FLIM-FRET Målinger av protein-protein interaksjoner i levende bakterier.

Summary

Vi beskriver her en protokoll for å karakterisere protein-protein interaksjoner mellom to svært forskjellige uttrykte proteiner i live Pseudomonas aeruginosa ved hjelp av FLIM-FRET målinger. Protokollen omfatter bakterier stammer konstruksjoner, bakterier immobilisering, imaging og post-imaging dataanalyse rutiner.

Abstract

Protein-protein interaksjoner (PPI) kontrollere ulike viktige prosesser i celler. Fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) kombinert med Förster resonans energioverføring (FRET) gir nøyaktig informasjon om PPIer i levende celler. FLIM-FRET er avhengig av å måle fluorescensens levetidsforfall av en FRET-donor ved hver piksel av FLIM-bildet, og gir kvantitativ og nøyaktig informasjon om PPIer og deres romlige cellulære organisasjoner. Vi foreslår her en detaljert protokoll for FLIM-FRET målinger som vi brukte til å overvåke PPIer i live Pseudomonas aeruginosa i det spesielle tilfellet av to interagerende proteiner uttrykt med svært forskjellige kopinumre for å demonstrere kvaliteten og robustheten til teknikken ved å avsløre kritiske trekk ved PPIer. Denne protokollen beskriver i detalj alle nødvendige trinn for PPI-karakterisering – fra bakterielle mutantkonstruksjoner opp til den endelige analysen ved hjelp av nylig utviklede verktøy som gir avanserte visualiseringsmuligheter for en enkel tolkning av komplekse FLIM-FRET-data.

Introduction

Protein-protein interaksjoner (PPI) kontrollere ulike viktige prosesser i cellene¹. Rollene til PPIer varierer basert på proteinsammensetning, affinitetsfunksjoner og steder i cellene². PPIer kan undersøkes via ulike teknikker³. For eksempel er co-immunoprecipitation en relativt enkel, robust og billig teknikk som vanligvis brukes verktøy for å identifisere eller bekrefte PPIer. Det kan imidlertid være utfordrende å studere PPIer når de interagerende proteinene har lave uttrykksnivåer eller når interaksjonene er forbigående eller relevante bare i bestemte miljøer. Studere PPI forekommer mellom de forskjellige enzymer av pyoverdin banen i P. aeruginosa krever at undertrykkelse av den generelle jern-co-factored repressor Fur er lettet for å tillate uttrykk for alle proteiner av pyoverdin banen som skal uttrykkes i cellen^4,5,6. Denne felles reguleringen for alle proteinene i banen resulterer i be stunduttrykk i cellen som forventes å fremme deres interaksjoner. Mangfoldet i størrelse, natur, uttrykksnivåer og antall proteiner av denne metabolske veien gjør det vanskelig for studier i rekonstituerte systemer⁶. Å utforske PPIer i deres cellulære miljø er derfor avgjørende for å forstå proteinenes biologiske funksjoner i sin opprinnelige sammenheng.

Bare få metoder, inkludert fluorescens tillater å utforske PPIer i levende celler⁷. Blant de forskjellige fluorescensparametrene som kan måles, er fluorescensens levetid (det vil si den gjennomsnittlige tiden en fluorofor forblir i sin opphissede tilstand før du sender ut et foton) sannsynligvis en av de mest interessante parametrene å utforske i levende celler. Fluorescensens levetid for en fluorofor er svært følsom for miljøet, og FLIM kan derfor gi kjemisk eller fysisk informasjon om fluoroforomgivelsene⁸. Dette inkluderer tilstedeværelsen av Förster resonans energioverføring (FRET) som kan oppstå i nærvær av en “acceptor” av fluorescens som ligger i kort avstand av en fluorescens “donor”. Energioverføring resulterer i betydelig forkortelse av donorfluorescens levetid (figur 1A), noe som gjør Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) til en kraftig tilnærming til å utforske protein-proteininteraksjoner direkte i levende celler. FLIM kan i tillegg gi romlig informasjon om hvor interaksjonene finner sted i cellene^7,8. Denne tilnærmingen er ekstremt kraftig for å undersøke PPIer i situasjoner der merking med fluoroforer av de to samhandlende partnerne er mulig.

