תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון
Summary
מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.
Abstract
לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילציה זליזה של שאריות לינזין על היסטונים וחלבונים אחרים לווסת דינמיקה כרומטין וביטוי גנים. KATs, כגון CBP/p300, נמצאים תחת חקירה אינטנסיבית כיוקדים טיפוליים בשל תפקידם הקריטי בגידולים של סוגי סרטן מגוונים. הפיתוח של מעכבי מולקולה קטנה רומן מיקוד התפקוד אצטילטרנספראז histone (HAT) של KATs הוא מאתגר ודורש תסרוקות חזקות שיכולות לאמת את הספציפיות והעוצמה של מעכבים פוטנציאליים.
מאמר זה מתאר צינור של שלוש שיטות המספקות אימות קפדני במבחנה עבור מעכבי HAT חדשניים (HATi). שיטות אלה כוללות צינור הבדיקה כובע אסיי, כרומטין Hyperacetylation עיכוב (ChHAI) אסיא, ו PCR כמותי חיסוני כרומטין (ChIP-qPCR). ב-HAT ASSay, ה-HATs הרקומביננטיים מצופים בהסטונים בתגובה למבחנה, ומאפשרים אצטילציה של שאריות לינזין ספציפיות על זנבות האבן. תגובה זו יכולה להיות חסומה על ידי HATi ואת הרמות היחסיות של אצטילציה היסטון ספציפית לאתר ניתן למדוד באמצעות immunoblotting. מעכבים שזוהו ב-HAT Assay צריכים להיות מאושרים בסביבה הסלולרית.
אסיי ChHAI משתמש immunoblotting למסך עבור הרומן HATi כי להקטין את hyperacetylation חזק של היסטונים המושרה על ידי מעכב deacetylase histone (HDACi). התוספת של HDACi הוא מועיל כי רמות בסיס של אצטילציה histone יכול להיות קשה לזהות באמצעות immunoblotting.
ה-HAT ו-ChHAI מודדים שינויים גלובליים באצטילציה של היסטון, אך אינם מספקים מידע אודות אצטילציה באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, ChIP-qPCR משמש כדי לחקור את ההשפעות של HATi על רמות אצטילציה histone באלמנטים רגולטוריים גנים. זה מושג באמצעות פירוק חיסוני סלקטיבי של תסביכות היסטון-DNA וניתוח של ה-DNA המטוהר באמצעות qPCR. יחד, שלוש האמורות הללו מאפשרות אימות זהיר של הספציפיות, העוצמה והמנגנון של הפעולה של הרומן HATi.
Introduction
לייסין אצטילtransferases (KATs) לדלל את האצטילציה של שאריות לייסין על חלבונים histone ולאהיסטון 1,,2,,3,,4. מחקרים אחרונים מגלים כי KATs ותפקוד אצטילטרנספראז שלהם יכול לקדם צמיחה גידול מוצק4,5,6,7,8,9. לדוגמה, חלבון מחייב CREB (CBP)/p300 הם שני KATs פרלוגים המסדירים מסלולי איתות רביםבסרטן 2,3. CBP/p300 יש פונקציה אצטילטרנספראז היסטון מאופיינת היטב (HAT) ללקט את Histone 3 ליסין 27 אצטילציה (H3K27ac)2,,4,,5,,10,,11, סמן חשוב עבור משפרי פעיל, אזורי קידום ותעתוקגנים פעיל 12,,13,,14. CBP/p300 לשמש כמפעילים שותף קריטי עבור נתיבי איתות פרו-צמיחה בגידולים מוצקים על ידי הפעלת שעתוק של אונקוגנים באמצעות אצטילציה של היסטון ותמלולגורמים אחרים 4,,9,,15,16,,17,18. בשל תפקידם בהתקדמות הגידול, CBP/p300 ו KATs אחרים נמצאים תחת חקירה לפיתוח מעכבי רומן החוסמים את הפונקציה האונקוגניתשלהם 4,,5,6,,7,8,,9,,18,,19,,20. A-485 ו GNE-049 מייצגים שני ניסיונות מוצלחים לפתח מעכבים חזקים וספציפיים עבור CBP/p3004,9. מעכבים נוספים נמצאים כעת תחת חקירה עבור CBP/p300 ו KATs אחרים.
האיכות של מעכבי KAT שתוארו קודם לכן (KATi) נקרא בשאלה, עם מעכבים רבים להשוויץ השפעות היעד ואפיון גרוע21. לכן, אפיון קפדני ואימות של מועמדים לסמים חדשניים חיוני לפיתוח של בדיקות כימיות באיכות גבוהה. להלן שלושה פרוטוקולים הנוהרים צינור לסינון ומאמתים בקפדנות את העוצמה והספנות של הרומן KATi, עם דגש ספציפי על עיכוב פונקציית HAT (HATi) של KATs. CBP/p300 והמעכבים שלהם משמשים כדוגמאות, אך פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים עבור KATs אחרים בעלי פונקציית HAT7.
