ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ
Summary
ヒストンアセチルトランスビシ酵素(HAT、リジンアセチルトランスビセラーゼとも呼ばれる)の阻害剤は、CBP/p300などの、癌を治療するための潜在的な治療薬です。しかし、これらの阻害剤を検証するための厳格な方法が必要です。検証のための3つのin vitro方法には、組換えアセチルトランスファー酵素によるHATアッセイ、細胞培養におけるヒストンアセチル化のための免疫ブロット法、およびChIP-qPCRが含まれる。
Abstract
リジンアセチルトランスビセラーゼ(KATs)は、ヒストンや他のタンパク質上のリジン残基のアセチル化を触媒し、クロマチンのダイナミクスと遺伝子発現を調節します。CBP/p300などのKATは、多様な癌の腫瘍形成における重要な役割のために、治療標的として激しい調査を受けている。KASのヒストンアセチルトランスビセラーゼ(HAT)機能を標的とした新しい低分子阻害剤の開発は困難であり、潜在的な阻害剤の特異性および効力を検証できる堅牢なアッセイが必要である。
この記事では、新しい HAT 阻害剤 (HATi) に対して厳密な in vitro 検証を提供する 3 つのメソッドのパイプラインについて概説します。これらの方法には、試験管HATアッセイ、クロマチンハイアセチル化阻害(ChHAI)アッセイ、クロマチン免疫沈降定量PCR(ChIP-qPCR)が含まれる。HATアッセイでは、組換えHATは試験管反応でヒストンでインキュベートされ、ヒストンテール上の特定のリジン残基のアセチル化を可能にする。この反応はHATiによってブロックすることができ、部位特異的ヒストンアセチル化の相対的なレベルは、免疫ブロット法を介して測定することができる。HATアッセイで同定された阻害剤は、細胞環境で確認する必要があります。
ChHAIアッセイは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)によって誘発されるヒストンの堅牢な過アセチル化を減衰させる新しいHATiをスクリーニングするために免疫ブロッティングを使用します。ヒストンアセチル化の基底レベルは免疫ブロッティングを介して検出することが困難であり得るので、HDACiの添加は有用である。
HATおよびChHAIアッセイはヒストンアセチル化の世界的な変化を測定するが、特定のゲノム領域におけるアセチル化に関する情報は提供しない。したがって、ChIP-qPCRは、遺伝子調節要素におけるヒストンアセチル化レベルに対するHATiの影響を調べるのに使用される。これはヒストンDNA複合体の選択的免疫沈降とqPCRを介した精製されたDNAの分析によって達成される。これら3つのアッセイは、一緒に、新しいHATiの特異性、効力、および作用機序を慎重に検証することを可能にする。
Introduction
リジンアセチルトランスバシラーゼ(KATs)は、ヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質1、2、3、42,の両方にリジン残基1のアセチル化を触媒する。3,4最近の研究では、KATとそのアセチルトランスファーゼ機能が固形腫瘍の成長を促進できることを明らかに4、5、6、7、8、9 。,5,6,7,8,9例えば、CREB結合タンパク質(CBP)/p300は、癌2,33における多数のシグナル伝達経路を調節する2つのパラパスKAである。CBP/p300はヒストンアセチルトランスファー酵素(HAT)機能をよく特徴付け、ヒストン3リシン27アセチル化(H3K27ac)2、4、5、10、11、活性エンハンサー、プロモーター領域および活性遺伝子転写2,4,5,10,1112、13、1413,の重要12なマーカーを有する。14CBP/p300は、ヒストンおよび他の転写,因子,44、9、15、16、17、189,のアセチル化を介して腫瘍遺伝子の転写を活性化することによって16、17固形腫瘍における増殖促進シグナル伝達経路の重要な共活性化因子として機能する。1518腫瘍の進行におけるその役割のために、CBP/p300および他のKATは、発癌機能,,,,,,4、5、6、7、8、9、18、19、205,6を遮断する新規阻害剤の開発のために調査中である。4789181920A-485とGNE-049は、CBP/p30044,99に対する強力かつ特異的な阻害剤の開発に成功した2つの試みを表しています。CBP/p300および他のKATに対して現在、追加の阻害剤が調査中である。
先に説明したKAT阻害剤(KATi)の品質が問われ、多くの阻害剤が標的効果と悪い特性評価21を示している。そのため、高品質な化学プローブの開発には、新しい薬剤候補の厳密な特性評価と検証が不可欠です。ここでは、新しいKATiの効力と特異性をスクリーニングし、厳密に検証するためのパイプラインを形成する3つのプロトコルがあり、KATsのHAT機能(HATi)を阻害することに特に焦点を当てています。CBP/p300とその阻害剤が例として使用されていますが、これらのプロトコルは、HAT関数7を持つ他のKATに適応することができます。
