cerebro.
  5. Para la impresión 3D, utilice una densidad de relleno del 70 % y aumente el espesor de la carcasa exterior de la impresión para minimizar las fugas del material de moldeo. Si hay huecos o defectos en la impresión, llénelos con esmalte de uñas u otro agente de encuadernación.

5. Modelado de cráneos

  1. Importe el MRI QUICK MPRAGE del paso 1.2 al software de manipulación de matriz como un archivo DICOM. El archivo DICOM puede estar en marcos 2D independientes. Si este es el caso, combine todos los fotogramas en una matriz 3D. Asegúrese de que cada fotograma 2D de la matriz muestra un corte coronal.
  2. Cree una máscara binaria mediante el umbral de la matriz 3D utilizando un operador mayor que para los valores de píxel individuales. Ajuste el umbral de tal manera que la máscara capture la anatomía del cráneo (consulte Archivo de codificación suplementario CalibrateMask).
    NOTA: La máscara contendrá cuatro capas distintas. Desde el exterior hacia adentro, se les denominará "fuera", "musculatura", "cráneo" y "cerebro". En esta etapa, "fuera" y "cráneo" son 0 en la máscara, y "musculatura" y "cerebro" son 1.
  3. Para eliminar la capa de "musculatura", procese cada fotograma de la máscara 3D por separado agarrando iterativamente un corte 2D de la máscara (es decir, 3D_Mask(:,:,1)).
    1. Para cada fotograma, seleccione 0 píxeles de las esquinas del marco en la capa "outside" como "semilla". A continuación, busque en los 0 vecinos hasta que encuentre 1 píxel. Continúe buscando hasta que no se encuentren más 0. Convierte todos los 0 conectados a 1. Esto se hace utilizando la función Matlab "imfill", con las entradas y salidas siendo [MASK2] - imfill(MASK1,LOCATIONS,CONNECTIVITY), donde MASK1 es su máscara original, y MASK2 es la máscara rellena (consulte Archivo de codificación suplementario FillExterior).
  4. Parte de la información del cráneo se perderá durante la extracción. Para mitigar la pérdida de información, realice el paso 5.3 en las tres dimensiones de los datos y manténgalos separados.
    NOTA: Ahora tanto "fuera" como "musculatura" son 1, y se considerará como "fuera". La máscara ahora contiene tres capas distintas, "fuera", "cráneo" y "cerebro". "Fuera" y "cerebro" son 1, y "cráneo" es 0.
  5. Invierta los valores de la máscara utilizando el operador de la palabra (es decir, MASK2 - .MASK1). Ahora "cráneo" es 1 y "fuera" y "cerebro" son 0.
  6. Los 1 que se tocan entre sí en cada máscara se pueden considerar "objetos". Cree un índice de todos los objetos de cada máscara utilizando la función Matlab "bwconncomp", con las entradas y salidas [CC] á bwconncomp(MASK), donde MASK es la matriz de máscara 3D, y CC es un objeto estructural que contiene los valores de índice de para cada objeto, el número de objetos y el tamaño de la matriz. Para cada máscara, elimine todos los objetos excepto el más grande que contenga más vóxeles estableciendo los valores de los objetos más pequeños en 0's (consulte Archivo de codificación suplementario RemoveNoise).
  7. Agregue las máscaras creadas a partir de cada pasada juntas (consulte Archivo de codificación suplementario MergeMasks).
  8. Escale el cerebro a una resolución consistente.
    1. En el encabezado DICOM, compare el tamaño del paso entre cada fotograma de la RMN con las dimensiones de cada píxel.
    2. Si estos valores son diferentes, defina un factor de escala para compensar la diferencia de resolución entre el tamaño del paso y el tamaño de píxel para cada vóxel. Por ejemplo, si cada fotograma está separado de 1 mm y la dimensión de píxel es de 0,33 mm x 0,33 mm, el factor de escala será 3.
    3. Agregue vóxeles vacíos adicionales a la máscara 3D hasta que la dimensión de resolución más baja de la máscara sea mayor por un factor definido por el factor de escala (consulte Archivo de codificación suplementario "ScaleMask").
    4. Interpolar linealmente valores en la máscara hasta que la máscara llene el nuevo espacio.
    5. Exporte el cráneo como un archivo .stl o un tipo de archivo similar para la impresión 3D.

