Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell’isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l’ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell’occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.
Abstract
L’imaging delle cellule beta è un passo fondamentale verso la comprensione del trapianto di islet. Anche se diverse piattaforme di imaging per la registrazione della biologia delle cellule beta sono state sviluppate e utilizzate in vivo,sono limitate in termini di possibilità di risoluzione a singola cellula e registrazioni longitudinali continue. A causa della trasparenza della cornea, la camera anteriore dell’occhio (ACE) nei topi è adatta a studiare la biologia delle cellule dell’isolotto pancreatico umano e topo. Ecco una descrizione di come questo approccio può essere utilizzato per eseguire registrazioni longitudinali continue di innesto e revascolarizzazione di singoli innesti di isolotto umano. Gli innesti di isolotto umano vengono inseriti nell’ACE, utilizzando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-topi come destinatari. Ciò consente di sondare l’espansione delle cellule del ricevente rispetto a quelle del donatore e il contributo delle cellule riceventi nella promozione dell’incapsulamento e della vascolarizzazione dell’innesto. Inoltre, viene delineato un approccio passo-passo per l’analisi delle immagini e la quantificazione del volume dell’isolotto o della vascolatura segmentata e della capsula dell’isolotto che formano le cellule riceventi.
Introduction
Il diabete mellito descrive un gruppo di malattie metaboliche caratterizzate da livelli elevati di glucosio nel sangue come risultato di una produzione insufficiente di insulina da perdita o disfunzione delle cellule beta delle isole pancreatiche, spesso accompagnate da insulino-resistenza. Il diabete di tipo 1 (T1D) e il diabete di tipo 2 (T2D) sono malattie complesse in cui la progressiva disfunzione delle cellule beta causa lo sviluppo della malattia. T1D è precipitato da un attacco autoimmune sulle cellule beta, mentre T2D è considerato guidato da fattori metabolici, anche se con crescente evidenza di infiammazione sistemica di bassogrado 1. Il trapianto di isolotti umani donati, in particolare ai pazienti affetti da T1D, offre il potenziale per fornire un controllo glicemico fisiologico. Tuttavia, la carenza di donatori di tessuti e la scarsa innesto di isoloti ha impedito che il trapianto di isolotto diventasse un’opzione terapeutica tradizionale. Una parte sostanziale dell’innesto dell’isolotto funzionale viene persa nell’immediato periodo post-trapianto (24-48 h) a causa dell’ambiente di ospite ipossico, infiammatorio e immunogenico2,3. Per valutare l’efficienza dei metodi di intervento per il miglioramento della sopravvivenza delle isore, è necessario un monitoraggio continuo di tali trapianti.
Tecniche in vivo per immaginiare e tracciare il destino delle isole pancreatiche umane trapiantate dopo il trapianto rimane ancora una sfida per la ricerca suldiabete 4,5. Ad oggi, le tecniche di imaging non invasive, tra cui la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (RTI) o gli ultrasuoni (US) mostrano il potenziale per la quantificazione e la valutazione funzionale delle isole trapiantate in condizionisperimentali 5. Tuttavia, date le piccole dimensioni degli isocchi, le misurazioni quantitative di tali modalità soffrono di una risoluzione insufficiente. La camera anteriore dell’occhio (ACE) come sito di trapianto per l’osservazione è una promettente soluzione di imaging non invasivo che offre una risoluzione spaziale efficace e un monitoraggio frequente per lunghi periodidi tempo 6. Questo metodo è stato sfruttato con successo per studiare la biologia delle isole dei topi (recensito in Yang et al.7), le risposte immunitarie autoimmuni8, così come l’innesto dell’isolottoumano 9,10.
Qui il metodo di trapianto ACE si combina con un approccio di imaging a 2 fotoni per studiare la dinamica del processo di innesto dell’isolotto pancreatico umano mediante registrazioni continue e ripetute su singoli innesti di isolotto fino a 10 mesi dopo il trapianto. Le proprietà di imaging multifoto di maggiori profondità di imaging e riduzione del fotobleaching complessivo e dei danni fotografici superano i limiti di imaging della microscopia confocale11. La quantificazione dell’imaging fluorescente comporta diverse fasi, tra cui la preparazione del campione di isolotto, il trapianto di isolotto, l’acquisizione di immagini, il filtraggio delle immagini per rimuovere il rumore o lo sfondo delle isole, la segmentazione, la quantificazione e l’analisi dei dati. Il passaggio più impegnativo è in genere il partizionamento o la segmentazione di un’immagine in più parti o aree. Ciò potrebbe comportare la separazione del segnale dal rumore di fondo o il raggruppamento di regioni di voxel in base a somiglianze di colore o forma per rilevare ed etichettare i voxel di un volume 3D che rappresenta la vascolatura dell’isolotto, ad esempio. Una volta segmentate, le statistiche, ad esempio le dimensioni del volume degli oggetti, sono in genere semplici da estrarre. Fornito è un metodo per la quantificazione e l’estrazione dei dati di imaging, ad esempio la segmentazione e la visualizzazione dei dati. Particolare attenzione è prestata alla rimozione dell’autofluorescenza negli isolotti umani e alla distinzione tra vascolatura dell’isolotto e capsula isolotta che forma le cellule riceventi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene presentato un metodo per studiare il processo di innesto delle cellule dell’isolotto pancreatico umano osservando il coinvolgimento del tessuto del ricevente e del donatore. Dopo un intervento chirurgico mini-invasivo che impianta isolotti umani nella camera anteriore di un occhio di topo immunodeficiente, il topo si riprende rapidamente pochi minuti dopo l’intervento chirurgico. La procedura viene eseguita su un occhio. Generalmente, da 5-7 giorni dopo la postimplantazione in poi la cornea è sufficientemente guar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio svedese per la ricerca, dall’Area strategica di ricerca Exodiab, dal Dnr 2009-1039, dalla Fondazione svedese per la ricerca strategica Dnr IRC15-0067 alla LUDC-IRC, alla Royal Physiographic Society di Lund, Al diabetesf-rbundet e Barndiabetesf-rbundet.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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