히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

Summary

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

Abstract

리신 아세틸 트랜스퍼라제 (KATs)는 크로마티닌 역학 및 유전자 발현을 조절하기 위해 히스톤 및 기타 단백질에 대한 리신 잔류물의 촉매 아세틸화. CBP/p300과 같은 KAT는 다양한 암의 종양 발생에 중요한 역할때문에 치료 대상으로 강도 높은 조사를 받고 있습니다. KATs의 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제(HAT) 기능을 대상으로 하는 새로운 소분자 억제제의 개발은 도전적이며 잠재적 억제제의 특이성과 효능을 검증할 수 있는 강력한 작용이 필요합니다.

이 문서에서는 새로운 HAT 억제제(HATi)에 대한 엄격한 체외 검증을 제공하는 세 가지 방법의 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법에는 시험관 HAT 분석, 크로마티닌 고과실화 억제(ChHAI) 분석, 크로마티닌 면역 침전-정량성 PCR(ChIP-qPCR)이 포함된다. HAT 분석에서 재조합 HAT는 시험관 반응에서 히스톤으로 배양되어 히스톤 꼬리에 특정 리신 잔류물을 아세틸화할 수 있습니다. 이러한 반응은 HATi에 의해 차단될 수 있으며, 현장별 히스톤 아세틸화의 상대적 수준은 면역블로팅을 통해 측정될 수 있다. HAT 분석에서 확인된 억제제는 세포 환경에서 확인되어야 합니다.

ChHAI 분석체는 히스톤 디스틸라제 억제제(HDACi)에 의해 유도된 히스톤의 견고한 hyperacetylation을 감쇠하는 새로운 HATi를 위해 면역 블로팅을 사용합니다. HDACi의 추가는 히스톤 아세틸화의 기저 수준이 면역 블로팅을 통해 검출하기 어려울 수 있기 때문에 도움이 됩니다.

HAT 및 ChHAI 아세서는 히스톤 아세틸화의 글로벌 변화를 측정하지만 특정 게놈 지역에서 아세틸화에 관한 정보를 제공하지는 않습니다. 따라서 ChIP-qPCR은 유전자 조절 원소에서 히스톤 아세틸화 수준에 대한 HATi의 효과를 조사하는 데 사용됩니다. 이는 그의 톤-DNA 복합체의 선택적 면역 침전및 qPCR을 통해 정제된 DNA의 분석을 통해 달성된다. 이 세 가지 에세이는 함께 새로운 HATi의 특이성, 효능 및 작용 메커니즘에 대한 신중한 검증을 가능하게 합니다.

Introduction

리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 히스톤과 비히스톤 단백질^11,2,,3,,4모두에서 리신 잔류물의 아세틸화를 촉매한다. 최근 연구에 따르면 KAT와 그들의 아세틸트랜스퍼라아제 기능은 고형 종양^성장을촉진할 수 있음을^{4,5,,6,,7,,8,,9.} 예를 들어, CREB 결합 단백질(CBP)/p300은 암^2,,3에서수많은 신호 경로를 조절하는 두 개의 파라로고우스 KAT이다. CBP/p300은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 기능을 잘 특성화하고 히스톤 3 리신 27아세틸레이션(H3K27ac)^{22,4,,5,,10,,11,}활성 강화, 프로모터 영역 및 활성 유전자^{전사12,13, 14을}위한 중요한^마커를14갖는다.^, CBP/p300은 히스톤 및 기타 전사^인자의아세틸화를 통해 종양유전자의 전사를 활성화하여 고형 종양에서 의 프로 성장 신호 전달 경로를 위한 중요한 공동 활성화제로서^{4,9,15,,16,,,17,,18.} 종양 진행에 그들의 역할 때문에, CBP/p300 및 그밖 KATs는 그들의 종양원성^기능을막는 새로운 억제제의 발달을 위해 조사되고^{4,5,,6,7,77,8,,9,,18,,19,,20.} A-485 및 GNE-049는 CBP/p300^4,,9에대한 강력하고 특정 억제제개발을 성공적으로 시도한 두 가지 성공적인 시도를 나타낸다. 추가 억제제는 CBP/p300 및 그밖 KATs에 대한 현재 조사되고 있습니다.

이전에 설명된 KAT 억제제(KATi)의 품질은 많은 억제제가 표적 효과와 불량한^특성화를과시하는 것으로, 의문을 제기하고 있다. 따라서, 새로운 약물 후보의 엄격한 특성화 및 검증은 고품질화학 프로브의 개발에 필수적이다. 여기에 설명된 세 가지 프로토콜은 KAT의 HAT 기능(HATi)을 억제하는 데 중점을 두고 새로운 KATi의 효능과 특이성을 선별하고 엄격하게 검증하기 위한 파이프라인을 형성하는 세 가지 프로토콜입니다. CBP/p300 및 그 억제제는 예로 사용되지만, 이러한 프로토콜은 HAT 함수^7을갖는 다른 KAT에 맞게 조정할 수 있다.