6. Creación de craneotomía en el modelo de cráneo 3D

  1. Utilizando el archivo de RMN del paso 5.1, identifique manualmente la ubicación aproximada de la craneotomía a partir de puntos de referencia anatómicos que se encuentran en el atlas cerebral macaco (por ejemplo, sulcus central)19.
    1. Ver un sector individual de la matriz 3D (Similar al paso 5.3).
    2. Escanee manualmente hacia adelante o hacia atrás a través de la matriz 3D hasta que se encuentren puntos de referencia anatómicos reconocibles.
    3. Guarde el número de fotograma como la coordenada z (es decir, 3D_Mask(:,:,z)
    4. Utilice una herramienta de selección de datos para guardar las coordenadas x e y de un único punto en este marco para que la craneotomía se centre en el uso de la función Matlab "getpts", con las entradas y salidas siendo [x,y] - getpts. "getpts" abre una interfaz de usuario, haga clic en el marco deseado (consulte Archivo de codificación suplementario LocateCraniotomy).
  2. Convierta el radio de la craneotomía prevista de mm a voxels utilizando la información del encabezado DICOM.
  3. Usando el punto especificado en el paso 6.1 como punto central, establezca todos los vóxeles dentro del radio definido en 6.2 a cero en la máscara desde el paso 5.8.4 usando el archivo de codificación suplementario Craniotomía, donde las entradas y salidas son [craniotomyMask] - Craniotomy(mask, x, y, z, radius, X, Y, Z, resolución)donde cranitomyMask es una matriz 3D con una craniotomía eliminada, la máscara es la matriz 3D inicial, x,y,z son las coordenadas de punto central de la craneotomía, el radio es el radio de la craneotomía, X,Y,Z son vectores de cuadrícula de la matriz 3D, y la resolución es su radio definido en el paso 6.2 (ver archivo de codificación adicional Craniotomía).
  4. Para múltiples craneotomías, repita los pasos 6.1 a 6.3 para cada craneotomía única.
  5. Exporte el cráneo como un archivo .stl o un tipo de archivo similar para la impresión 3D.

Impresión 7.3D

NOTA: Se utilizan dos tipos de impresoras 3D para prototipos físicos(Tabla de materiales). Para las siguientes especificaciones, todos los ajustes de impresora 3D y software de impresión deben ser predeterminados a menos que se mencione lo contrario.

  1. Para imprimir los prototipos y moldes, utilice una impresora PLA estándar(Tabla de materiales)y cree el Código G con los siguientes ajustes de impresora y software: densidad interna >50% (esto es especialmente importante para los moldes, ya que deben contener líquido), patrón de llenado interno de panal rápido, patrón de llenado externo rectilineal, temperatura de la placa a 50 oC y temperatura del extrusor a 230 oC.
  2. Con el fin de imprimir modelos de mayor fidelidad del cerebro y el cráneo utilizar una impresora de grado industrial para hacer una impresión combinada de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) para el modelo y un material de soporte disuelto (Tabla de materiales). A continuación, cree el código G y con los siguientes ajustes de impresora: estilo de relleno Disperso - Alta densidad. Todos los demás ajustes se establecerán automáticamente en la configuración predeterminada adecuada.
    1. Disolver el modelo en disolvente de soporte (Tabla de materiales) durante 12 h.
  3. Después de implementar la configuración de impresora adecuada, pulse Iniciar y observe la primera capa de la impresión para asegurarse de que la capa base esté limpia y uniforme.
  4. Después de imprimir en 3D los moldes, parchee los orificios visibles con esmalte de uñas (Tabla de materiales) para garantizar un sello más apretado.
    NOTA: Los modelos de cerebro y cráneo impresos en 3D se pueden combinar insertando el modelo cerebral en la parte inferior abierta del cráneo. Extirpar la anatomía ocular puede facilitar la colocación del modelo cerebral sin perder información importante. Cuando se coloca dentro del cráneo, el cerebro se alinea naturalmente con la posición anatómicamente correcta.

