Summary
가혹한 급성 췌장염을 위한 동물 모형은 염증성 사건의 진화의 관측을 용이하게 하는 초기 단계에서 병리학적 변화의 연구를 가능하게 합니다. 여기서 우리는 마취 C57BL/6 마우스의 췌장 덕트에 타우로콜린산 나트륨의 역그레이드 주입에 의하여 가혹한 급성 담즙 췌장염의 유도를 위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
타우로콜린성 주입에 의한 담즙 급성 췌장염 유도는 임상 담즙 췌장염의 발병에 대응하는 염증 성 사건의 인간 임상 상태 및 재생의 표현으로 인해 과학 계에 의해 널리 사용되고 있다. 췌장 손상의 심각도는 주입된 담즙산의 농도, 속도 및 부피를 측정하여 평가될 수 있다. 이 연구는 프로토콜 재생에 사용되는 재료 및 방법의 업데이트 된 체크리스트를 제공하고이 급성 췌장염 (AP) 모델의 주요 결과를 보여줍니다. 이전 출판물의 대부분은 쥐에서이 모델을 재현하는 자신을 제한했다. 우리는 연구 결과와 관련있을 수 있는 추가이 (즉, 마우스의 유전자 변형 된 균주와 함께 작동의 가능성과 함께 이 동물을 위한 시약 및 항체의 무기고의 가용성)를 제공하는 마우스에 이 방법을 적용했습니다. 마우스의 급성 췌장염 유도의 경우, C57BL/6 마우스에서 3분 동안 주입 속도 10 μL/min에서 2.5%의 나트륨 타우로콜레이트의 정의된 투여량을 가진 체계적인 프로토콜을 제시하며, 이는 유도의 12시간 이내에 최대 정도의 심각도에 도달하고 그 결과를 강조하는 방법을 검증하는 결과를 강조한다. 연습과 기술로 마취 유도부터 주입 완료까지 총 예상 시간은 동물 당 25 분입니다.
Introduction
인간에서, 담석의 존재는 담석의 말단 부분의 방해로 인한 췌장염의 가장 흔한 원인이며, 췌장 분비물의 흐름을 방해하고 췌장에 있는 강렬한 염증 과정을 일으키는 원인이 되며, 혈청 및 염증 성 중재자에서 소화 효소의 농도가 증가한다1,2.
급성 췌장염의 발달을 설명하기 위해 두 가지 다른 이론이 제안되었습니다 (AP). "일반적인 채널" 이론은 담낭에 존재하는 돌이 담즙 분비가 췌장 덕트로 역행하는 것을 허용하는 말단 일반적인 담관 시스템을 방해한다는 것을 건의합니다. 두 번째 이론 ("덕트 방해" 이론)은 과잉 담석에 의한 췌장 덕트의 방해가 십이지장 분비의 흐름에 막힘을 일으켜 덕덕 고혈압을 유발한다는 것을 시사합니다. 급성 담즙 췌장염으로 이끌어 내는 기계장치는 완전히 이해되지 않더라도, 결과는 강렬한 선동적인 프로세스입니다. 소화효소 분화와 췌장자가 소화는 조직병리학적 변화, 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 증가, 급성상 단백질4,5,6의 증가로 이어집니다.
가혹한 심각한 심각한 췌장염은 다중 기관의 관여 및 높은 사망 리스크 때문에 임상주의를 받을 자격이 있는 상태입니다. 급성 췌장염의 번식을 위한 동물 모델은 질병의 병리학적 메커니즘을 설명하고 질병의 초기 단계에서 시작하여 염증 성 사건의 진화를 모니터링하는 데 도움이되기 때문에 중요합니다. 이것은 일반적으로 진료소에서 불가능2,7. 또한, 췌장 조직에 대한 접근은 임상 전 연구에서 쉽게, 동위원소 종과 함께 작업할 가능성과 함께 임상 조건에 연결된 변화의 용해성을 선호8, 바람직하지 않은 변수를 제거하고, 인간 조건에서 관찰 된 결과와 임상 유사성을 미러링9.
