Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona
Summary
Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.
Abstract
Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en histonas y otras proteínas para regular la dinámica de la cromatina y la expresión génica. Los TCC, como cbP/p300, están bajo intensa investigación como dianas terapéuticas debido a su papel crítico en la tumorigenesis de diversos tipos de cáncer. El desarrollo de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a la función de la histona acetiltransferasa (HAT) de los TCA es un reto y requiere ensayos robustos que puedan validar la especificidad y potencia de los posibles inhibidores.
En este artículo se describe una canalización de tres métodos que proporcionan una validación in vitro rigurosa para nuevos inhibidores de HAT (HATi). Estos métodos incluyen un ensayo HAT de tubo de ensayo, un ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI) y PCR cuantitativo con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-qPCR). En el ensayo HAT, los HAT recombinantes se incuban con histonas en una reacción del tubo de ensayo, lo que permite la acetilación de residuos específicos de lisina en las colas de histona. Esta reacción puede ser bloqueada por un HATi y los niveles relativos de acetilación de histona específica del sitio se pueden medir a través de inmunoblotting. Los inhibidores identificados en el ensayo HAT deben ser confirmados en el entorno celular.
El ensayo ChHAI utiliza inmunoblotting para detectar nuevos HATi que atenúan la hiperacetilación robusta de las histonas inducidas por un inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi). La adición de un HDACi es útil porque los niveles basales de la acetilación de histona pueden ser difíciles de detectar a través de inmunoblotting.
Los ensayos HAT y ChHAI miden los cambios globales en la acetilación de histona, pero no proporcionan información sobre la acetilción en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, ChIP-qPCR se utiliza para investigar los efectos de HATi en los niveles de acetilación de histona en los elementos reguladores de genes. Esto se logra a través de la inmunoprecipitación selectiva de complejos histone-ADN y el análisis del ADN purificado a través de qPCR. Juntos, estos tres ensayos permiten la validación cuidadosa de la especificidad, potencia y mecanismo de acción de la nueva HATi.
Introduction
Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en proteínas histonas y no histonas1,2,3,4. Investigaciones recientes revelan que los KAT y su función acetiltransferasa pueden promover el crecimiento sólido del tumor4,5,6,7,8,9. Por ejemplo, la proteína de unión a CREB (CBP)/p300 son dos KAT paralogos que regulan numerosas vías de señalización en el cáncer2,,3. CBP/p300 tienen una función de histona acetiltransferasa (HAT) bien caracterizada y catalizan Histone 3 lisina 27 acetillación (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcador importante para potenciadores activos, regiones promotoras y transcripción genética activa12,13,14. CBP/p300 sirven como co-activadores críticos para las vías de señalización pro-crecimiento en tumores sólidos mediante la activación de la transcripción de oncogenes a través de la acetilación de histonas y otros factores de transcripción4,9,15,16,17,18. Debido a su papel en la progresión tumoral, CBP/p300 y otros KAT están siendo investigados para el desarrollo de nuevos inhibidores que bloquean su función oncogénica4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 y GNE-049 representan dos intentos exitosos de desarrollar inhibidores potentes y específicos para CBP/p3004,,9. Actualmente se están investigando inhibidores adicionales para CBP/p300 y otros TCC.
Se está cuestionando la calidad de los inhibidores de la KAT descritos anteriormente (KATi), con muchos inhibidores que muestran los efectos diana y la mala caracterización21. Por lo tanto, la caracterización y validación rigurosas de nuevos candidatos a medicamentos es esencial para el desarrollo de sondas químicas de alta calidad. Aquí se describen tres protocolos que forman una canalización para el cribado y la validación rigurosa de la potencia y especificidad de la nueva KATi, con un enfoque específico en la inhibición de la función HAT (HATi) de los KAT. CBP/p300 y sus inhibidores se utilizan como ejemplos, pero estos protocolos se pueden adaptar para otros KAT que tienen una función HAT7.
