Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона
Summary
Ингибиторы ацетилтрансферазы гистона (АТ, также известный как лизин ацетилтрансферазы), такие как CBP/p300, являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения рака. Однако необходимы строгие методы проверки этих ингибиторов. Три метода in vitro для проверки включают анализы HAT с рекомбинантными ацетилтрансферазами, иммуноблоттинг для ацетилирования гистона в клеточной культуре и ChIP-qPCR.
Abstract
Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина на гистонах и других белках для регулирования динамики хроматина и экспрессии генов. KATs, такие как CBP/p300, находятся под интенсивным исследованием в качестве терапевтических целей из-за их критической роли в tumorigenesis различных видов рака. Разработка новых малых молекул ингибиторы ориентации гистона ацетилтрансферазы (HAT) функция KATs является сложной задачей и требует надежных анализов, которые могут проверить специфику и потенцию потенциальных ингибиторов.
В этой статье излагается конвейер из трех методов, которые обеспечивают строгую проверку in vitro для новых ингибиторов HAT (HATi). Эти методы включают в себя пробирку HAT анализ, хроматин гиперацетилирования Ингибирование (ChHAI) анализ, и хроматин иммунопреципиентно-количественный ПЦР (ChIP-qPCR). В HAT анализ, рекомбинантные HATs инкубируются с гистонами в реакции пробирки, что позволяет ацетилирования конкретных остатков лизина на хвостах гистона. Эта реакция может быть заблокирована HATi и относительные уровни сайта конкретных ацетилирования гистон может быть измерена с помощью иммуноблоттинга. Ингибиторы, выявленные в анализе HAT, должны быть подтверждены в клеточной среде.
ChHAI анализ использует иммуноблоттинг для экрана для романа HATi, которые занижают надежные гиперацетилирования гистонов индуцированных ингибитором диацетилазы гистона (HDACi). Добавление HDACi полезно, потому что базальные уровни ацетилирования гистон может быть трудно обнаружить с помощью иммуноблоттинга.
Анализы HAT и ChHAI измеряют глобальные изменения в ацетилляции гистона, но не предоставляют информацию об ацетиляции в конкретных геномных регионах. Таким образом, ChIP-qPCR используется для исследования влияния HATi на уровни ацетилирования гистона в генных регуляторных элементах. Это достигается путем селективной иммунопреципиентации гистон-ДНК комплексов и анализа очищенной ДНК с помощью qPCR. Вместе эти три анализа позволяют тщательно продумать специфику, потенцию и механизм действия романа HATi.
Introduction
Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина как на гистоне, так и на неистоновыхбелках 1,,2,,3,,4. Недавние исследования показывают, что KATs и их функции ацетилтрансферазы может способствоватьтвердому росту опухоли 4,,5,,6,,7,,8,,9. Например, CREB-связывающий белок (CBP)/p300 являются двумя паралогичными КАТ, которые регулируют многочисленные сигнальныепути при раке 2,,3. CBP/p300 имеют хорошо охарактеризованные гистон ацетилтрансферазы (HAT) функции и катализ Гистон 3 Лизин 27 ацетилляции (H3K27ac)2,4,5,10,11, важным маркером для активных усилителей, промоутер регионов и активной транскрипции генов12,13,14. CBP/p300 служить в качестве критических соактиваторов для про-рост сигнализации путей в твердых опухолей путем активации транскрипции онкогенов через ацетилирование гистонов и других факторов транскрипции4,9,15,16,17,18. В связи с их ролью в прогрессировании опухоли, CBP/p300 и другие KATs находятся под следствием для разработки новых ингибиторов, которые блокируют их онкогенную функцию4,,5,,6,,7,,8,,9,,18,,19,,20. A-485 и GNE-049 представляют собой две успешные попытки разработать мощные и специфические ингибиторы для CBP/p3004,9. В настоящее время проводятся дополнительные исследования в отношении CBP/p300 и других KATs.
Качество ранее описанных ингибиторов KAT (KATi) в настоящее время под вопросом, со многими ингибиторами демонстрируя целевые эффекты и плохой характеристикой21. Поэтому строгая характеристика и проверка новых кандидатов на наркотики имеет важное значение для разработки высококачественных химических зондов. Здесь изложены три протокола, которые образуют конвейер для скрининга и тщательной проверки потенции и специфичности новых KATi, с конкретным акцентом на ингибирование функции HAT (HATi) KATs. CBP/p300 и их ингибиторы используются в качестве примеров, но эти протоколы могут быть адаптированы для других KATs, которые имеют функцию HAT7.