쥐와 쥐 종에 있는 급성 췌장염의 유도를 위한 담즙 및 비 담즙 모형은 과학문헌에서 빈번하게 공부되었습니다. 유도의 비 담즙 방법은 cholecystokinin 분비학 또는 그 아날로그 cerulein10의 수막 자극 복용량의 관리를 포함한다; L-아르기닌의 거의 치명적인 복용량의 관리; 또는 ethionine11로 보충 콜린 결핍 다이어트의 관리. 이러한 방법은 재현하기 쉽고 췌장 염증을 초래하지만 이론적으로 AP (즉, 췌장 덕트로 담즙 분비물의 역류)를 트리거하는 메커니즘을 복제하지 않습니다. 담즙 모형을 해결하는 기술은 췌장 덕트에 담즙산의 역행 주입을 기반으로 하고 이 프로토콜을 실행하기 위하여 잘 훈련된 연구원을 요구합니다. 여러 연구는 쥐에서이 방법을 사용 하 여 발표 되었습니다 (이러한 실험 외과 수술을 포함 하기 때문에 분명히 기술적 인 이유로)12,13. 그러나, 마우스에 있는 접근은 염증3,14,15의 연구 결과에 있는 더 흥미로운 결과를 제안할 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 C57BL/6 마취 마우스에 있는 타우로콜린나트륨의 주입에 의하여 가혹한 급성 췌장염의 재생산을 위해 따라야 할 단계의 체크리스트를 보여줄 것입니다.
항체를 이용한 실험의 필요성과 유전자 및 단백질 발현의 분석을 수반하는 작업의 경우, 마우스의 사용은 이러한 동물에 대한 물질의 무기고가 크고 동종 및 녹아웃 종과 함께 작업할 가능성 때문에 바람직하며, 그 중에서도 연구와 관련이 있는 것으로 나타났다16. 마우스 C57BL/6은 원래 항종양 활성 및 면역학 연구를 위해 개발된 마우스의 근친 변형이다. 이 긴장은 점점 동종인 것에 대 한 연구원에 의해 선호 되 고, 결과의 더 큰 재현성을 허용, 실험에 동물의 작은 수의 사용 및 동일한 그룹 사이의 결과의 적은 가변성을 의미할 수 있습니다17,18.
Perides 외. (2010)14 나트륨 taurocholate 주입에 의해 마우스에서 AP 유도에 대 한 프로토콜을 발표 했다. 여기서 우리는 C57BL/6 마우스에서 더 높은 나트륨 타우로콜린 농도(2.5%)를 사용하여 이 모델을 업데이트하며, 주입의 부피 및 속도(도 1). 심각도의 최대 수준은 마우스에 있는 유도의 12 시간 안에 도달합니다. 혈청 과 복막 구멍에서 IL-6의 농도의 상승은 AP의 진행과 상관된다. 연습을 통해 마취 유도에서 주입 완료까지의 총 예상 시간은 동물 당 25 분입니다. 숙련된 연구원이 이 실험을 수행하는 것이 필수적입니다. 용액이 일반적인 담관에 제대로 주입되도록 타우로콜레이트 나트륨 대신 메틸렌 블루를 사용하여 여러 파일럿 트레이닝 세션을 수행합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 USP 의과 대학의 동물 사용에 대한 윤리위원회에 의해 승인되었다, Num. 프로젝트: 1343/2019-CEUA: FMUSP. 이 프로토콜을 위해, C57BL/6 마우스는 6주, 20± 2g의 무게가 사용되었다(n = 9/그룹).
1. 라파로토미
- 자일라진(10 mg/kg)과 케타민 용액(80 mg/kg)으로 동물을 마취시키고, 1mL 주사기와 13x0.45mm 바늘 26G 1/2를 사용하여 피하(0.1 mL/10g의 체중)를 피하한다. 발가락을 꼬집어 충분한 마취 깊이를 확인하십시오. 가열 된 패드를 사용하여 체온을 제어 할 수 있습니다. 모든 수술 재료가 멸균되었는지 확인하십시오.
- 5% 포비도요오드 용액으로 복부 부위를 청소하고 트리머를 사용하여 가슴과 하복부(약 2cm2) 사이의 모발을 제거합니다. 70 %의 알코올로 수술 영역을 청소하십시오.
- 수술 용 테이프를 사용하여 수술 판에 동물을 고정. 가위를 사용하여 피부의 5mm를 수평으로 자르고 복부 의 상부에, xiphoid 과정보다 1cm 낮습니다. 회음에 컷을 반복합니다. 이것은 구멍의 최소한의 노출로 복강경을 초래할 것입니다.
2. 췌장 찾기 및 노출
- 리트랙터의 도움으로, 마우스의 머리쪽으로 간을 당겨 , ~ 창자에서 1cm.
- 타우로콜레이트 나트륨(췌장 헤드)으로 주입될 췌장의 영역을 찾습니다. 간 아래, 오른쪽에 있는 (마우스가 볼 때 왼쪽)을 참조하여 십이지장(duodenum)을 찾습니다. 십이지장소장의 첫 번째 부분이며 위장의 마지막 부분에 연결됩니다.
