前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量
Summary
このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4–Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。
Abstract
ベータ細胞のイメージングは、小子移植を理解するための重要なステップです。ベータ細胞生物学の記録のための異なるイメージングプラットフォームが 開発され、インビボで利用されているが、それらは単一細胞分解能および連続的な縦断記録を可能にするという点で限られている。角膜の透明性のために、マウスの眼前房(ACE)は、ヒトおよびマウス膵島細胞生物学の研究に適している。ここでは、このアプローチを使用して、個々のヒト小口移植片の移植および再血管化の連続的な縦方向の記録を行うことができる方法の説明を示す。ヒトの小子移植片は、NODを使用して、ACEに挿入される。(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-マウスをレシピエントとして使用する。これにより、レシピエント対ドナー細胞の拡張の調査と、移植片のカプセル化および血管化を促進するレシピエント細胞の寄与を可能にする。また、レシピエント細胞を形成する島の体積またはセグメント化された血管系および小島カプセルの画像分析および定量化のためのステップバイステップのアプローチが概説されている。
Introduction
糖尿病は、膵島ベータ細胞の喪失または機能不全からのインスリン産生不十分な結果として、血糖のレベルの上昇を特徴とする代謝疾患のグループを記述し、しばしばインスリン抵抗性を伴う。1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)は、ベータ細胞の進行性機能障害が疾患の発症を引き起こす複雑な疾患である。T1Dはベータ細胞に対する自己免疫攻撃によって沈殿し、一方T2Dは代謝因子によって駆動されると考えられるが、低位の全身炎症の証拠は増加する1である。ドナーヒト小島の移植は、特にT1D患者に、生理的血糖コントロールを提供する可能性を提供する。しかし、組織ドナーの不足と貧しい小地の生着は、主流の治療オプションになるための小地移植を妨げている。機能的な小子移植片のかなりの割合は、低酸素、炎症性、免疫原性宿主環境22、33のために、即時の移植後期間(24〜48時間)で失われる。イレット生存率の改善のための介入方法の効率を評価するためには、このような移植の継続的なモニタリングが必要である。
移植後に移植されたヒト膵島の運命を画像化および追跡するin vivo技術は、糖尿病研究4,55に依然として4課題である。現在までに、非侵襲的イメージング技術は、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、または超音波(US)を含む、実験条件5における移植された小島の定量化および機能評価の可能性を示す。しかし、小さな小さな小さな小さな小さな小さい小さい小さいと、それらのモダリティによる定量的な測定は、不十分な解像度に苦しむ。眼前室(ACE)を観察用の移植部位としては、長期間にわたって効果的に高い空間分解能と頻繁なモニタリングを提供する有望な非侵襲的イメージングソリューションである。この方法は、マウスの小子生物学(ヤンら7でレビュー)、自己免疫免疫応答8、ならびにヒトの小子移植9,9、10を研究するためにうまく利用されている。
ここでACE移植法を2光子イメージング手法と組み合わせて、移植後最大10ヶ月間、個々の膵島移植片に対する連続的かつ繰り返しの記録によってヒト膵島の生着プロセスのダイナミクスを調べる。より大きな撮像深度の多光子イメージング特性と、全体的な光漂白および光損傷の減少は、共焦点顕微鏡11のイメージング限界を克服する。蛍光イメージングの定量化には、小島サンプル調製、小島移植、画像取得、島のノイズや背景を除去するための画像フィルタリング、セグメンテーション、定量、データ分析など、いくつかの段階が含まれます。最も困難な手順は、通常、イメージを複数のパーツまたはリージョンに分割または分割することです。これには、バックグラウンドノイズから信号を分離することや、色や形状の類似性に基づいてボクセルの領域をクラスタリングして、たとえば、アイレット血管系を表す3Dボリュームのボクセルを検出してラベル付けすることが含まれます。セグメント化されると、オブジェクトのボリュームサイズなどの統計は、通常、簡単に抽出できます。提供される方法は、セグメンテーションやデータ可視化などのイメージングデータの定量・抽出方法である。特に注意は、ヒト小島における自己蛍光の除去と、受け手細胞を形成する小島の血管系と小島カプセルの区別に関する。
Protocol
Representative Results
Discussion
レシピエントとドナー組織の関与を観察することによってヒト膵島細胞移植プロセスを研究する方法を提示する。免疫不全マウス眼の前房にヒトの小島を移植する最小限の侵襲手術の後、マウスは手術後数分以内に迅速に回復する。手順は片目で行われます。一般に、5~7日以降、角膜は、生体内イメージングを行うのに十分に治癒する。
このプロトコルでは、ヒトの小?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スウェーデン研究評議会、戦略的研究地域Exodiab、Dnr 2009-1039、LUDC-IRC、ルンド、糖尿病フェルブンデット、バーン糖尿病フェルバンデットの王立生理学会への戦略研究DNR IRC15-0067スウェーデンの財団によって支援されました。
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