Первый протокол является in vitro гистон ацетилтрансферазы (HAT) анализ, который использует очищенные рекомбинантные p300 и гистоны в контролируемой реакции пробирки. Этот анализ прост в работе, является экономически эффективным, может быть использован для проверки соединений в условиях низкой пропускной способности, и не требует радиоактивных материалов. В этом протоколе рекомбинантный p300 катализин ацетилирования лизина на хвостах гистона в течение короткого инкубационный период и уровни ацетилирования гистона измеряются с помощью стандартных иммуноблоттинговых процедур. Ферментативная реакция может быть выполнена при наличии или отсутствии ингибиторов CBP/p300 для проверки на наличие соединений, которые уменьшают ацетилирование гистона. Кроме того, анализ HAT может быть использован для проверки того, являются ли новые соединения селективными для CBP/p300, оценивая их активность по отношению к другим очищенным KATs, таким как PCAF. Анализ HAT является отличной отправной точкой для изучения новых ингибиторов из-за его простоты, низкой стоимости и способности определять потенцию/селективность ингибитора. Действительно, этот протокол часто используется в литературе в качестве экрана in vitro5,10. Тем не менее, ингибиторы, выявленные в анализе HAT, не всегда эффективны в клеточной культуре, потому что реакция пробирки намного проще, чем живая клеточная система. Поэтому необходимо дополнительно охарактеризовать ингибиторы в экспериментах клеточной культуры22,,23.
Вторым протоколом в трубопроводе является анализ ингибирования гиперацетилирования хроматина (CHHAI). Эта клетка на основе анализа использует ингибиторы диацетилазы гистона (HDACi) в качестве инструмента для гиперацетилата гистонов в хроматине до совместного инкубации с HATi24. Базальный гистон ацетилляции может быть низким в клеточной культуре, что делает его трудно зондировать с помощью иммуноблотинга без добавления HDACi для увеличения ацетилирования. Цель анализа ChHAI заключается в выявлении новых HATi, которые могут затухать увеличение ацетилирования гистон, вызванного ингибированием HDAC. Преимущества этого анализа включают его низкую стоимость, относительную легкость для выполнения, и использование клеток в культуре, которая обеспечивает более физиологическую актуальность, чем пробирка HAT анализа. Как и в hat-анализе, в этом протоколе используется стандартный иммуноблоттинг для сбора данных.
Анализы HAT и ChHAI предоставляют данные о потенции новых соединений для ингибирования глобального ацетилирования гистонов, но не дают представления о том, как эти соединения влияют на модификации в конкретных геномных регионах. Таким образом, окончательный протокол, Хроматин иммунопреципиентации количественных полимеразной цепной реакции (ChIP-qPCR) является экспериментом клеточной культуры, который исследует ДНК-белковых взаимодействий в конкретных регионах генома. В протоколе ChIP хроматин пересекается для сохранения ДНК-белковых взаимодействий. Хроматин затем извлекается из клеток, а ДНК-белковый комплекс подвергается селективной иммунопреципитации для белка интереса (например, с использованием антитела, специфичного для H3K27ac). Затем ДНК очищается и анализируется с помощью qPCR. Например, ChIP-qPCR может быть использован для определения того, если роман HATi downregulates гистон ацетилирования на отдельных онкогенов, таких как килин D125. Хотя ChIP-qPCR является общей техникой, используемой в полевых условиях, это можетбыть трудно оптимизировать 4,,10,,26. Этот протокол содержит советы по предотвращению потенциальных ловушек, которые могут возникнуть при выполнении процедуры ChIP-qPCR, и включает проверку качества, которая должна быть выполнена на данных.
При использовании вместе эти три протокола позволяют тщательной характеристики и проверки романа HATi. Кроме того, эти методы предлагают много преимуществ, поскольку они просты в работе, относительно дешевы и предоставляют данные о глобальной, а также региональной ацетилирования гистон.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лизин ацетилтрансферазы (KATs) ацетилат несколько остатков лизина на хвостах гистона и транскрипции факторовдля регулирования транскрипции генов 2,3. Работа в последние два десятилетия показала, что KATs, такие как CBP/p300, PCAF и GCN5, взаимодействуют с онкогенными…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана гранты от Джеймса и Эстер Кинг биомедицинских исследований программы (6JK03 и 20K07), и Бэнкхед-Коли онкологических исследований программы (4BF02 и 6BC03), Флорида Департамент здравоохранения, Флорида рака молочной железы Фонда, и UF health Cancer Center. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра Закари Осинкинга и д-ра Андреа Лин за их поддержку в процессе публикации.
Materials
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
- Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
- Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
- Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Recherche en cancérologie. 77 (20), 5564-5575 (2017).
- Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
- Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
- Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
- Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
- Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Recherche en cancérologie. 74 (6), 1870-1880 (2014).
- Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
- Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
- Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
- Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
- Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
- Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
- Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
- Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
- Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
- Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
- Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
- Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
- Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
- ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
- Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
- Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute – University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
- Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
- Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
- Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
- Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
- Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
- Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Recherche en cancérologie. 61 (3), 931-934 (2001).
- Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
- Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).