- 집게의 도움으로 간을 동물의 머리쪽으로 들어 올리고 소장 부분을 부드럽게 당깁니다. 소장의 두 측면 끝을 6-0 폴리프로필렌 봉합사로 수정하여 일반적인 담관의 탈경 부분을 더 잘 볼 수 있습니다.
3. 심한 급성 췌장염 유도
- 일시적으로 간으로 누출에서 역행 주입을 방지하기 위해 마이크로 선박 클립으로 근위 일반적인 담관을 폐색. 일반적인 담관은 십이지장의 간 측에서 볼 수 있으며 십이지장과의 접합은 흰색으로 나타납니다. 복강에서 장기를 노출시다.
- 0.54mm 폴리에틸렌 튜브에 연결된 0.4mm 바늘로 일반적인 담관에 접근하기 위해 periampullary 영역 (소장 벽의 희끄무레한 부분)을 뚫습니다.
- 8-0으로 말단 일반 담관의 임시 폐색을 만드십시오. 탄화나트륨 타우로콜레이트 용액이 십이지장으로 누출되는 것을 방지하기 위한 봉합사.
- 주입 펌프를 시작하고 3 분 동안 10 μL /10g의 일정한 속도로 2.5 % 나트륨 타우로 콜린액 (0.9 % 식염수로 희석)을 프로그래밍하십시오.
- 주입 후, 마이크로 용기 클립을 제거, 임시 8-0 봉합사, 담즙 췌장 덕트에서 주사 바늘은 담즙의 생리적 흐름을 재구성한다.
- 마지막에, 6-0 비흡수성 모노필라멘트 폴리 프로필렌 봉합사로 복부를 봉합합니다. 복강경과 최종 봉합사 사이의 시간은 최대 30분이어야 합니다( 그림 1 참조).
- 수술 후, 나무 면도와 물과 음식 광고 리비툼 줄 지어 폴리에틸렌 상자에 동물을 집.
- 실험 마우스와 동일한 방식으로 제어 마우스를 치료하지만 인퓨슬이 식염수로만 구성되도록 합니다. 수술 및 식염수 용액의 주입을 수행 (10 mL / 분, 3 분) 대조군에서 (SHAM) 수술 및 캐포레이션에 의한 염증 성 편견을 제거.
- 트라마돌 12.5 mg/kg을 8시간마다 피하시사용하세요.
4. 분석 방법
- AP 유도 후 12시간에서, 자일라진(10 mg/kg)과 케타민(80 mg/kg)으로 동물을 마취하여 궤도 신경을 통해 약 250μL의 혈액을 수집합니다.
- 피부를 뒤쪽으로 부드럽게 잡고 안구의 약간의 돌출을 촉진하고 눈을 위쪽으로 향하게 합니다.
- 동물의 눈에 국소 마취제를 함유한 눈 연고 한 방울을 주입합니다.
- 모세관 튜브의 끝을 눈의 내측 모서리에 배치하고 ~ 30 °-45 °의 각도로 안구 아래에 부드럽게 삽입하십시오. 혈류가 시작될 때까지 모세관 튜브를 회전시십시오. 절차에 힘을 사용할 필요가 없습니다.
- 컬렉션이 끝나면 거즈와 가벼운 압축으로 눈꺼풀을 닫아 항상성을 유지하십시오. 날카로운 용기에 모세관 튜브를 폐기19.
- 혈청(700 x g, 15분)을 원심분리하고 아밀라제 및 IL-6 투약(4.7 단계 및 4.8)에 대한 상퍼를 비축한다.
- CO2 질식에 의해 마우스를 안락사.
- 27 G 바늘을 사용하여 4mL의 얼음 차가운 1x PBS를 복막 구멍에 주입하십시오. 복부 피부를 텐싱하고 바늘이 어떤 장기를 펑크하지 않도록 복막에서 천천히 밀려 있는지 확인합니다. 주사 후 복막에 10s를 부드럽게 마사지하여 복막에 부착된 세포를 제거합니다.
- 가위와 핀셋을 사용하여 내분과 근육에 작은 컷(0.5cm)을 만들어 복강을 노출시합니다. 회막에 전구 파이펫을 삽입하고 유체를 수집합니다. 지방 조직이나 다른 장기를 흡인하지 않도록주의하십시오.