הפרוטוקול הראשון הוא אצטילטרנספראז היסטון במבחנה (HAT) תסיסה המשתמשת p300 רקומביננטי מטוהרים והישטונים בתגובה מבוקרת צינור. תוואי זה הוא פשוט לביצוע, הוא חסכוני, ניתן להשתמש בו כדי לסנן תרכובות בהגדרת תפוקה נמוכה, ואינו דורש חומרים רדיואקטיביים. בפרוטוקול זה, p300 קתליציה רקומביננטי אצטילציה ליאזין על זנבות histone במהלך תקופת דגירה קצרה ואת רמות האצטילציה histone נמדדים באמצעות נהלי אימונובולוט סטנדרטיים. התגובה האנזימטית יכולה להתבצע בנוכחות או בהיעדר מעכבי CBP/p300 כדי לסנן עבור תרכובות להפחית אצטילציה histone. בנוסף, ניתן להשתמש ב-HAT כדי לוודא אם תרכובות חדשניות הן סלקטיביות עבור CBP/p300 על-ידי הערכת פעילותן מול KAT מטוהרים אחרים, כגון PCAF. Assay כובע הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת מעכבי רומן בשל הפשטות שלה, עלות נמוכה, ואת היכולת לקבוע את העוצמה / לקטיביות של מעכב. אכן, פרוטוקול זה משמש לעתים קרובות בספרות כמסכים במבחנה5,10. עם זאת, מעכבים שזוהו ב- HAT assay לא תמיד יעילים בתרבות התא כי תגובת מבחנה היא הרבה יותר פשוטה מאשר מערכת תא חי. לכן, זה חיוני כדי לאפיין מעכבים נוספים בניסויים תרבות התא22,23.
הפרוטוקול השני בצינור הוא עיכוב Hyperacetylation כרומטין (ChHAI) אסה. זה תא מבוסס assay מנצל מעכבי deacetylase histone (HDACi) ככלי היסטונים hyperacetylate בכרומטין לפני דגירה שיתופית עם HATi24. אצטילציה היסטון בסיס יכול להיות נמוך בתרבות התא, מה שהופך את זה קשה בדיקה באמצעות immunoblotting ללא תוספת של HDACi כדי להגדיל את האצטילציה. מטרת ההסדה ChHAI היא לזהות את הרומן HATi שיכול להקטין את העלייה באצטילציה היסטון הנגרמת על ידי עיכוב HDAC. היתרונות של אסיי זה כוללים את העלות הנמוכה שלה, קלות יחסית לבצע, ואת השימוש בתאים בתרבות, אשר מספק רלוונטיות פיזיולוגית יותר מאשר צינור הבדיקה HAT assay. בדומה ל- HAT assay, פרוטוקול זה משתמש ב- immunoblotting סטנדרטי לאיסוף נתונים.
ASSay HAT ו ChHAI לספק נתונים על העוצמה של תרכובות חדשניות לעיכוב אצטילציה histone העולמי, אבל אינם מספקים תובנה כיצד תרכובות אלה משפיעות על שינויים באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, הפרוטוקול הסופי, כרומטין Immunoprecipitation-כמוות פולימראז תגובת שרשרת (ChIP-qPCR) הוא ניסוי תרבות התא החוקר אינטראקציות DNA-חלבון באזורים ספציפיים של הגנום. בפרוטוקול ChIP, כרומטין הוא crosslinked כדי לשמר אינטראקציות חלבון DNA. הכרומטין מופק לאחר מכן מתאי ותסביך חלבון ה-DNA עובר פירוק חיסוני סלקטיבי עבור חלבון של עניין (למשל, באמצעות נוגדן ספציפי עבור H3K27ac). לאחר מכן ה-DNA מטוהר וניתח באמצעות qPCR. לדוגמה, ChIP-qPCR יכול לשמש כדי לקבוע אם רומן HATi downregulates אצטילציה histone באונקוגנים בודדים, כגון Cyclin D125. בעוד ChIP-qPCR היא טכניקה נפוצה בשימוש בתחום, זה יכול להיות קשה לייעל4,10,26. פרוטוקול זה מספק עצות למניעת מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הליך ChIP-qPCR וכולל בדיקות בקרת איכות שיש לבצע בנתונים.
כאשר נעשה שימוש יחד, שלושת הפרוטוקולים הללו מאפשרים אפיון קפדני ואימות של הרומן HATi. בנוסף, שיטות אלה מציעות יתרונות רבים כי הם קלים לביצוע, זול יחסית ולספק נתונים על אצטילציה histone גלובלית, כמו גם אזורית.
Protocol
Representative Results
Discussion
לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילאט כמה שאריות ליאזין על זנבות histone ותמלול גורמים לווסתשעתוק גנים 2,,3. עבודה בשני העשורים האחרונים חשפה כי KATs, כגון CBP/p300, PCAF ו GCN5, אינטראקציה עם גורמי שעתוק oncogenic ולעזור להניע גידולים במספר סוגיגידול מוצק 4,<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ג’יימס ואסתר קינג תוכנית מחקר ביו רפואי (6JK03 ו 20K07), ו Bankhead-Coley סרטן תוכנית מחקר (4BF02 ו 6BC03), פלורידה מחלקת הבריאות, פלורידה סרטן השד הקרן, ו UF בריאות סרטן מרכז. בנוסף, ברצוננו להודות לד”ר זכריה אוסקינג וד”ר אנדריאה לין על תמיכתם במהלך תהליך הפרסום.
Materials
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
- Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
- Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
- Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Recherche en cancérologie. 77 (20), 5564-5575 (2017).
- Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
- Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
- Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
- Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
- Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Recherche en cancérologie. 74 (6), 1870-1880 (2014).
- Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
- Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
- Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
- Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
- Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
- Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
- Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
- Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
- Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
- Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
- Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
- Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
- Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
- ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
- Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
- Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute – University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
- Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
- Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
- Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
- Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
- Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
- Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Recherche en cancérologie. 61 (3), 931-934 (2001).
- Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
- Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).
