Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase

Summary

Les inhibiteurs de l’hétone acétyltransférases (HATs, également connu sous le nom d’acétyltransférases de lysine), tels que CBP/p300, sont des traitements potentiels pour traiter le cancer. Cependant, des méthodes rigoureuses pour valider ces inhibiteurs sont nécessaires. Trois méthodes in vitro pour la validation incluent des essais de HAT avec des acétyltransférases recombinantes, l’immunoblotting pour l’acétylation d’histone dans la culture cellulaire, et ChIP-qPCR.

Abstract

Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les histones et d’autres protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et l’expression des gènes. KaTs, tels que CBP/p300, font l’objet d’une étude intense en tant que cibles thérapeutiques en raison de leur rôle critique dans la tumeur de divers cancers. Le développement de nouveaux inhibiteurs de petites molécules ciblant la fonction d’acétyltransférase histone (HAT) des KAT est difficile et nécessite des essais robustes qui peuvent valider la spécificité et la puissance des inhibiteurs potentiels.

Cet article décrit un pipeline de trois méthodes qui fournissent une validation in vitro rigoureuse pour les nouveaux inhibiteurs de la HAT (HATi). Ces méthodes incluent un test hat de tube d’essai, l’essai d’inhibition d’hyperacétylation de chromatine (ChHAI), et le PCR immunoprécipitation-quantitative de chromatine (ChIP-qPCR). Dans l’essai hat, les HAT recombinants sont incubés avec des histones dans une réaction de tube à essai, permettant l’acétylation des résidus spécifiques de lysine sur les queues d’histone. Cette réaction peut être bloquée par un HATi et les niveaux relatifs d’acétylation d’histone spécifique au site peuvent être mesurés par immunoblotting. Les inhibiteurs identifiés dans l’essai de la HAT doivent être confirmés dans l’environnement cellulaire.

L’essai de ChHAI utilise l’immunoblotting pour dépister le nouveau HATi qui atténue l’hyperacétylation robuste des histones induite par un inhibiteur de la déacétylase d’histone (HDACi). L’ajout d’un HDACi est utile parce que les niveaux basaux de l’acétylation histone peut être difficile à détecter par immunoblotting.

Les tests HAT et ChHAI mesurent les changements globaux dans l’acétylation de l’histone, mais ne fournissent pas d’informations concernant l’acétylation dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, ChIP-qPCR est utilisé pour étudier les effets de HATi sur les niveaux d’acétylation de l’histone aux éléments de régulation des gènes. Ceci est accompli par l’immunoprécipitation sélective des complexes histone-ADN et l’analyse de l’ADN purifié par qPCR. Ensemble, ces trois essais permettent la validation minutieuse de la spécificité, de la puissance et du mécanisme d’action du nouveau HATi.

Introduction

Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les protéines histone et non-histone^1,2,3,4. Des recherches récentes révèlent que les KAT et leur fonction d’acétyltransférase peuvent favoriser la croissance de tumeur solide^4,5,6,7,8,9. Par exemple, les protéines liant le CREB (CBP)/p300 sont deux KAT paralogues qui régulent de nombreuses voies de signalisation dans le cancer^2,3. CBP/p300 ont une fonction d’acétyltransférase d’histone bien caractérisée (HAT) et catalysent Histone 3 Lysine 27 acétylation (H3K27ac)^2,4,5,10,11, un marqueur important pour les exhausteurs actifs, les régions de promoteur et la transcription active de gène^12,13,14. CBP/p300 servent de co-activateurs critiques pour les voies de signalisation pro-croissance dans les tumeurs solides en activant la transcription des oncogènes par acétylation des histones et d’autres facteurs de transcription^{4,9,15,16,17,18}. En raison de leur rôle dans la progression de tumeur, CBP/p300 et d’autres KATs sont à l’étude pour le développement de nouveaux inhibiteurs qui bloquent leur fonction oncogène^{4,5,6,7,8,9,18,19,20}. A-485 et GNE-049 représentent deux tentatives réussies de développer des inhibiteurs puissants et spécifiques pour CBP/p300^4,9. D’autres inhibiteurs font actuellement l’objet d’une enquête pour le CBP/p300 et d’autres TCA.

La qualité des inhibiteurs kat précédemment décrits (KATi) est remise en question, avec de nombreux inhibiteurs montrant les effets cibles et une mauvaise caractérisation²¹. Par conséquent, une caractérisation rigoureuse et la validation de nouveaux médicaments candidats sont essentielles au développement de sondes chimiques de haute qualité. Voici trois protocoles qui forment un pipeline pour le dépistage et la validation rigoureuse de la puissance et de la spécificité du nouveau KATi, avec un accent spécifique sur l’inhibition de la fonction HAT (HATi) des KAT. CBP/p300 et leurs inhibiteurs sont utilisés comme exemples, mais ces protocoles peuvent être adaptés pour d’autres KAT qui ont une fonction HAT⁷.