8. Preparación de la agarosa

  1. Mezclar el polvodeagar ( Tabla de Materiales ) y la goma de la langosta en polvo (Tabla de Materiales) en una proporción de 1:4 por masa.
  2. Combine la mezcla de polvo con 1x solución tamponada de fosfato(Tabla de materiales)a una solución de concentración del 0,6% en un matraz Erlenmeyer.
    NOTA: Las concentraciones utilizadas por otros laboratorios caen en un rango de 0.5%-0.6%20,21.
  3. Ajuste el microondas a máxima potencia y coloque el matraz que contiene la solución en el microondas durante 2 minutos.
  4. Observe la solución. Cuando la solución comience a burbujear, detenga el microondas y el temporizador, retire el matraz y gire vigorosamente. Vuelva a poner el matraz en el microondas y reanude el microondas y el temporizador.
    NOTA: El propósito es calentar la solución sin reducir el volumen significativamente debido a la evaporación durante la ebullición.
  5. Repita el paso 8.4 hasta que se completen los dos minutos.
  6. Retire el matraz y mantenga el remolino para evitar que la solución se ajuste en el matraz.
  7. Ejecute agua fría en el exterior del matraz para enfriar la solución mientras se arremolina. Enfríe la solución hasta que el exterior del matraz esté caliente al tacto, pero tolerable y seguro, para evitar que la solución deforme el molde de plástico en los siguientes pasos.
  8. Gire el matraz mientras transporta la solución al molde para evitar el endurecimiento prematuro.

9. Moldeo de agarosa

NOTA: El proceso de moldeo de agarosa que se describe a continuación es el mismo para los moldes del hemisferio completo y del medio hemisferio superior

  1. Vierta la solución de agarosa en uno de los moldes cerebrales hasta que esté lleno. Continúe girando la solución restante en el matraz.
  2. Supervise el nivel de solución en el molde en busca de fugas. Rellene el molde según sea necesario, ya que la agarosa de ajuste sellará cualquier fuga en el molde.
  3. Deje que la solución en el molde se siente sin perforar a temperatura ambiente hasta que la solución se haya ajustado y endurecido en un sólido.
    NOTA: Mientras que los tiempos de espera pueden variar dependiendo del volumen de la solución y otros factores, 2 h se encuentra para ser un tiempo de espera confiable.
  4. Utilice una espátula para retirar suavemente el modelo de gel del molde. Ser estratégico con la ubicación de la inserción de la espátula en el molde con el fin de evitar posibles deformaciones a la superficie del molde.
  5. Para ralentizar el proceso de evaporación natural y la exposición a agentes biológicos, coloque el modelo de gel en un recipiente sellado en un refrigerador.

10. Inyección en el modelo de gel de agarosa

  1. Prepare la bomba para perfusión y fíjela en un brazo estereotaxico en un marco estereotaxico(Tabla de materiales). Coloque la bomba en la trayectoria de inyección correcta y en la ubicación normal a la superficie del modelo de gel desde la sección 9.
  2. Llene una jeringa de 250 l(Tabla de materiales)con agua DI. Monte la jeringa en la bomba(Tabla de materiales).
    NOTA: Antes de dibujar cualquier tinte, el agua DI debe llenar completamente la cánula de inyección(Tabla de materiales). De esta manera, cuando el tinte se dibuja a través de la cánula no hay compresión o expansión de aire por el émbolo que pueda afectar el volumen de inyección.
  3. Utilice el controlador de la bomba (Tabla de materiales) para retirar la coloración de los alimentos ( Tabla demateriales) en la jeringa hasta el volumen de inyección objetivo. Inyecte el colorante de los alimentos lentamente hasta que se forme un pequeño cordón en la punta de la cánula para evitar que se inyecten burbujas de aire en el gel. Seque el cordón de la punta de la cánula.
  4. Coloque el modelo de gel debajo de la cánula. Baje la cánula hasta que la punta toque la superficie del modelo de gel. Observe las medidas en el brazo estereotaxico.
  5. Baje la cánula en el modelo de gel de forma rápida y suave a la profundidad de inyección objetivo y asegúrese de que la superficie del gel se haya sellado alrededor de la cánula.
  6. Ejecute la bomba y observe la propagación del colorante de los alimentos hasta que se inyecte el volumen objetivo. Comience con un caudal de 1 l/min y aumente a 5 l/min con pasos de 1 l/min cada minuto. La propagación de la coloración de los alimentos en el gel es una aproximación de la propagación de un vector viral en el cerebro.
  7. Retire la cánula del gel de forma rápida y suave.
  8. Capturar imágenes de la propagación de la coloración de los alimentos con un dispositivo fotográfico (Tabla de materiales) y medir físicamente las dimensiones de la embolia con el fin de calcular el volumen elipsoide de la inyección. Este enfoque es posible debido a la naturaleza transparente del gel.

