Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure
Summary
Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.
Abstract
L’imagerie des cellules bêta est une étape clé vers la compréhension de la transplantation d’îlots. Bien que différentes plates-formes d’imagerie pour l’enregistrement de la biologie des cellules bêta aient été développées et utilisées in vivo,elles sont limitées en termes de résolution à cellule unique et d’enregistrements longitudinals continus. En raison de la transparence de la cornée, la chambre antérieure de l’œil (ACE) chez la souris est bien adapté pour étudier la biologie des cellules d’îlots pancréatiques humains et de souris. Voici une description de la façon dont cette approche peut être utilisée pour effectuer des enregistrements longitudinals continus de greffe et de revascularisation des greffes d’îlots humains individuels. Les greffes d’îlots humains sont insérées dans l’ACE, à l’aide de NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-souris en tant que receveurs. Cela permet l’étude de l’expansion des cellules de receveur par rapport aux donneurs et de la contribution des cellules bénéficiaires dans la promotion de l’encapsulation et de la vascularisation de la greffe. De plus, une approche étape par étape pour l’analyse de l’image et la quantification du volume de l’îlot ou de la vasculature segmentée et de la capsule d’îlot formant des cellules destinataires est décrite.
Introduction
Le diabète sucré décrit un groupe de maladies métaboliques caractérisées par des niveaux élevés de glucose sanguin comme résultats de la production insuffisante d’insuline de la perte ou du dysfonctionnement des cellules bêta d’îlot pancréatique, souvent accompagnés par la résistance à l’insuline. Le diabète de type 1 (T1D) et le diabète de type 2 (T2D) sont des maladies complexes dans lesquelles le dysfonctionnement progressif des cellules bêta provoque le développement de la maladie. Le T1D est précipité par une attaque auto-immune sur les cellules bêta, tandis que le T2D est considéré comme étant motivé par des facteurs métaboliques, bien qu’avec des preuves croissantes de l’inflammation systémique de qualité basse1. La transplantation d’îlots humains donneurs, en particulier pour les patients atteints de T1D, offre le potentiel de fournir un contrôle glycémique physiologique. Cependant, une pénurie de donneurs de tissus et une mauvaise engreffement d’îlots a empêché la transplantation d’îlots de devenir une option thérapeutique courante. Une proportion substantielle de la greffe fonctionnelle d’îlot est perdue dans la période immédiate de posttransplantation (24–48 h) due à l’environnement d’hôte hypoxique, inflammatoire, immunogénique2,3. Pour évaluer l’efficacité des méthodes d’intervention pour l’amélioration de la survie des îlots, un suivi continu de ces transplantations est nécessaire.
In vivo techniques pour l’image et le suivi du sort des îlots pancréatiques humains transplantés après la transplantation reste un défi pour la recherche sur le diabète4,5. À ce jour, les techniques d’imagerie non invasive, y compris la tomographie par émission de positrons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l’échographie (US) présentent un potentiel de quantification et d’évaluation fonctionnelle des îlots transplantés dans des conditions expérimentales5. Toutefois, compte tenu de la petite taille des îlots, les mesures quantitatives effectuées par ces modalités souffrent d’une résolution insuffisante. La chambre antérieure de l’œil (ACE) comme site de transplantation pour l’observation est une solution d’imagerie non invasive prometteuse offrant effectivement une résolution spatiale plus élevée et une surveillance fréquente sur de longues périodes de temps6. Cette méthode a été exploitée avec succès pour étudier la biologie des îlots de souris (revue dans Yang et coll.7), les réponses immunitaires auto-immunes8, ainsi que la greffe d’îlot humain9,10.
Ici, la méthode de transplantation ACE est combinée avec une approche d’imagerie de 2 photons pour étudier la dynamique du processus d’engraftment de l’îlot pancréatique humain par des enregistrements continus et répétés sur des greffes d’îlots individuels pendant jusqu’à 10 mois après la transplantation. Les propriétés d’imagerie multiphoton de plus grandes profondeurs d’imagerie et de photobleaching global réduit et dommages de photo surmontent les limitations d’imagerie de la microscopie confocale11. La quantification de l’imagerie fluorescente comporte plusieurs étapes, y compris la préparation de l’échantillon d’îlots, la transplantation d’îlots, l’acquisition d’images, le filtrage d’images pour éliminer le bruit ou le fond des îlots, la segmentation, la quantification et l’analyse des données. L’étape la plus difficile consiste généralement à partitionner ou segmenter une image en plusieurs parties ou régions. Cela pourrait impliquer la séparation du signal du bruit de fond, ou le regroupement des régions de voxels en fonction de similitudes de couleur ou de forme pour détecter et étiqueter les voxels d’un volume 3D qui représente la vascularisation des îlots, par exemple. Une fois segmentées, les statistiques telles que la taille du volume d’objets sont généralement simples à extraire. Fourni est une méthode de quantification et d’extraction des données d’imagerie, telles que la segmentation et la visualisation des données. Une attention particulière est accordée à l’élimination de l’autofluorescence dans les îlots humains et à la distinction entre la vascularisation des îlots et la capsule d’îlot formant des cellules destinataires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une méthode est présentée pour étudier le processus de greffe de cellules d’îlot pancréatique humaine en observant la participation du tissu de destinataire et de donneur. Après une chirurgie invasive minimale implantant des îlots humains dans la chambre antérieure d’un œil de souris immunodéficient, la souris récupère rapidement dans les minutes qui s’ adressent à la chirurgie. La procédure est effectuée sur un œil. En général, à partir de 5 à 7 jours après l’implantation, la cornée est suff…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la zone de recherche stratégique Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique Dnr IRC15-0067 à LUDC-IRC, la Royal Physiographic Society à Lund, Diabetesförbundet et Barndiabetesförbundet.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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