- 가능한 한 많은 유체를 수집하고 얼음에 보관 튜브에 수집 된 세포 현탁액을 입금합니다. 날카로운 용기에 전구 파이펫을 폐기20. 복막 유체(250 x g, 5분)를 원심분리하고 IL-6 투약(단계 4.9)에 대한 상퍼를 비축한다.
- 십이지장(<5mm)에 인접한 췌장 영역을 수집합니다.
- 10% 포르말린에 고정하여 췌장을 처리하고 파라핀에 통합합니다.
- 혈소클린과 에오신으로 슬라이드를 염색하여 경현미경 검사에서 조직 병리학 분석을 분석합니다. 슈미트의 프로토콜21 (췌장 부종, 아시나르 세포, 부상 / 괴사, 췌장 염증)을 사용하여 AP의 정도를 평가하십시오.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 시판되는 키트를 사용하여 아밀라제(U/dL)를 측정합니다.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 상업용 키트를 사용하여 Luminex assays로 IL-6을 측정합니다.
- 필요한 경우 -80°C에서 냉동고에 4.1 및 4.4 단계에서 수득된 혈청 및 하중 유체 상수체를 저장합니다.
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Representative Results
췌장염 중증도는 부재에 해당하는 슈미트의 scale21 에 따라 0-3 사이에서 득점되었으며, 1은 경미한 존재(<25%)에 해당하며, 2는 중등도(25~50%)에 해당하며 3은 강렬한 존재감(> 50%)에 해당한다. 수행된 측정은 혈장 아밀라제 활성, 췌장 부종, 아시나르 세포, 부상/괴사, 췌장 염증(H&E 염색 섹션의 히스토로지 분석에 의한) 및 혈청 및 PerC 유체의 IL-6 사이토카인 농도였다. 12h의 심한 AP 후, APTA 그룹은 혈청 아밀라제 농도(6194 ± 336.7 U/dL)의 증가를 보였으며, 이는 샴그룹(3845 ± 135.7 U/dL)에 비해 증가했다. 동시에, APTA 군은 혈청 및 PerC 유체에서 IL-6 사이토카인 농도가 증가하는 것으로 나타났다(도 2). 도 3 은 대표적인 헤마톡시린-에신염색을 나타내며, APTA 군이다.
도 1: C57BL/6 마우스에서 2.5% 나트륨 타우로콜린산염의 심한 급성 췌장염 유도의 회로도 ; (A) 담낭; (B) 일반적인 담관; (C) 췌장 덕트; (D) 포털 정맥; (E) 마이크로용기 클립; (F) 천자 부위(폴리에틸렌 튜브에 부착된 바늘과 주입 펌프에 연결); (G) 일반적인 담관에서 임시 바늘 고정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 12h의 중증 급성 췌장염 후 대표적인 결과. (A) 동물의 혈청 아밀라제 농도(U/dL). (B) 혈청 및 PerC 유체의 IL-6 사이토카인 농도. APTA≠ 샴(n=9/그룹)이 있는 경우 그룹 간의 차이는 페어링되지 않은 t-test 분석 * p <0.05에 의해 평가되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 간질 부종 | 염증성 침투 | 판레시마 괴사 | 파렌치마 출혈 | |
| 가짜 | 1±0* | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| APTA | 3±0* | 3±0 | 3±0 | 3±0 |
| *p<0,05 경우 SHAM≠APTA. |
표 1: 심한 AP의 12 시간 후 췌장 조직의 조직학적 변화. 췌장은 슈미트의 scale21에 따라 처리되고 분석되었다. 결과는 SEM± 의미로 표현되었고 그룹 간의 차이는 학생 t 시험에 의해 평가되었습니다. * APTA ≠ 샴 경우 p <0.05; (n=9/그룹).
그림 3: 12h의 심한 AP 후 췌장 조직에서 대표헤마톡시린-에신 염색. (A) SHAM 및 (B) APTA 췌장 조직에서 의 조직학적 변화 (헤마톡실린 -에오신 염색 - 40 배율). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
타우로콜레이트 나트륨 주입에 의한 급성 췌장염을 유도하는 방법은 이미 랫트22,23,24에서 나타났다. 2008년, 2010년, 2015년에 출판된 세 개의 유사한 작품은 프로토콜3,14,15에 대한 참조역할을 했습니다. 이 작업에서는 C57BL/6 마우스에서 이 방법을 재현하기 위한 모든 중요한 단계와 유효성을 검사할 수 있는 몇 가지 가능성을 나열합니다.
