Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior
Summary
O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.
Abstract
As células beta de imagem são um passo fundamental para entender o transplante de ilhotas. Embora diferentes plataformas de imagem para o registro da biologia celular beta tenham sido desenvolvidas e utilizadas in vivo,elas são limitadas em termos de permitir resolução de células únicas e gravações longitudinais contínuas. Devido à transparência da córnea, a câmara anterior do olho (ACE) em camundongos é bem adequada para estudar biologia de células ilhotas pancreáticas humanas e de camundongos. Aqui está uma descrição de como essa abordagem pode ser usada para realizar gravações longitudinais contínuas de enxerto e revascularização de enxertos de ilhotas humanas individuais. Enxertos de ilhotas humanas são inseridos no ACE, usando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-ratos como destinatários. Isso permite a investigação da expansão das células receptoras versus doadoras e a contribuição das células receptoras na promoção do encapsulamento e vascularização do enxerto. Além disso, é delineada uma abordagem passo a passo para análise de imagens e quantificação do volume de ilhotas ou vasculatura segmentada e cápsula de ilhota formando células receptoras.
Introduction
Diabetes mellitus descreve um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por níveis elevados de glicose no sangue como resultado da produção insuficiente de insulina de perda ou disfunção de células beta de ilhotas pancreáticas, muitas vezes acompanhadas pela resistência à insulina. Diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D) são doenças complexas nas quais a disfunção progressiva das células beta causa o desenvolvimento da doença. O T1D é precipitado por um ataque autoimune nas células beta, enquanto o T2D é considerado impulsionado por fatores metabólicos, embora com evidências crescentes de inflamação sistêmica de baixo grau1. O transplante de ilhotas humanas doadoras, particularmente para pacientes com T1D, oferece o potencial para fornecer controle fisiológico glicêmico. No entanto, a escassez de doadores de tecidos e o enxerto de ilhotas pobres impediram o transplante de ilhotas para se tornar uma opção terapêutica convencional. Uma proporção substancial do enxerto de ilhota funcional é perdida no período pós-transplantação imediato (24-48 h) devido ao ambiente hospedeiro hipóxico, inflamatório e imunogênico2,3. Para avaliar a eficiência dos métodos de intervenção para a melhoria da sobrevida de ilhotas, é necessário o acompanhamento contínuo desses transplantes.
Técnicas in vivo para imagem e rastrear o destino das ilhotas pancreáticas humanas transplantadas após o transplante ainda permanecem um desafio para a pesquisa sobre diabetes4,5. Até o momento, técnicas não invasivas de imagem, incluindo tomografia de emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) ou ultrassom (EUA) mostram potencial para quantificação e avaliação funcional de ilhotas transplantadas em condições experimentais5. No entanto, dado o pequeno tamanho de ilhotas, as medições quantitativas por essas modalidades sofrem de resolução insuficiente. A câmara anterior do olho (ACE) como local de transplante para observação é uma promissora solução de imagem não invasiva que oferece efetivamente maior resolução espacial e monitoramento frequente ao longo dos longos períodos6. Este método foi explorado com sucesso para estudar a biologia da ilhota do rato (revisada em Yang et al.7), respostas imunes autoimunes8, bem como enxerto de ilhotas humanas9,,10.
Aqui, o método de transplante ACE é combinado com uma abordagem de imagem de 2 fótons para investigar a dinâmica do processo de enxerto de ilhotas pancreáticas humanas por gravações contínuas e repetidas em enxertos de ilhotas individuais por até 10 meses após o transplante. As propriedades de imagem multifotíferas de maiores profundidades de imagem e redução do fotobleaching geral e danos fotográficos superam as limitações de imagem da microscopia confocal11. A quantificação da imagem fluorescente envolve várias etapas, incluindo preparação da amostra de ilhotas, transplante de ilhotas, aquisição de imagens, filtragem de imagens para remover ruído ou fundo de ilhotas, segmentação, quantificação e análise de dados. O passo mais desafiador é geralmente particionar ou segmentar uma imagem em várias partes ou regiões. Isso pode envolver a separação do sinal do ruído de fundo, ou regiões de agrupamento de voxels com base em semelhanças em cor ou forma para detectar e rotular voxels de um volume 3D que representa vasculatura ilhota, por exemplo. Uma vez segmentadas, estatísticas como tamanhos de volume de objeto são tipicamente simples de extrair. Fornecido é um método para quantificação e extração dos dados de imagem, como segmentação e visualização de dados. Atenção especial é dada à remoção da autofluorescência em ilhotas humanas e à distinção entre vasculatura de ilhotas e cápsula de ilhota formando células receptoras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um método é apresentado para estudar o processo de enxerto de células de ilhotas pancreáticas humanas, observando o envolvimento do receptor e do tecido doador. Após uma cirurgia invasiva mínima implantando ilhotas humanas na câmara anterior de um olho de rato imunodeficente, o rato se recupera rapidamente em poucos minutos após a cirurgia. O procedimento é realizado em um olho. Geralmente, de 5 a 7 dias de postimplantação em diante a córnea é suficientemente curada para realizar imagens intravitais.
<p …Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Conselho Sueco de Pesquisa, Área de Pesquisa Estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, fundação sueca de pesquisa estratégica Dnr IRC15-0067 para ludc-IRC, a Royal Physiographic Society em Lund, Diabetesförbundet e Barndiabetesförbundet.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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