Le premier protocole est un test in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) qui utilise le p300 recombinant purifié et les histones dans une réaction contrôlée de tube à essai. Ce test est simple à effectuer, est rentable, peut être utilisé pour filtrer les composés dans un réglage à faible débit, et ne nécessite pas de matières radioactives. Dans ce protocole, le p300 recombinant catalyse l’acétylation de lysine sur les queues d’histone pendant une brève période d’incubation et les niveaux d’acétylation d’histone sont mesurés à l’aide de procédures standard d’immunoblotting. La réaction enzymatique peut être effectuée en présence ou en l’absence d’inhibiteurs CBP/p300 pour dépister les composés qui réduisent l’acétylation de l’histone. En outre, l’essai hat peut être utilisé pour vérifier si les nouveaux composés sont sélectifs pour le CBP/p300 en évaluant leur activité par rapport à d’autres KAT purifiés, tels que le PCAF. L’essai HAT est un excellent point de départ pour étudier de nouveaux inhibiteurs en raison de sa simplicité, faible coût, et la capacité de déterminer la puissance / sélectivité d’un inhibiteur. En effet, ce protocole est souvent utilisé dans la littérature comme un écran in vitro^5,10. Cependant, les inhibiteurs identifiés dans l’essai hat ne sont pas toujours efficaces dans la culture cellulaire parce qu’une réaction de tube à essai est beaucoup plus simple qu’un système de cellules vivantes. Par conséquent, il est essentiel de caractériser davantage les inhibiteurs dans les expériences de culture cellulaire^22,23.

Le deuxième protocole dans le pipeline est le test d’inhibition de l’hyperacétylation de la chrométine (ChHAI). Ce test à base de cellules utilise des inhibiteurs de la dacetylase histone (HDACi) comme un outil pour hyperacétiller les histones dans la chromatine avant co-incubation avec un HATi²⁴. L’acétylation d’histone basal peut être faible dans la culture cellulaire, ce qui rend difficile de sonder pour par l’immunoblotting sans l’ajout d’un HDACi pour augmenter l’acétylation. Le but de l’essai de ChHAI est d’identifier le roman HATi qui peut atténuer l’augmentation de l’acétylation d’histone provoquée par l’inhibition de HDAC. Les avantages de cet essai incluent son faible coût, la facilité relative à effectuer, et l’utilisation des cellules dans la culture, qui fournit plus de pertinence physiologique que le test de hat de tube à essai. Semblable à l’essai HAT, ce protocole utilise l’immunoblotting standard pour la collecte de données.

Les tests HAT et ChHAI fournissent des données sur la puissance de nouveaux composés pour inhiber l’acétylation de l’histone globale, mais ne fournissent pas de perspicacité dans la façon dont ces composés affectent les modifications dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, le protocole final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) est une expérience de culture cellulaire qui étudie les interactions ADN-protéines à des régions spécifiques du génome. Dans le protocole ChIP, la chromatine est croisée pour préserver les interactions ADN-protéines. La chromatine est ensuite extraite des cellules et le complexe ADN-protéine subit une immunoprécipitation sélective pour la protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’un anticorps spécifique au H3K27ac). L’ADN est ensuite purifié et analysé à l’aide de qPCR. Par exemple, ChIP-qPCR peut être utilisé pour déterminer si un roman HATi downregulates histone acétylation à des oncogènes individuels, tels que Cyclin D1²⁵. Bien que ChIP-qPCR soit une technique courante utilisée sur le terrain, il peut être difficile d’optimiser^4,,10,26. Ce protocole fournit des conseils pour éviter les pièges potentiels qui peuvent se produire lors de l’exécution de la procédure ChIP-qPCR et comprend des contrôles de qualité qui doivent être effectués sur les données.

Lorsqu’ils sont utilisés ensemble, ces trois protocoles permettent la caractérisation rigoureuse et la validation du nouveau HATi. En outre, ces méthodes offrent de nombreux avantages parce qu’elles sont faciles à exécuter, relativement bon marché et fournissent des données sur l’acétylation mondiale ainsi que régionale d’histone.

Protocol

1. Essai in vitro de HAT Préparation tamponREMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes tampon. Préparer le tampon d’essai 5x et le sulfate de Dodecyl de sodium (SDS) et conserver à -20 °C. Aliquot SDS en 1 mL aliquots. Préparer 10x gel SDS tampon de fonctionnement et 10x TBST et stocker à température ambiante. Préparer le tampon de transfert 1x et conserver à 4 °C.ATTENTION : Vérifiez la fiche de données de sécurité pour…

Representative Results

L’essai in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) peut être employé pour sonder pour des composés qui inhibent l’activité de p300 HAT vers un substrat d’histone. La figure 1A fournit un schéma expérimental pour l’essai HAT. L’acide anacardique, un HATi3,38connu, a été utilisé dans ce test dans une gamme de concentration de 12,5 à 100 μM. À 100 μM, l’acide anacardique descend par la p300 catalysé l?…

Discussion

Lysine acétyltransférases (KATs) acetylate plusieurs résidus de lysine sur les queues d’histone et les facteurs de transcription pour réguler la transcription^{génique 2,3}. Les travaux des deux dernières décennies ont révélé que les KAT, tels que CBP/p300, PCAF et GCN5, interagissent avec les facteurs de transcription oncogène et aident à stimuler la croissance tumorale dans plusieurs types de tumeurs solides^4,<sup c…

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2