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Representative Results

La manipulación y el análisis de las resonancias magnéticas como medida de planificación de la craneotomía preoperatoria se ha utilizado con éxito en los últimos2,5,10,16. Este proceso, sin embargo, se ha mejorado en gran medida por la adición del modelado 3D del cerebro, cráneo y craneotomía. Pudimos crear con éxito un modelo físico anatómicamente preciso del cerebro que reflejaba el área de interés para nuestros estudios (Figura 1). Del mismo modo pudimos crear un modelo físico anatómicamente preciso del cráneo de primate extraído de las imágenes de RM (Figura 2).

Los dos modelos físicos del cráneo y el cerebro combinados con un ajuste de interferencia apretado, validando la precisión de los dos modelos en relación entre sí y legitimando los datos de análisis de RMN extrapolados (Figura 3A,B). Con el modelo combinado pudimos insertar una craneotomía en el cráneo antes de imprimir y visualizar la anatomía pronosticada en la craneotomía (Figura 3). La precisión de la anatomía pronosticada en la craneotomía se validó mediante una comparación del modelo físico y la craneotomía pronosticada a partir del análisis de RMN (Figura 3B). Además, pudimos combinar todas las partes de nuestra interfaz de ejemplo y evaluar la geometría de los diversos componentes en relación con el cráneo y el cerebro (Figura 3C,D).

Con el fin de probar el modelo de cráneo, un modelo físico del cráneo de Mono L fue extraído utilizando los métodos descritos anteriormente y 3D impreso para planificar una cirugía de postimplantación de la cabeza. Los pies del poste de la cabeza fueron manipulados y ajustados a la curvatura del cráneo en la ubicación de la implantación (Figura 3E). Como resultado de la adaptación preoperatoria del puesto de cabeza, el tiempo de cirugía se redujo de aproximadamente 2,5 horas a 1 hora (216% más rápido) desde la apertura hasta la implantación, reduciendo en gran medida el riesgo de complicaciones operativas22.

Al manipular el modelo 3D del cerebro en SolidWorks, pudimos crear un molde que reflejaba con precisión la anatomía tanto del cerebro impreso como del modelo cerebral extraído de la RMN(Figura 4A-C). Este molde se utilizó para lanzar un modelo de mezcla de agarosa del cerebro(Figura 4D,E). Usando estos moldes del cerebro, pudimos inyectar en diferentes áreas del cerebro y estimar el volumen de la infusión de un procedimiento de inyección modelado con un tinte amarillo (Tabla de Materiales). El modelo de gel medio hemisferio del cerebro se utilizó con éxito para capturar una visión clara de la propagación del tinte en una inyección de virus modelo, lo que nos permite medir un volumen aproximado del tinte con el tiempo tal como se inyectó (Figura 5A). La inyección de tinte en el modelo cerebral se combinó con un cráneo impreso en 3D para modelar la cirugía de inyección de vectores virales(Figura 5B,C). Esto se combinó con una colocación de matriz de electrocorticografía en la parte superior de la inyección para guiar la implantación en preparación para la cirugía7,10.

Figure 1
Figura 1: Modelos de cerebro extraído.
(A) Serie en capas de rebanadas coronales T1-QuickMPRAGE del cerebro de Monkey H. (B) Serie en capas de rebanadas de MR del cerebro extraído de Monkey H utilizando el plugin BET y el software Mango como se describe en la sección Métodos. (C) Vista axial, sagital y sesgada de un modelo de la materia gris de Monkey H creado utilizando la funcionalidad de construcción de superficie en Mango. (D) Vista axial, sagital y sesgada de un modelo impreso en 3D de la materia gris de Monkey H creado con una impresora extrusa Dremel 3D45. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Extracción de cráneo.
(A) Serie en capas de rebanadas coronales T1-QuickMPRAGE del cerebro de Monkey H. (B) Serie de máscara binaria en capas después de simples umbrales de rebanadas de MR. (C) Serie en capas de máscara binaria después de eliminar la "capa de musculatura". (D) Serie en capas de máscara binaria del cráneo después del procesamiento como se describe en la sección Métodos. (E) modelo 3D generado a partir de máscara binaria. (F) Modelo 3D con craneotomía simulada eliminado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Preparación quirúrgica utilizando prototipos impresos en 3D.
(A) Combinación del cerebro impreso en 3D extraído con Mango dentro de un cráneo impreso en 3D extraído de la RMN de Monkey L como se describe en la sección Métodos. (B) Comparación de la orientación de craneotomía entre nuestros modelos 3D y la planificación de RM en Monkey L. (C,D) Un ejemplo de uso de nuestra caja de herramientas para preparar la cámara (C) y la matriz (D) implantación15. (E) Modelo impreso en 3D del cráneo de Monkey L utilizado para pre-doblar el poste de la cabeza antes de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Modelado cerebral en gel.
(A, B) Modelo 3D del molde para Monkey H. (C) moldes impresos 3D de A y B. Pictured left es un molde utilizado para crear la parte superior del hemisferio derecho. En la imagen de la derecha es un molde para crear el hemisferio derecho (D) Agarrose modelos de la parte superior del hemisferio derecho (izquierda) y todo el hemisferio derecho (derecha). (E) Modelo de agarosa del hemisferio derecho colocado dentro de una impresión 3D de un cráneo extraído de Monkey L, demostrando la representación exacta del cerebro y la craneotomía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Modelado por inyección.
(A) Imágenes de lapso de tiempo del procedimiento de inyección. Pre-inserción del panel superior izquierdo. Panel superior derecho después de la inserción. Los cuatro paneles inferiores muestran la extensión del tinte con el tiempo. (B) Modelo de gel de una sección del cerebro situada dentro de un cráneo impreso en 3D con craneotomía de tal manera que se puedan observar inyecciones de colorante alimentario en relación con las estructuras corticales y la colocación de electrodos. (C) Impresión 3D de una cámara ajustada al cráneo y observada en relación con la matriz de electrodos, el modelo de gel y la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivos de codificación suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos archivos.