第1のプロトコルは、精製された組換えp300およびヒストンを制御試験管反応に利用するインビトロヒストンアセチルトランスファー酵素(HAT)アッセイである。このアッセイは、実行が簡単で、費用対効果が高く、低スループット設定で化合物をスクリーニングするために使用することができ、放射性物質を必要としません。このプロトコルでは、組換えp300は、短いインキュベーション期間中にヒストン尾部のリジンアセチル化を触媒し、ヒストンアセチル化のレベルを標準的な免疫ブロッティング手順を使用して測定する。酵素反応は、ヒストンアセチル化を減少させる化合物をスクリーニングするCBP/p300阻害剤の存在または不在で行うことができる。さらに、HATアッセイは、PCAFなどの他の精製KATに対する活性を評価することによって、新規化合物がCBP/p300に選択的であるかどうかを検証するために使用することができる。HATアッセイは、そのシンプルさ、低コスト、および阻害剤の効力/選択性を決定する能力のために、新しい阻害剤を調査するための優れた出発点です。実際、このプロトコルは、多くの場合、in vitroスクリーン55、1010として文献で使用されています。しかしながら、HATアッセイで同定された阻害剤は、試験管反応が生細胞系よりはるかに単純であるため、細胞培養において必ずしも有効であるとは限らない。したがって、細胞培養実験22,23,23において阻害剤をさらに特徴付ける必要がある。
パイプラインの第2のプロトコルは、クロマチンハイパーアセチル化阻害(ChHAI)アッセイである。この細胞ベースアッセイは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)をHATi24と共培養する前にクロマチン中のヒストンを高アセチレートするツールとして利用する。基底ヒストンアセチル化は細胞培養において低く、アセチル化を増加させるためにHDACiを添加せずに免疫ブロット法を介してプローブすることが困難になる。ChHAIアッセイの目的は、HDAC阻害によって引き起こされるヒストンアセチル化の増加を減衰させることができる新しいHATiを同定することです。このアッセイの利点は、その低コスト、実行する比較的容易さ、および試験管HATアッセイよりも生理学的関連性を提供する培養中の細胞の使用を含む。HATアッセイと同様に、このプロトコルはデータ収集に標準免疫ブロット法を使用します。
HATおよびChHAIアッセイは、グローバルヒストンアセチル化を阻害するための新規化合物の効力に関するデータを提供するが、これらの化合物が特定のゲノム領域における修飾にどのような影響を与えるかについての洞察を提供しない。そこで、最終プロトコルであるクロマチン免疫沈降定量ポリメラーゼ連鎖反応(ChIP-qPCR)は、ゲノムの特定の領域におけるDNAタンパク質相互作用を調べる細胞培養実験である。ChIP プロトコルでは、クロマチンは、DNA とタンパク質の相互作用を維持するために架橋されます。次いで、クロマチンを細胞から抽出し、DNA-タンパク質複合体は目的のタンパク質に対して選択的な免疫沈降を受ける(例えば、H3K27acに特異的な抗体を使用)。次いで、dnaを精製し、qPCRを用いて分析します。例えば、ChIP-qPCRは、Cyclin D125のような個々の腫瘍遺伝子におけるヒストンアセチル化を新規HATiがダウンリデンスするかどうかを判断するために使用することができる。ChIP-qPCR はフィールドで使用される一般的な手法ですが、4、10、26を最適化することは困難な場合があります。このプロトコルは、ChIP-qPCR 手順の実行中に発生する可能性のある落とし穴を回避するためのヒントを提供し、データに対して実行する必要がある品質管理チェックを含んでいます。
これら3つのプロトコルを併用すると、新しいHATiの厳密な特性評価と検証が可能になります。さらに、これらの方法は、実行が簡単で、比較的安価であり、グローバルおよび地域ヒストンアセチル化に関するデータを提供するため、多くの利点を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
リジンアセチルトランスビセラーゼ(KATs)は、ヒストンの尾部および転写因子上のリジン残基を数個アセチル化して、遺伝子転写22,33を調節する。過去20年間の作業は、CBP / p300、PCAFおよびGCN5のようなKATが発癌性転写因子と相互作用し、いくつかの固形腫瘍タイプ44、5、9、15、16、17、185,<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ジェームズとエステルキング生物医学研究プログラム(6JK03と20K07)、バンクヘッドコーリーがん研究プログラム(4BF02と6BC03)、フロリダ州保健省、フロリダ乳がん財団、UF健康がんセンターからの助成金によって支えられました。また、公開プロセス中のザカリー・オスキング博士とアンドレア・リン博士のサポートに感謝します。
Materials
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
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