Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.
Abstract
Die Bildgebung von Betazellen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Letentransplantation. Obwohl verschiedene Bildgebungsplattformen für die Aufzeichnung der Beta-Zellbiologie entwickelt und in vivogenutzt wurden, sind sie in Bezug auf die Zulassung von Einzelzellauflösung und kontinuierlichen Längsaufnahmen begrenzt. Aufgrund der Transparenz der Hornhaut eignet sich die vordere Augenkammer (ACE) bei Mäusen gut, um die Biologie der menschlichen und Mauspankreasinsel zu untersuchen. Hier ist eine Beschreibung, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um kontinuierliche Längsschnittaufnahmen von Transplantationen und Revaskularisation enterblichen menschlichen Islettransplantaten durchzuführen. Menschliche Islettransplantate werden mit NOD in den ACE eingeführt. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-Mäuse als Empfänger. Dies ermöglicht die Untersuchung der Expansion von Empfänger- gegen Spenderzellen und den Beitrag von Empfängerzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisation des Transplantats. Darüber hinaus wird ein Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Bildanalyse und Quantifizierung des Ischenvolumens oder der segmentierten Vaskulatur und der Isletkapsel bildenden Empfängerzellen skizziert.
Introduction
Diabetes mellitus beschreibt eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen, die durch erhöhte Blutzuckerwerte gekennzeichnet sind, als Ergebnis unzureichender Insulinproduktion durch Verlust oder Dysfunktion von Betazellen der Pankreas-Islet, oft begleitet von Insulinresistenz. Typ-1 -Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) sind komplexe Krankheiten, bei denen die fortschreitende Dysfunktion der Betazellen die Entwicklung von Krankheiten verursacht. T1D wird durch einen Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen gefällt, während T2D als durch metabolische Faktoren angetrieben wird, wenn auch mit zunehmenden Beweisen für eine niedriggradige systemische Entzündung1. Die Transplantation von menschlichen Spenderinseln, insbesondere für T1D-Patienten, bietet das Potenzial zur physiologischen glykämischen Kontrolle. Ein Mangel an Gewebespendern und eine mangelhafte Islet-Transplantation haben jedoch verhindert, dass die Letentransplantation zu einer gängigen therapeutischen Option wird. Ein erheblicher Teil des funktionellen Islettransplantats geht in der unmittelbaren Posttransplantationsphase (24–48 h) aufgrund der hypoxischen, entzündlichen, immunogenen Wirtsumgebung2,3verloren. Um die Effizienz der Interventionsmethoden zur Verbesserung des Überlebens der Leten zu bewerten, ist eine kontinuierliche Überwachung solcher Transplantationen erforderlich.
In-vivo-Techniken, um das Schicksal transplantierter menschlicher Pankreasinseln nach der Transplantation abzubilden und zu verfolgen, bleibt für die Diabetesforschung nachwie voreine Herausforderung 4,5. Bislang zeigen nichtinvasive bildgebende Verfahren, einschließlich Positronenemissionstomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), Potenzial für die Quantifizierung und funktionelle Bewertung transplantierter Inselchen unter experimentellen Bedingungen5. Angesichts der geringen Isätsgrößen leiden quantitative Messungen nach diesen Modalitäten jedoch unter unzureichender Auflösung. Die Vorderkammer des Auges (ACE) als Transplantationsstelle zur Beobachtung ist eine vielversprechende nichtinvasive bildgebende Lösung, die eine effektiv höhere räumliche Auflösung und häufige Überwachung über lange Zeiträumebietet 6. Diese Methode wurde erfolgreich genutzt, um Maus Inselbiologie zu studieren (überprüft in Yang et al.7), Autoimmunimmunreaktionen8, sowie menschliche Insel Pfropfung9,10.
Hier beiderageniert wird die ACE-Transplantationsmethode mit einem 2-Photon-Bildgebungsansatz, um die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantatprozesses durch kontinuierliche und wiederholte Aufnahmen an einzelnen Islettransplantaten bis zu 10 Monate nach der Transplantation zu untersuchen. Die Multiphotonen-Bildgebungseigenschaften größerer Bildtiefe und reduzierter Photobleich- und Fotoschäden überwinden die bildgebenden Grenzen der konfokalen Mikroskopie11. Die Quantifizierung der fluoreszierenden Bildgebung umfasst mehrere Phasen, einschließlich der Vorbereitung von Inselproben, der Inseltransplantation, der Bildaufnahme, der Bildfilterung zur Entfernung von Inselrauschen oder -hintergrund, der Segmentierung, Quantifizierung und Datenanalyse. Der schwierigste Schritt ist in der Regel die Partitionierung oder Segmentierung eines Bildes in mehrere Teile oder Regionen. Dies kann die Trennung von Signal und Hintergrundrauschen oder Clustering-Bereiche von Voxeln auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in Farbe oder Form beinhalten, um Voxel eines 3D-Volumens zu erkennen und zu kennzeichnen, das beispielsweise die Vaskulatur der Islet darstellt. Nach der Segmentierung sind Statistiken wie Objektvolumengrößen in der Regel einfach zu extrahieren. Zur Verfügung gestellt wird eine Methode zur Quantifizierung und Extraktion der Bilddaten, wie Segmentierung und Datenvisualisierung. Besonderes Augenmerk wird auf die Entfernung der Autofluoreszenz bei menschlichen Inselchen und die Unterscheidung zwischen Inselvaskulatur und Inselkapsel bildenden Empfängerzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Methode wird vorgestellt, um den Prozess der Pfropfzelltransplantation der menschlichen Pankreas-Islet-Zell-Transplantation zu untersuchen, indem die Beteiligung von Empfänger- und Spendergewebe beobachtet wird. Nach einer minimalinvasiven Operation, bei der menschliche Inselchen in die vordere Kammer eines immungeschwächten Mausauges implantiert wurden, erholt sich die Maus innerhalb weniger Minuten nach der Operation schnell. Das Verfahren wird auf einem Auge durchgeführt. In der Regel wird die Hornhaut ab 5–…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Schwedischen Forschungsrat, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, der Schwedischen Stiftung für Strategische Forschung Dnr IRC15-0067 an LUDC-IRC, der Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet und Barndiabetesförbundet unterstützt.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