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Discussion

Este artículo describe una caja de herramientas para la preparación de neurocirugías en LOS PCN utilizando modelos físicos y CAD de cráneo y anatomía cerebral extraídos de las exploraciones por RMN.

Mientras que los modelos de cráneo y cerebro extraídos e impresos en 3D fueron diseñados específicamente para la preparación de cirugías de craneotomía y la cabeza postimplantaciones, la metodología se presta a varias otras aplicaciones. Como se describió anteriormente, el modelo físico del cráneo permite pre-doblar el poste de la cabeza antes de la cirugía, lo que crea un buen ajuste con el cráneo. Además, el cráneo extraído de la RMN se puede utilizar para generar un poste de cabeza diseñado en 3D con una mayor fidelidad a la anatomía del cráneo. Mientras que la toma de imágenes por TC es tradicionalmente una mejor modalidad para la extracción del cráneo, en el método propuesto, el cerebro y la anatomía del cráneo provienen de la misma modalidad de imagen, lo que podría contribuir a mejorar la consistencia anatómica entre los modelos de hueso y de tejido blando. Esta consistencia anatómica podría mejorar la precisión y asegurar que la craneotomía cubrirá la región cortical de interés y que todos los componentes implantantes, como las cámaras de estimulación y registro, se ajusten a la curvatura del cráneo. Esto está respaldado por estudios existentes que compararon cuantitativamente la topografía del cráneo extraída por RMN con extracciones de otros tipos de escaneo23,24. Otros trabajos en el campo han esbozado métodos para la creación de modelos y prototipos impresos en 3D para la implantación de la cabeza25,26, pero no utilizan únicamente escaneos MR para crear un modelo adaptable para la preparación tanto para la colocación de la cabeza como para la craneotomía. Es importante tener en cuenta que los parámetros de adquisición de RMN utilizados aquí son críticos para la extracción exitosa del cráneo como se describe en el protocolo. Trabajos previos en el campo de la extracción cerebral y el decapado del cráneo ofrece alternativas a la extracción cerebral BET ampliamente disponible utilizada en este protocolo27. Del mismo modo, existen scripts personalizados de extracción de cráneo, sin embargo, requieren la extracción manual de vóxeles no calaveras en comparación con un protocolo completamente automatizado28. Mientras que aquí mostramos sólo algunos ejemplos, estas herramientas son aplicables a una variedad de otras cirugías tales como implantes de electrodos y cámaras en NHPs2,4,5,7,10,15,18,29,30, así como otros modelos animales31,32.

