Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Summary

Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

Abstract

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histonen und anderen Proteinen, um die Chromatindynamik und Genexpression zu regulieren. KATs, wie CBP/p300, werden aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Tumorgenese verschiedener Krebsarten intensiv als therapeutische Ziele untersucht. Die Entwicklung neuartiger kleiner Molekülinhibitoren, die auf die Histonacetyltransferase(HAT)-Funktion von KATs abzielen, ist anspruchsvoll und erfordert robuste Tests, die die Spezifität und Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren validieren können.

Dieser Artikel skizziert eine Pipeline von drei Methoden, die eine strenge In-vitro-Validierung für neuartige HAT-Hemmer (HATi) bieten. Diese Methoden umfassen einen Testfürhorn HAT, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay, und Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Im HAT-Test werden rekombinante HATs mit Histonen in einer Reagenzreaktion inkubiert, was eine Acetylierung spezifischer Lysinrückstände an den Histonschwänzen ermöglicht. Diese Reaktion kann durch ein HATi blockiert werden und die relativen Niveaus der standortspezifischen Histonacetylierung können mittels Immunoblotting gemessen werden. Inhibitoren, die im HAT-Test identifiziert wurden, müssen in der zellulären Umgebung bestätigt werden.

Der ChHAI-Assay verwendet Immunoblotting, um neuartige HATi zu prüfen, die die robuste Hyperacetylierung von Histonen dämpfen, die durch einen Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) induziert wird. Die Zugabe eines HDACi ist hilfreich, da basalen Niveaus der Histon-Acetylierung kann schwierig sein, über Immunoblotting zu erkennen.

Die HAT- und ChHAI-Assays messen globale Veränderungen in der Histonacetylierung, liefern jedoch keine Informationen über die Acetylierung in bestimmten genomischen Regionen. Daher wird ChIP-qPCR verwendet, um die Auswirkungen von HATi auf Histon-Acetylierungsniveaus bei Gen-Regulierungselementen zu untersuchen. Dies wird durch selektive Immunpräzipitation von Histon-DNA-Komplexen und Analyse der gereinigten DNA durch qPCR erreicht. Zusammen ermöglichen diese drei Assays eine sorgfältige Validierung der Spezifität, Potenz und des Wirkmechanismus neuartiger HATi.

Introduction

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histon- und Nicht-Histonproteinen^1,2,3,4. Jüngste Forschung zeigt, dass KATs und ihre Acetyltransferase-Funktion solides^{Tumorwachstum}4^,5,6,7,8,9fördern kann. Zum Beispiel sind CREB-bindendes Protein (CBP)/p300 zwei paralogende KATs, die zahlreiche Signalwege bei Krebs regulieren^2,3. CBP/p300 haben eine gut charakterisierte Histon-Acetyltransferase (HAT)-Funktion und katalysieren Histon 3 Lysin 27 Acetylierung (H3K27ac)^2,4,5,10,11, ein wichtiger Marker für aktive Enhancer, Promotorregionen und aktive Gentranskription^12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische Co-Aktivatoren für wachstumsfördernde Signalwege bei soliden Tumoren durch Aktivierung der Transkription von Onkogenen durch Acetylierung von Histonen und anderen Transkriptionsfaktoren^{4,9,15,16,17,18}. Aufgrund ihrer Rolle bei der Tumorprogression werden CBP/p300 und andere KATs für die Entwicklung neuartiger Inhibitoren untersucht, die ihre onkogene Funktion blockieren^{4,5,6,7,8,9,18,19,20}. A-485 und GNE-049 stellen zwei erfolgreiche Versuche dar, potente und spezifische Inhibitoren für CBP/p300^4,9zu entwickeln. Weitere Inhibitoren werden derzeit für CBP/p300 und andere KATs untersucht.

Die Qualität der zuvor beschriebenen KAT-Hemmer (KATi) wird in Frage gestellt, wobei viele Inhibitoren Zielwirkungen und eine schlechte Charakterisierung zeigen²¹. Daher ist eine strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger Wirkstoffkandidaten für die Entwicklung hochwertiger chemischer Sonden unerlässlich. Hier sind drei Protokolle beschrieben, die eine Pipeline zum Screening bilden und die Wirksamkeit und Spezifität neuartiger KATi streng validieren, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Hemmung der HAT-Funktion (HATi) von KATs. CBP/p300 und ihre Inhibitoren werden als Beispiele verwendet, aber diese Protokolle können für andere KATs angepasst werden, die eine HAT-Funktion haben⁷.