For fret å skje – kritiske forhold på avstanden mellom to fluoroforer er nødvendig^8,9. De to fluoroforene bør ikke være fjernt fra hverandre med mer enn 10 nm. Derfor må det tas advarsler når du utformer FLIM-FRET-eksperimenter for å sikre at donoren og akseptoren av fluorescens har en sjanse til å bli plassert nær hverandre i det interagerende komplekset. Selv om dette kan virke begrensende, er det faktisk en sann fordel som avstandsavhengighet av FRET sikrer at to merkede proteiner som gjennomgår FRET må fysisk samhandle (Figur 1A). Vanskelighetene med å få klare svar om PPI i colocalization eksperimenter (to colocalized proteiner kan ikke nødvendigvis samhandle) er derfor ikke et problem ved hjelp av FLIM-FRET.

Figur 1: FLIM-FRET analyse prinsipp. Hver piksel av FLIM-FRET flerdimensjonalt bilde inneholder informasjon om fluorescensforfall registrert på dette stedet (#counts = antall oppdagede fotoner i kanalen t). (A)Den klassiske representasjonen av FLIM-bildet er vanligvis en falsk fargelevetid kodet 2D-bilde (venstre). En reduksjon i donorens gjennomsnittlige fluorescens levetid – sett av en endring i fargeskalaen – kan observeres i nærvær av FRET og er informativ om tilstedeværelsen av PPI-er i dette romlige området. (B)Overlapping mellom donorutslippsspekteret og akseptorabsorpsjonsspekteret er nødvendig for at FRET skal forekomme. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et annet krav til FRET er at donorens utslippsspektrum og absorpsjonsspektraet til akseptoren skal overlappe⁸ (figur 1B). Fluorescens eksitasjon av donor bør være på bølgelengder som bidrar svært lite til direkte fluorescens eksitasjon av acceptor. Ikke alle kombinasjoner av fluoroforer er mulige, og vi anbefaler i tillegg å fortrinnsvis bruke donorer med monoexponential fluorescens forfall for å lette FLIM-FRET^{tolkninger 10}. Flere par fluorescensproteiner oppfyller disse kravene, inkludert det populære eGFP-mCherry-paret¹¹ (for en gjennomgang av paletten av tilgjengelig fluorescerende protein FRET-par se^12,13).

FLIM-FRET gjør det mulig å måle fluorescensens levetidsforfall av en FRET-donor ved hver piksel av et FLIM-bilde (figur 1A). Det finnes to hovedteknikker for å bestemme fluorescensens levetid som varierer i oppkjøp og analyse: frekvensdomene (FD)¹⁴ og tidsdomenet (TD). TD FLIM er mer utbredt og utføres ved hjelp av en pulserende belysning kombinert med ulike mulige deteksjonskonfigurasjoner, inkludert gating metoder^15,strekkamera¹⁶ eller tidsrelrelert enkelt foton telling (TCSPC)^{teknikker 8}. For både FD- og TD-teknikker måles ikke fluorescenslevetid direkte, men krever en analyse av de målte dataene for å estimere levetiden(e) eller tilstedeværelsen av interaksjoner. For TCSPC-teknikker er den mest brukte analysen avhengig av å montere forfallene med enkle eller multi eksponentielle funksjoner ved hjelp av minst firkantede iterative re-convolutions som minimerer den vektede summen av rester.

Til slutt kan FLIM-FRET utføres både ved hjelp av enkelt foton eller multiphoton eksitater. Den siste har flere fordeler som å redusere autofluorescence og fotoskader ut av fokalplanet. Multiphoton excitations tillater også en lengre eksitasjonsdybde hvis du arbeider i tykke 3D-prøver⁸. Tvert imot er enkelt foton eksitasjon vanligvis mer effektiv som to-foton absorpsjon tverrsnitt av fluorescerende proteiner er begrenset¹⁷.