첫 번째 프로토콜은 제어 된 시험관 반응에서 정제 된 재조합 p300 및 히스톤을 사용하는 시험관 히트톤 아세틸 트랜스퍼라제 (HAT) 분석입니다. 이 분석법은 수행하기 가 간단하고, 비용 효율적이며, 낮은 처리량 설정에서 화합물을 선별하는 데 사용할 수 있으며 방사성 물질을 필요로하지 않습니다. 이 프로토콜에서, 재조합 p300 촉매는 짧은 잠복기 동안 히스톤 꼬리에 리세틸리제이션과 히스톤 아세틸화의 수준은 표준 면역 blotting 절차를 사용하여 측정된다. 효소 반응은 CBP/p300 억제제의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있다. 또한, HAT 분석체는 PCAF와 같은 다른 정제 된 KAT에 대한 활동을 평가하여 새로운 화합물이 CBP / p300에 대한 선택적지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. HAT 분석은 단순성, 저렴한 비용 및 억제제의 효능/선택성을 결정하는 능력으로 인해 새로운 억제제를 조사하기위한 훌륭한 출발점입니다. 실제로,이 프로토콜은 종종 시험관 내 화면^5,,10으로문학에 사용된다 . 그러나, HAT 분석에서 확인된 억제제는 시험관 반응이 살아있는 세포 시스템보다는 훨씬 간단하기 때문에 세포 배양에서 항상 효과적이지는 않다. 따라서, 세포 배양^{실험(22,,23)에서}억제제의 특징을 더 특성화하는 것이 필수적이다.

파이프라인의 두 번째 프로토콜은 크로마틴 고과성 억제(ChHAI) 분석이다. 이 세포 기반 분석은 히스톤 deacetylase 억제제 (HDACi)를 HATi^24와공동 인큐베이션하기 전에 크로마틴에서 히스톤을 과대 광고하는 도구로 활용합니다. 기저 히스톤 아세틸화는 세포 배양에서 낮을 수 있으므로, 탈염을 증가시키기 위해 HDACi를 첨가하지 않고 면역 블로팅을 통해 프로브하기가 어렵다. ChHAI 분석의 목적은 HDAC 억제에 의한 히스톤 아세틸화의 증가를 감쇠시킬 수 있는 새로운 HATi를 식별하는 것입니다. 이 분석법의 장점은 낮은 비용, 수행 할 상대적 용이성 및 배양세포의 사용을 포함하며, 이는 시험관 HAT 분석보다 더 많은 생리적 관련성을 제공합니다. HAT 분석과 마찬가지로 이 프로토콜은 데이터 수집에 표준 면역 블로팅을 사용합니다.

HAT 및 ChHAI 분석서는 글로벌 히스톤 아세틸화를 억제하기 위한 새로운 화합물의 효능에 대한 데이터를 제공하지만, 이러한 화합물이 특정 게놈 영역의 수정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공하지 는 않습니다. 따라서, 최종 프로토콜, 크로마틴 면역 침전-정량적 폴리머라제 연쇄 반응(ChIP-qPCR)은 게놈의 특정 영역에서 DNA 단백질 상호작용을 조사하는 세포 배양 실험이다. ChIP 프로토콜에서, 크로마틴은 DNA 단백질 상호 작용을 보존하기 위하여 교차 연결됩니다. 크로마틴은 세포로부터 추출된 다음 DNA 단백질 복합체가 관심 있는 단백질에 대한 선택적 면역 침전을 겪는다(예를 들어, H3K27ac에 특이적인 항체를 사용하여). DNA는 qPCR을 사용하여 정제되고 분석됩니다. 예를 들어, ChIP-qPCR은 새로운 HATi가 Cyclin D1^25와같은 개별 종양 유전자에서 히스톤 아세틸레이션을 저하시키는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있다. ChIP-qPCR은 현장에서 사용되는 일반적인 기술이지만^4,,10,,26을최적화하기 어려울 수 있다. 이 프로토콜은 ChIP-qPCR 절차를 수행하는 동안 발생할 수 있는 잠재적인 함정을 방지하는 팁을 제공하며 데이터에서 수행해야 하는 품질 관리 검사를 포함합니다.

이 세 가지 프로토콜을 함께 사용하면 새로운 HATi의 엄격한 특성과 검증이 가능합니다. 또한 이러한 방법은 수행하기 쉽고 상대적으로 저렴하며 지역 히스톤 아세틸레이션뿐만 아니라 글로벌에 대한 데이터를 제공하기 때문에 많은 이점을 제공합니다.

Protocol

1. 체외 HAT 분석 버퍼 준비참고: 버퍼 레시피의 표 1을 참조하십시오. 5배 분석 버퍼와 6배 의 도데킬 설페이트 나트륨(SDS)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오. 알리쿼트 SDS 에서 1 mL 알리쿼트. 10x SDS 젤 러닝 버퍼와 10배 TBST를 준비하고 실온에서 보관하십시오. 1x 이송 버퍼를 준비하고 4°C에 보관하십시오.주의: 이 프로토콜에 사용되는 모?…

Representative Results

시험관 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 분석은 히스톤 기판을 향해 p300 HAT 활성을 억제하는 화합물을 탐사하는 데 사용될 수 있다. 도 1A는 HAT 분석에 대한 실험 적인 회로도를 제공합니다. 알려진 HATi3,38인아나카르산은 12.5-100 μM의 농도 범위에서 이 분석에서 활용되었다.3 100 μM에서 아나카르산 다운조절은 히스톤 3, 리신 9, 18?…

Discussion

리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 유전자^전사를조절하기 위한 히스톤 꼬리 및 전사 인자에 대한 여러 리신 잔류물을 아세틸레이트^2,3. 지난 2년간의 연구에 따르면 CBP/p300, PCAF 및 GCN5와 같은 KAT는 종양 발생 성 전사 인자와 상호 작용하고 여러 고형 종양 유형^4,,5,9,9,<sup class="xre…

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2