Das erste Protokoll ist ein In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay, der gereinigte rekombinante p300 und Histone in einer kontrollierten Reagenzröhrenreaktion verwendet. Dieser Test ist einfach durchzuführen, ist kostengünstig, kann verwendet werden, um Verbindungen in einer niedrigen Durchsatzeinstellung zu überprüfen, und erfordert keine radioaktiven Materialien. In diesem Protokoll werden rekombinante p300 Katalysen Lysin-Acetylierung an Histonschwänzen während einer kurzen Inkubationszeit und die Konzentrationen der Histonacetylierung mit Standard-Immunoblotting-Verfahren gemessen. Die enzymatische Reaktion kann in Gegenwart oder Abwesenheit von CBP/p300-Inhibitoren durchgeführt werden, um auf Verbindungen zu überprüfen, die die Histonacetylierung reduzieren. Darüber hinaus kann der HAT-Test verwendet werden, um zu überprüfen, ob neuartige Verbindungen selektiv für CBP/p300 sind, indem ihre Aktivität mit anderen gereinigten KATs, wie PCAF, bewertet wird. Der HAT-Test ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Untersuchung neuartiger Inhibitoren aufgrund seiner Einfachheit, niedrigen Kosten und der Fähigkeit, die Wirksamkeit/Selektivität eines Inhibitors zu bestimmen. Tatsächlich wird dieses Protokoll in der Literatur oft als In-vitro-Bildschirm^{verwendet 5,10}. Jedoch, Inhibitoren im HAT-Assay identifiziert sind nicht immer wirksam in der Zellkultur, weil eine Reagenzglasreaktion ist viel einfacher als ein lebendes Zellsystem. Daher ist es wichtig, Inhibitoren in Zellkulturexperimenten weiter zu charakterisieren^22,23.

Das zweite Protokoll in der Pipeline ist der Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay. Dieser zellbasierte Assay nutzt Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi) als Werkzeug, um Histonen in Chromatin vor der Co-Inkubation mit einem HATi²⁴zu hyperacetylate Histone in Chromatin. Basal-Histon-Acetylierung kann in der Zellkultur niedrig sein, was es schwierig macht, über Immunoblotting zu sondieren, ohne dass ein HDACi hinzugefügt wird, um die Acetylierung zu erhöhen. Der Zweck des ChHAI-Assays ist es, neuartige HATi zu identifizieren, die die Zunahme der Histonacetylierung durch HDAC-Hemmung abschwächen können. Die Vorteile dieses Tests sind seine niedrigen Kosten, relative Leichtigkeit zu erfüllen, und die Verwendung von Zellen in der Kultur, die mehr physiologische Relevanz als das Reagenzglas HAT Assay bietet. Ähnlich wie der HAT-Test verwendet dieses Protokoll Standard-Immunoblotting für die Datenerfassung.

Die HAT- und ChHAI-Assays liefern Daten über die Wirksamkeit neuartiger Verbindungen zur Hemmung der globalen Histonacetylierung, geben aber keinen Einblick, wie diese Verbindungen Modifikationen in bestimmten genomischen Regionen beeinflussen. Daher ist das endgültige Protokoll, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR), ein Zellkulturexperiment, das DNA-Protein-Wechselwirkungen an bestimmten Regionen des Genoms untersucht. Im ChIP-Protokoll ist Chromatin vernetzt, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Das Chromatin wird dann aus Zellen extrahiert und der DNA-Protein-Komplex erhält eine selektive Immunpräzipitation für das Protein von Interesse (z.B. mit einem Antikörper speziell für H3K27ac). Die DNA wird dann gereinigt und mit qPCR analysiert. Beispielsweise kann ChIP-qPCR verwendet werden, um festzustellen, ob ein neuartiges HATi die Histonacetylierung bei einzelnen Onkogenen, wie Cyclin D1²⁵, herunterreguliert. Während ChIP-qPCR eine gängige Technik ist, die im Feld verwendet wird, kann es schwierig sein,^4,10,26zu optimieren. Dieses Protokoll enthält Tipps zur Vermeidung potenzieller Fallstricke, die bei der Ausführung der ChIP-qPCR-Prozedur auftreten können, und enthält Qualitätskontrollen, die für die Daten durchgeführt werden sollten.

Zusammen ermöglichen diese drei Protokolle die strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger HATi. Darüber hinaus bieten diese Methoden viele Vorteile, da sie einfach durchzuführen, relativ günstig sind und Daten über globale sowie regionale Histon-Acetylierung liefern.

Protocol

1. In-vitro-HAT-Test PuffervorbereitungHINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Pufferrezepte. 5x Assaypuffer und 6x Natriumdodecylsulfat (SDS) vorbereiten und bei -20 °C lagern. Aliquot SDS in 1 ml Aliquots. 10x SDS-Gellaufpuffer und 10x TBST vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern. 1x Transferpuffer vorbereiten und bei 4 °C lagern.VORSICHT: Überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf alle in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien. SDS, DTT…

Representative Results

Der In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay kann verwendet werden, um nach Verbindungen zu suchen, die die p300 HAT-Aktivität in Richtung eines Histonsubstrats hemmen. Abbildung 1A enthält einen experimentellen Schaltplan für den HAT-Test. Anacardinsäure, eine bekannte HATi3,38, wurde in diesem Test in einem Konzentrationsbereich von 12,5-100 m verwendet. Bei 100 m reguliert Anacardinsäure p300 katalysierte Histon-Acetylie…

Discussion

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) Acetylat mehrere Lysinrückstände an Histonschwänzen und Transkriptionsfaktoren zur Regulierung der Gentranskription^2,3. Die Arbeit der letzten zwei Jahrzehnte hat gezeigt, dass KATs, wie CBP/p300, PCAF und GCN5, mit onkogenen Transkriptionsfaktoren interagieren und dazu beitragen, das Tumorwachstum in mehreren soliden Tumortypen^4,5,9<su…

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2