Продольные изображения In Vivo и количественная оценка человека поджелудочной железы островок прививки и содействия принимающих клеток в передней камере глаза
Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы постоянно контролировать динамику процесса отбора островков поджелудочной железы человека и способствующих принимающей против донорских клеток. Это достигается путем пересадки человеческих островков в переднюю камеру глаза (ACE) НОД. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4–Rag2-/-получатель мыши с последующим повторным 2-фотонных изображений.
Abstract
Изображение бета-клеток является ключевым шагом на пути к пониманию трансплантации островка. Хотя различные платформы визуализации для записи биологии бета-клеток были разработаны и использованы in vivo,они ограничены с точки зрения разрешения одной клетки и непрерывных продольных записей. Из-за прозрачности роговицы, передняя камера глаза (ACE) у мышей хорошо подходит для изучения человека и мыши поджелудочной железы островка биологии клеток. Вот описание того, как этот подход может быть использован для выполнения непрерывных продольных записей прививки и реваскуляризации отдельных человеческих островк трансплантатов. Человеческие островки трансплантаты вставляются в ACE, используя NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4–Rag2-/- мышив качестве получателей. Это позволяет провести исследование расширения реципиентных и донорских клеток и внести вклад клеток-реципиентов в содействие инкапсуляции и васкуляризации трансплантата. Кроме того, изложен пошаговая подход к анализу изображений и количественной оценке объема островка или сегментированных сосудов и островковых капсул, образующих клетки-получатели.
Introduction
Сахарный диабет описывает группу метаболических заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем глюкозы в крови, как результат недостаточной выработки инсулина в результате потери или дисфункции бета-клеток островков поджелудочной железы, часто сопровождаемых резистентностью к инсулину. Тип 1 (T1D) и диабет типа 2 (T2D) являются сложными заболеваниями, при которых прогрессирующая дисфункция бета-клеток вызывает развитие болезни. T1D осаждается аутоиммунной атаки на бета-клетки, в то время как T2D считается обусловлен метаболических факторов, хотя и с увеличением доказательств низкосортногосистемного воспаления 1. Трансплантация донорских человеческих островков, особенно пациентам с Т1Д, дает возможность обеспечения физиологического гликемического контроля. Тем не менее, нехватка доноров тканей и бедных островок engraftment предотвратил островок трансплантации, чтобы стать основным терапевтическим вариантом. Значительная часть функционального пересадки островка теряется в непосредственной посттрансплантации (24-48 ч) из-за гипоксической, воспалительной, иммуногеннойсреды хозяина 2,,3. Для оценки эффективности методов вмешательства для повышения выживаемости островка необходим постоянный мониторинг таких трансплантаций.
In vivo методы для изображения и отслеживания судьбы пересаженной человеческой поджелудочной железы островки после трансплантации по-прежнему остается проблемой дляисследования диабета 4,5. На сегодняшний день неинвазивные методы визуализации, включая позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ) или УЗИ (США), показывают потенциал для количественной и функциональной оценки пересаженных островков вэкспериментальных условиях 5. Однако, учитывая небольшие размеры островка, количественные измерения по этим условиям страдают от недостаточного разрешения. Передняя камера глаза (ACE) в качестве места трансплантации для наблюдения является перспективным неинвазивным решением для визуализации, предлагающим эффективно более высокое пространственное разрешение и частый мониторинг в течение длительныхпериодов времени 6. Этот метод был успешно использован для изучения биологии островка мыши (рассмотрены в Ян и др.7), аутоиммунныеиммунные реакции 8, а также человека островокпрививки 9,10.
Здесь метод трансплантации ACE сочетается с 2-фотонной визуализацией для исследования динамики процесса пересадки островков поджелудочной железы человека путем непрерывных и повторных записей на отдельных островктных трансплантатах в течение 10 месяцев после трансплантации. Многофотонные свойства изображений большей глубины изображения и снижение общего фотоотливов и повреждения фото преодолеть ограничения изображения конфокальные микроскопии11. Количественная оценка флуоресцентной визуализации включает в себя несколько этапов, включая подготовку островка образца, пересадку островка, получение изображений, фильтрацию изображений для удаления шума островка или фона, сегментацию, количественную оценку и анализ данных. Наиболее сложным шагом обычно является разделение или сегментация изображения на несколько частей или областей. Это может включать отделение сигнала от фонового шума или кластеризацию областей вокелей на основе сходства в цвете или форме для обнаружения и обозначения воксельов 3D-тома, который представляет собой островок сосудов, например. После сегментации статистические данные, такие как размеры объема объектов, обычно просты в извлечении. Предоставляется метод количественной оценки и извлечения данных изображений, таких как сегментация и визуализация данных. Особое внимание уделяется удалению аутофторесценции в человеческих островках и различию между островками сосудов и островковых капсул, образующих клетки-реципиенты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлен метод изучения процесса пересадки клеток поджелудочной железы человека путем наблюдения за вовлечением реципиентной и донорской ткани. После минимальной инвазивной операции имплантации человеческих островков в переднюю камеру иммунодефицитного мышиного глаза, мышь бы?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Шведским исследовательским советом, Стратегическим исследовательским районом Экзодиаб, Dnr 2009-1039, Шведским фондом стратегических исследований Dnr IRC15-0067 в LUDC-IRC, Королевским физикографическим обществом в Лунде, Diabetesf’rbundet и Barndiabetesf’rbundet.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