Cuando se combina con los modelos cerebrales de mezcla de agarosa, la caja de herramientas de preparación quirúrgica se puede aplicar para prepararse para procedimientos quirúrgicos que implican inyecciones de fluidos como optogenética y quimiogenética2,4,5,10,33,34. Aunque aquí tuvimos éxito con el uso de PLA para imprimir en 3D los moldes, este proceso se puede mejorar aún más mediante el uso de un filamento ABS, que tiene una temperatura de transición de vidrio más alta que hará que el proceso de moldeo sea más eficiente. Trabajo previo ha propuesto gel de agarosa como un material artificial que puede imitar algunas de las propiedades mecánicas del cerebro relevantes para la infusión defluidos 20,21. Sin embargo, el trabajo anterior no ha combinado la agarosa con un molde realista para el cerebro para proporcionar una herramienta de preparación quirúrgica. Los cerebros de gel de mezcla de agarosa moldeada se pueden utilizar para dar contexto cortical cualitativo a la ubicación de inyección y visualizar el volumen y la ubicación de la difusión de fluidos. Los cerebros de gel también se pueden utilizar para practicar el movimiento de inyección y la ubicación dentro del marco estereotaxico. Esto se puede aplicar no sólo a la optogenética, sino que se traduce en otros experimentos que requieren inyección en el cerebro2,4,34. El modelo también se puede utilizar para mejorar la práctica estándar de CED actual mediante la optimización de la velocidad de inyección y el espesor de la cánula. Este modelo también se puede reforzar mediante la validación cuantitativa de la mezcla de gel de agarosa para representar con precisión el flujo difuso y convectivo en el cerebro5,10. En los esfuerzos futuros también podemos incorporar información de vasculatura en nuestros modelos 3D al incluir imágenes mejoradas por contraste a nuestro procedimiento de imagen que puede proporcionar información crítica sobre la planificación de inyecciones.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar en este momento.

Acknowledgments

Este proyecto fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shiver de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número K12HD073945, el Centro Nacional de Investigación de Primates de Washington (WaNPCR, P51 OD010425), el Centro de Neurotecnología (CNT, un Centro Nacional de Investigación de Ingeniería de la Fundación Científica bajo la Beca CEE-1028725) y la Universidad de Washington Royalty. La financiación de los laboratorios Macknik y Martinez-Conde para este proyecto vino de un PREMIO BRAIN Initiative NSF-NCS 1734887, así como de los Premios NSF 1523614 y 1829474, y de las Becas SUNY Empire Innovator a cada profesor. Agradecemos a Karam Khateeb por su ayuda con la preparación de la agarosa, y a Toni J Huan por su ayuda técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printing Software (GrabCAD Print) Stratasys Version 1.36 Used for High quality 3D printing
3D Printing Software (Simplify 3D) Simplify3D Version 4.1 Used for PLA 3D printing
Agarose Benchmark Scientific A1700 Used for making gel brains
Black Nail Polish L.A. Colors CNP637 Used for gel molding
Cannula (ID 450 um, OD 666 um) Polymicro Technologies 1068150625 Used to inject dye into gel brain
Catheter Connector B Braun PCC2000 Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50
Dremel 3D Digilab 3D45 printer Dremel F0133D45AA Used for prototyping in PLA
ECOWORKS Stratasys 300-00104 Used to dissolve QSR support structures
Erlymeyer flask Pyrex 4980 Used for gel molding
Ethyl cyanoacrylate The Original Super Glue Corp. 15187 Used to make combined cannula
Graduated cylinder 3023 Used for gel molding
HATCHBOX PLA 3D Printer Filament HATCHBOX 3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK 1kg Spool, 1.75mm, Red/Black
Locust Bean Gum Modernist Pantry 1018 Gumming agent for gel brain mixtures
MATLAB MathWorks R2019b Used for skull extraction
McCormick Yellow Food Color McCormick Used for dye injection
Microwave Panasonic NN-SD975S Used for agarose curing
MR Imaging Software (3D Slicer) 3D Slicer Version 4.10.2 Used for 3D model generation
MR Imaging Software (Mango with BET plugin) Reasearch Imaging Institute Version 4.1 Used for brain extraction
Philips Acheiva MRI System Philips 4522 991 19391 Used to image non-human primates
Phosphate Buffered Solution Gibco 70011-044 10X diluted with DI water to 1X
Pump WPI UMP3T-1 Used for dye injection
Pump driver WPI UMP3T-1 Used for dye injection
Refrigerator General Electric Used to preserve agarose gel
Scientific Spatula VWR 82027-494 Used to extract gel molds
SolidWorks Dassault Systemes 2019
Stratasys ABS-M30 filament Stratasys 333-60304 Used for high quality 3D printing
Stratasys F170 3D printer Stratasys 123-10000 Used for high quality 3D printing
Stratasys QSR support Stratasys 333-63500 Used to create supports with ABS model
Syringe SGE SGE250TLL Used for dye injection

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References

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