이 시험에서 중요한 단계는 간으로 나트륨 taurocholate 역류를 피하기 위해 마이크로 혈관 클립 (단계 3.1)으로 힐럼의 수준에서 담관을 차단하는 것입니다. 포털 정맥이 덕트 옆에 있기 때문에이 단계는 많은주의가 필요하므로 함께 차단하지 않도록주의를 기울여야합니다. 바늘은 가장 단면 덕트 부분으로만 삽입해야합니다. 덕트깊숙이 도입되면 선빈실증 및/또는 다른 덕트14에 산이 넘쳐나는 파열을 일으킬 수 있습니다. 폴리에틸렌 튜브가 일반적인 담관의 방해를 방지하기 위해 내부에 공기가 있는지 확인하십시오.
이 모델은 마우스 복부에 절개를 해야합니다. 췌장 덕트 오리피스를 통해 캐뉼라를 삽입하려면 경험이 필요하지만 교육15,25로 달성 될 수 있습니다. 이 모델의 췌장염의 심각도는 농도, 주입량, 주입 압력 및 AP 유도 시간에 비례적으로 의존한다는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 따라서 제어 된 부피 와 압력을 가진 일정한 주입 기계를 사용해야합니다.
이 연구를 위해, 우리는 2.5%의 농도를 표준화, 주입 속도 10 μL/min, 3 분 및 일정한 압력. AP의 12h에서, 증가 염증 성 매개 변수와 췌장 조직의 괴사는 관찰되었다, 동물은 AP 유도 후 16 시간 이내에 죽어와.
AP의 주요 원인은 알코올 소비 또는 담석이지만, 이러한 모델은 실험적으로 재현할 수 없습니다26. 현재, 마우스에서 AP 유도를 위한 가장 많이 사용되는 프로토콜은 1 시간 간격27에서 cerulein (50 μg/kg 체중)의 7 인회내 주사를 포함한다. Cerulein뿐만 아니라 온화하거나 중간 급성 췌장염을 유도하는 데 사용되었습니다. 이 모형에 있는 가변성은 임상 이환율 및 사망률을 부여하는 질병의 파괴적인 효력을 공부에 있는 그것의 사용을 제한합니다10. 짧은 시간에 높은 사망률을 유발하는 모델은 신약이나 내정간섭의 효과를 평가할 수 있기 때문에 심각한 AP(괴사화)의 연구에 관련이 있습니다. 이들 모델 중에는 콜린 결핍 영양28 과 L-아르기닌(예: 3 x 3 g/kg 또는 2 x 4 g/kg)에 의한 젊은 여성 설치류의 출혈 AP 유도가 있습니다(예를 들어, 3 x 3 g/kg 또는 2 x 4 g/kg) 마우스에 있는 급성 췌장염 유도를 기반으로 하지만 L-아르기닌의 적절한 투약은 각 실험실에서 각 실험실에서 시험되어야 합니다. 에서 2015, 연구 보여주었다 대 내 덕트 taurocholate 주입 다음 탈두 일반적인 담 관 결찰 마우스에 췌장염의 심각 하 고 괴 사 칭 모델으로 이어질 3. 그러나,이 모델은 돌이킬 수없는 조건으로 인한 약물 효능 및 내정간섭을 테스트하는 데 유용하지 않습니다.
이 연구에서 발견된 결과는 혈청 아밀라제 농도의 고도와 IL-6과 같은 최근 문헌과 상관관계가 질병 진행과 관련이 있습니다. 미래에는 TNF-α, IL-1β 및 myeloperoxidase와 같은 단백질의 측정이 중증 급성 췌장염30,31,32에 대한 임상 예후 파라미터가 될 가능성이 있다.
결론적으로, 본 연구에서 사용되는 프로토콜은 일반적인 담관으로 직접 타우로콜레이트 나트륨의 주입에 의해 마우스에서 AP를 유도하여 췌장 조직의 괴사를 가진 중증 급성 췌장염을 초래하여 12시간 후에도 관찰할 수 있는 췌장 조직의 괴사로 인해 혈청 및 허낭 유체의 고율(혈청 및 속수 10%의 고도로 유도한 후 16%에서 의 고율로 유도할 수 있다"고 밝혔다. 데이터가 표시되지 않음).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 상파울루 대학의 의학 클리닉에서 포스트 졸업 프로그램 덕분에; 코르데나카오 데 아페르페이소아멘토 데 페소알 드 니벨 슈페리어(CAPES) 및 상파울루 의과대학(FMUSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | - |
| Styrofoam block | - | - | - |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | - |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
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