El primer protocolo es un ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) que utiliza p300 recombinante purificado e histonas en una reacción controlada del tubo de ensayo. Este ensayo es fácil de realizar, es rentable, se puede utilizar para examinar compuestos en un entorno de bajo rendimiento y no requiere materiales radiactivos. En este protocolo, la acetilación de lisina recombinante p300 cataliza la lisina en las colas histonas durante un breve período de incubación y los niveles de acetilación de histona se miden mediante procedimientos de inmunoblotting estándar. La reacción enzimática se puede realizar en presencia o ausencia de inhibidores de CBP/p300 para detectar compuestos que reducen la acetilación de histona. Además, el ensayo HAT se puede utilizar para verificar si los compuestos nuevos son selectivos para CBP/p300 evaluando su actividad contra otros KAT purificados, como pcAF. El ensayo HAT es un excelente punto de partida para investigar nuevos inhibidores debido a su simplicidad, bajo costo y la capacidad de determinar la potencia/selectividad de un inhibidor. De hecho, este protocolo se utiliza a menudo en la literatura como una pantalla in vitro5,10. Sin embargo, los inhibidores identificados en el ensayo HAT no siempre son eficaces en el cultivo celular porque una reacción del tubo de ensayo es mucho más simple que un sistema celular vivo. Por lo tanto, es esencial caracterizar aún más los inhibidores en los experimentos de cultivo celular22,,23.
El segundo protocolo en la canalización es el ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI). Este ensayo basado en células utiliza inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi) como una herramienta para hiperacetilar histonas en cromatina antes de la incubación con un HATi24. La acetilación basal de histona puede ser baja en el cultivo celular, lo que dificulta la sondeo a través de inmunoblotting sin la adición de un HDACi para aumentar la acetilación. El propósito del ensayo ChHAI es identificar nuevos HATi que pueden atenuar el aumento de la acetilción histona causada por la inhibición del HDAC. Las ventajas de este ensayo incluyen su bajo costo, relativa facilidad de realizar, y el uso de células en el cultivo, que proporciona más relevancia fisiológica que el ensayo HAT del tubo de ensayo. Al igual que el ensayo HAT, este protocolo utiliza inmunoblotting estándar para la recopilación de datos.
Los ensayos HAT y ChHAI proporcionan datos sobre la potencia de los nuevos compuestos para inhibir la acetilación de la histona global, pero no proporcionan información sobre cómo estos compuestos afectan las modificaciones en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, el protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) es un experimento de cultivo celular que investiga las interacciones ADN-proteína en regiones específicas del genoma. En el protocolo ChIP, la cromatina se reticula para preservar las interacciones ADN-proteína. A continuación, la cromatina se extrae de las células y el complejo de proteínas del ADN se somete a inmunoprecipitación selectiva para la proteína de interés (por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico para H3K27ac). El ADN se purifica y analiza utilizando qPCR. Por ejemplo, ChIP-qPCR se puede utilizar para determinar si una nueva HATi regula la acetilción histona en oncogenes individuales, como Cyclin D125. Mientras que ChIP-qPCR es una técnica común utilizada en el campo, puede ser difícil optimizar4,10,26. Este protocolo proporciona consejos para evitar posibles escollos que pueden producirse al realizar el procedimiento ChIP-qPCR e incluye comprobaciones de control de calidad que se deben realizar en los datos.
Cuando se utilizan juntos, estos tres protocolos permiten la caracterización y validación rigurosas de la nueva HATi. Además, estos métodos ofrecen muchas ventajas porque son fáciles de realizar, relativamente baratos y proporcionan datos sobre la acetilación de histona global y regional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Acetiltransferasas de lisina (KAT) acetillasoar varios residuos de lisina en las colas de histona y factores de transcripción para regular la transcripción genética2,3. El trabajo en las últimas dos décadas ha revelado que los KAT, como CBP/p300, PCAF y GCN5, interactúan con factores de transcripción oncogénicos y ayudan a impulsar el crecimiento tumoral en varios tipos de tumores sólidos4,,5,<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Biomédica James y Esther King (6JK03 y 20K07), y Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 y 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation y UF Health Cancer Center. Además, nos gustaría dar las gracias al Dr. Zachary Osking y a la Dra. Andrea Lin por su apoyo durante el proceso de publicación.
Materials
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
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