عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة
Summary
هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا الجرثومية الحية الميوتيك وما بعد الومياء من الخصيات الماوس الكبار. باستخدام السمية الخلوية المنخفضة ، وصبغة ملزمة الحمض النووي ذات الحماس البنفسجي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، يمكن للمرء عزل مجموعات الخلايا المنوية الغنية للغاية للعديد من تطبيقات المصب.
Abstract
عزل الحيوانات المنوية meiotic ضروري للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة في meiosis والحيوانات المنوية. على الرغم من وجود بروتوكولات عزل الخلايا المنشأة باستخدام Hoechst 33342 تلطيخ في تركيبة مع فرز الخلايا المنشطة بالفلور، فإنه يتطلب فرز الخلايا مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. هنا وصف بروتوكول عزل الخلية باستخدام وصمة عار فيوليت DyeCycle (DCV)، وهو منخفض صبغة الحمض النووي ربط السامة للخلايا هيكليا مماثلة لHoechst 33342. يمكن أن يكون DCV متحمسًا من قبل كل من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة البنفسجية ، مما يحسن مرونة اختيار المعدات ، بما في ذلك فرز الخلايا غير المجهزة بالليزر فوق البنفسجي. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يعزل ثلاثة من الخلايا الحية الفرعية في الطور الطوري meiotic الأول، بما في ذلك اللبتوتين / zygotene، pachytene، وseetocytes diplotene، فضلا عن الحيوانات المنوية جولة ما بعد الميوتيك. كما أننا نتصف بروتوكولًا لإعداد التعليق أحادي الخلية من الخصيص الماوس. عموما، يتطلب الإجراء وقتا قصيرا لإكمال (4-5 ساعات اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة)، مما يسهل العديد من التطبيقات المصب.
Introduction
Spermatogenesis هي عملية معقدة حيث عدد قليل من الخلايا الجذعية spermatogonial الحفاظ على الإنتاج المستمر لعدد كبير من الحيوانات المنوية في جميع أنحاء حياة الكبار1,2. أثناء تكوين الحيوانات المنوية، chromatin الحيوية إعادة عرض يحدث عندما تخضع الخلايا المنوية meiosis لإنتاج الحيوانات المنوية haploid3,4,5. عزل الحيوانات المنوية meiotic ضروري للتحقيق الجزيئي، وقد أنشئت عدة طرق مختلفة لعزل الحيوانات المنوية meiotic، بما في ذلك الفصل القائم على الترسيب6،7 وفرز الخلايا المفلورة المنشطة (FACS)8،9،10،11،12،13،14،16،17. ومع ذلك، هذه الطرق لها قيود فنية. في حين أن فصل الترسب القائم على العائدين على عدد كبير من الخلايا5,6,7, فمن كثيفة العمالة. الأسلوب القائم على FACS المنشأة يستخدم Hoechst 33342 (Ho342) لفصل الحيوانات المنوية meiotic على أساس محتوى الحمض النووي وخصائص نثر الضوء ويتطلب FACS فرز الخلايا مجهزة الأشعة فوق البنفسجية (UV) ليزر8،9،10،11. تتطلب الطرق القائمة على FACS البديلة خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي أعرب عن البروتينات الفلورية، وتزامن من الحيوانات المنوية12، أو تثبيت الخلايا ووضع العلامات الأجسام المضادة التي لا تتوافق مع عزل الخلايا الحية13. في حين أن هناك طريقة بديلة أخرى باستخدام صبغة ربط الحمض النووي القابلة للنفاذ الخلوية ، فإن صبغة DyeCycle Greenstain 14،15،16،17، يوصى بهذه الطريقة لعزل الخلايا المنوية من الخصية. لذلك، هناك حاجة ماسة لتطوير طريقة عزل بسيطة وقوية لـ الحيوانات المنوية النيوية الحية التي يمكن تطبيقها على أي سلالة فأرة من أي عمر ويمكن تنفيذها باستخدام أي فارز خلية FACS.
هنا نحن وصف مثل بروتوكول عزل الخلايا التي طال السعي باستخدام وصمة عار DyeCycle البنفسجي (DCV). DCV هو السمية الخلوية المنخفضة، خلية نفاذية صبغة ملزمة الحمض النووي مماثلة هيكليا لHo342 ولكن مع طيف الإثارة تحولت نحو نطاق البنفسجي18. وبالإضافة إلى ذلك، فإن DCV لديها طيف أوسع من الانبعاثات مقارنة بـ DCG. وهكذا، يمكن أن يكون متحمس من قبل كل من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة الليزر البنفسجية، مما يحسن مرونة المعدات، مما يسمح باستخدام فارز خلية FACS غير مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. يستخدم بروتوكول DCV المعروض هنا فصل ثنائي الأبعاد مع الأزرق DCV و DCV الأحمر، يحاكي ميزة بروتوكول Ho342. مع هذه الميزة، لدينا بروتوكول DCV يسمح لنا لعزل الخلايا الجرثومية المخصب للغاية من الخصية الكبار. نحن نقدم بروتوكول البوابات مفصلة لعزل الخلايا المنوية الحية من الخصيتين الماوس الكبار من فأر واحد (من اثنين من الخصيتين). كما أننا نتصف بروتوكولاً فعالاً وسريعاً لإعداد التعليق أحادي الخلية من الخصيص الماوس التي يمكن استخدامها لعزل الخلية هذه. يتطلب الإجراء وقتًا قصيرًا لإكماله (إعداد تعليق خلية واحدة – ساعة واحدة ، تلطيخ صبغ – 30 دقيقة ، وفرز الخلايا – 2-3 ساعات: المجموع – 4-5 ساعات اعتمادًا على عدد الخلايا اللازمة ؛ الشكل 1). بعد عزل الخلية، يمكن إكمال مجموعة واسعة من التطبيقات المصب بما في ذلك RNA-seq، ATAC-seq، ChIP-seq، والخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكول عملي وبسيط لعزل السكان الفرعية من الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية من فأر ذكر بالغ واحد. ولضمان إمكانية استنساخ هذا البروتوكول، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام. قبل هضم الإنزيم ، تهدف خطوة الغسيل إلى إزالة الخلايا الخلالية؛ بعد الهضم، وهذه الخطوة ي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء مختبرات “مامكاوا” و”يوشيدا” و”مايزاوا” على مساعدتهم؛ كاتي غيرهارت لتحرير المخطوطة؛ ماري آن هاندل لتقاسم الأجسام المضادة H1T, مركز مستشفى سينسيناتي للأطفال الطبي (CCHMC) البحوث تدفق Cytometry الأساسية لتقاسم معدات FACS بدعم من NIH S10OD023410; منحة في المعونة للبحوث العلمية (KAKENHI؛ 17K07424) إلى T.N.; زمالة ما بعد الدكتوراه في مؤسسة لالور؛ AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) إلى S.Y.; منحة مشروع الأبحاث من قبل قسم خدمات البحوث بجامعة أزابو، وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) – برنامج مدعوم لمشروع العلامات التجارية للبحوث الجامعية الخاصة (2016-2019)، منحة في المعونة لأنشطة البحوث الناشئة (19K21196)، مؤسسة تاكيدا للعلوم (2019)، ومنحة حوافز مؤسسة يوهارا التذكارية للأبحاث (2018) إلى S.M. المعهد الوطني للصحة R01 GM122776 إلى S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Biologie du développement. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologie du développement. 169 (2), 557-567 (1995).
