Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye
Summary
Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.
Abstract
Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist wichtig, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Obwohl es etablierte Zellisolationsprotokolle mit Hoechst 33342 Färbung in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gibt, sind Zellsortierer mit einem ultravioletten Laser erforderlich. Hier beschreiben wir ein Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck, einem DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität, der Hoechst 33342 strukturell ähnelt. DCV kann sowohl von ultravioletten als auch von violetten Lasern angeregt werden, was die Flexibilität der Geräteauswahl verbessert, einschließlich eines Zellsortierers, der nicht mit einem ultravioletten Laser ausgestattet ist. Mit diesem Protokoll kann man drei lebende Zellsubpopulationen in der meiotischen Prophase I isolieren, einschließlich Leptotene/Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozyten sowie postmetiotische runde Spermatien. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Vorbereitung der einzelzelligen Suspension von Maushoden. Insgesamt benötigt das Verfahren eine kurze Zeit (4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen), was viele nachgelagerte Anwendungen erleichtert.
Introduction
Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem eine kleine Population von SpermatogonialStammzellen die kontinuierliche Produktion einer großen Anzahl von Spermien während des Erwachsenenlebens1,2aufrechterhält. Während der Spermatogenese findet die dynamische Chromatin-Remodellierung statt, wenn spermatogene Zellen einer Meiose unterzogen werden, um haploide Spermaatiden3,4,5zu produzieren. Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist für die molekulare Untersuchung von wesentlicher Bedeutung, und es wurden verschiedene Ansätze zur Isolierung meiotischer Spermatozyten etabliert, einschließlich sedimentationsbasierter Trennung6,7 und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Diese Methoden haben jedoch technische Einschränkungen. Während sedimentationsbasierte Trennung eine große Anzahl von Zellenergibt 5,6,7, ist es arbeitsintensiv. Die etablierte FACS-basierte Methode verwendet Hoechst 33342 (Ho342), um meiotische Spermatozyten basierend auf DNA-Gehalt und Lichtstreuungseigenschaften zu trennen und erfordert FACS-Zellsortierer, die mit einem ultravioletten (UV) Laser8,9,10,11ausgestattet sind. Alternative FACS-basierte Methoden erfordern transgene Mauslinien, die floreszierende Proteine ausdrücken, Synchronisation von Spermatogenese12oder Zellfixierung und Antikörperkennzeichnung, die nicht mit der Isolierung von lebenden Zellen kompatibel ist13. Zwar gibt es eine andere alternative Methode mit einem zelldurchlässigen DNA-Bindungsfarbstoff, DyeCycle Green Stain14,15,16,17, Diese Methode wird für die Isolierung von spermaatogenen Zellen aus juvenilen Hoden empfohlen. Daher besteht die kritische Notwendigkeit, eine einfache und robuste Isolationsmethode für lebende meiotische Spermatozyten zu entwickeln, die auf jeden Mausstamm jeden Alters angewendet werden können und mit jedem FACS-Zellsortierer durchgeführt werden können.
Hier beschreiben wir ein so lang ersehntes Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck. DCV ist ein geringer Zytotoxizität, zelldurchlässiger DNA-Bindungsfarbstoff strukturell ähnlich Ho342, aber mit einem Anregungsspektrum in Richtung des violetten Bereichs18verschoben. Darüber hinaus verfügt DCV über ein breiteres Emissionsspektrum im Vergleich zu DCG. So kann es sowohl durch UV- als auch violette Laser angeregt werden, was die Flexibilität der Geräte verbessert, so dass ein FACS-Zellsortierer nicht mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Das hier vorgestellte DCV-Protokoll verwendet eine zweidimensionale Trennung mit DCV-Blau und DCV-Rot, was den Vorteil des Ho342-Protokolls nachahmt. Mit diesem Vorteil ermöglicht uns unser DCV-Protokoll, hoch angereicherte Keimzellen aus den adulten Hoden zu isolieren. Wir bieten ein detailliertes Gating-Protokoll, um lebende spermatogene Zellen von erwachsenen Maushoden einer Maus (aus zwei Hoden) zu isolieren. Wir beschreiben auch ein effizientes und schnelles Protokoll zur Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension aus Maushoden, die für diese Zellisolierung verwendet werden können. Das Verfahren erfordert eine kurze Zeit zu vervollständigen (Vorbereitung der einzelzelligen Suspension – 1 Stunde, Farbstoff Färbung – 30 min, und Zellsortierung – 2-3 Stunden: insgesamt – 4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen; Abbildung 1). Nach der Zellisolation kann eine breite Palette von nachgelagerten Anwendungen wie RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq und Zellkultur abgeschlossen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein praktisches und einfaches Protokoll vor, um Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoren aus einer einzigen erwachsenen männlichen Maus zu isolieren. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zu gewährleisten, gibt es einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern. Vor der Enzymverdauung, Waschschritt zielt darauf ab, interstitielle Zellen zu entfernen; nach der Verdauung hilft dieser Schritt, Spermatozoen und Schmutz zu entfernen. Waschen/Zentrieren ist wichtig. In unserem Dissoziat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Namekawa, Yoshida und Maezawa für ihre Hilfe; Katie Gerhardt für die Bearbeitung des Manuskripts; Mary Ann Händel für die gemeinsame Nutzung des H1T-Antikörpers, des Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core für die gemeinsame Nutzung der FACS-Ausrüstung, die von NIH S10OD023410 unterstützt wird; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) an T.N.; Lalor Foundation Postdoktorandenstipendium an A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) nach S.Y.; das Forschungsprojekt Grant von der Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for the Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), the Takeda Science Foundation (2019) und dem Uehara Memorial Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) an S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 bis S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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