Her foreslår vi en protokoll for FLIM-FRET målinger av PPI-er i live P. aeruginosa i det spesielle tilfellet av to interagerende proteiner (PvdA og PvdL) uttrykt med svært forskjellige antall kopier for å demonstrere kvaliteten og robustheten til teknikken ved å avsløre kritiske egenskaper ved PPIer. PvdA- og PvdL-proteiner er involvert i pyoverdinbiosyntese. PvdA er en L-ornitin N5-oksygenase og syntetiserer L-N5-formyl-N5-hydroksyornithine fra L-ornitin ved hydroksylering (PvdA) og formylering (PvdF)¹⁸. PvdL er et ikke-ribosomalt peptidsyntese (NRPS) enzym bestående av fire moduler. Den første modulen katalyserer akylering av myristisk syre. Den andre modulen katalyserer aktiveringen av L-Glu og dens kondens til myristic-coA. Deretter kondenserer den tredje modulen en L-Tyr aminosyre som deretter isomerized i D-Tyr. Til slutt binder den fjerde modulen en L-Dab (Diaminobutyric acid) aminosyre for å danne den acylaterte tripeptidE L-Glu/D-Tyr/L-Dab⁶. PvdL er dermed ansvarlig for syntesen av de tre første aminosyrene i pyoverdinforløperen. Samspillet mellom PvdA-protein med PvdL er overraskende da PvdL, tvert imot PvdI og PvdJ, ikke har en modul som er spesifikk for L-N5-formyl-N5-hydroksyornithine. Denne interaksjonen tyder på at alle enzymene som er ansvarlige for pyoverdinforløperbiosyntesen, er ordnet i store forbigående og dynamiske multi-enzymatiske komplekser^19,20.

I denne rapporten forklarer vi i detalj hvordan man konstruerer bakteriestammene som uttrykker opprinnelig de to interagerende eGFP- og mCherry-merkede proteinene. Vi beskriver også prøveforberedelse og betingelser for effektiv FLIM-FRET-celleavbildning. Til slutt foreslår vi en trinnvis veiledning for bildeanalyse, inkludert et nylig utviklet verktøy som gir avanserte visualiseringsmuligheter for enkel tolkning av komplekse FLIM-FRET-data. Med denne rapporten ønsker vi å overbevise ikke bare eventyrlystne, men de fleste biologer om at FRET-FLIM er en tilgjengelig og kraftig teknikk som kan løse sine spørsmål om PPI direkte i det innfødte mobilmiljøet.

Protocol

1. Plasmid konstruksjon Forsterke med to PCR (PCR1 og 3) DNA-sekvenser (bruk genomisk DNA av P. aeruginosa PAO1) av 700 basepar oppstrøms og nedstrøms av regionene som tilsvarer innsettingsstedet i P. aeruginosa genom med high-fidelity DNA polymerase. Legg til begrensningsområder i primere i blått og grønt, og legg til en overlappende sekvens med mCherry til primere i rødt (figur 2). For PvdA merket ved C-endestasjonen med eGFP, forsterk 700 bp-regio…

Representative Results

Empiriske kumulative fordelingsfunksjoner (ecdf) av fluorescenslevetid målt for de forskjellige bakteriestammene er vist i figur 8. Hvis FRET oppstår, flyttes ecdfs mot kortere levetid (figur 8A,8B). Legg merke til at når samspillet mellom de to proteinene resulterer i lang avstand mellom de to fluoroforene, kan det ikke oppstå fret (figur 8C). Denne situasjonen kan ikke skilles fra fraværet av samhandling mell…

Discussion

FLIM-FRET gir noen viktige fordeler fremfor intensitetsbasert FRET-bildebehandling. Fluorescens levetid er en iboende parameter av fluorofor. Som en konsekvens er det ikke avhengig av lokale konsentrasjoner av fluoroforer heller ikke på intensiteten av lysutseelse. Fluorescensens levetid påvirkes også dårlig av fotobleking. Det er spesielt interessant å vise PPI-er i celler der lokale proteinkonsentrasjoner kan være svært heterogene i de subcellulære rommene eller regionene. FLIM-FRET er også interessant i alle …

Materials

525/50 nm band-pass filter	F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter	F75-680, AHF, Germany
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL	ThermoFisher Scientific	EP0714
E. coli TOP10	Invitrogen	C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode	SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm	Knitel glass	MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL	ThermoFisher Scientific	F530S
Lysogeny broth (LB)	Millipore	1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)	Sigma-Aldrich	10034-99-8
Microscope slides (25×75mm)	Knitel glass	MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
NucleoSpin Plasmid	Macherey-Nagel	740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Succinate (Disodium)	Sigma-Aldrich	14160
SPCImage, SPCM software	Becker & Hickl
Sterile inoculating loop	Nunc	7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL	ThermoFisher Scientific	15224017
TCSPC module	SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser	Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL	Falcon	352070