Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto
Summary
Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.
Abstract
L’isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per studiare i meccanismi molecolari alla base della meiosi e della spermatogenesi. Sebbene esistano protocolli di isolamento cellulare stabiliti che utilizzano la colorazione Hoechst 33342 in combinazione con lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza, richiede smistatori di celle dotati di un laser ultravioletto. Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare usando la macchia DyeCycle Violet (DCV), un colorante legante del DNA a bassa citotossicità strutturalmente simile a Hoechst 33342. Il DCV può essere eccitato sia dai laser ultravioletti che da quelli viola, il che migliora la flessibilità di scelta dell’apparecchiatura, incluso uno smistatore di celle non dotato di un laser ultravioletto. Usando questo protocollo, si possono isolare tre sottopopolazioni a cellule vive in prophase I meiotico, tra cui leptotene/zigotene, pachytene e spermatociti diplotene, così come spermatidi rotondi post-meiotici. Descriviamo anche un protocollo per preparare la sospensione a cella singola dai test del mouse. Nel complesso, la procedura richiede un breve periodo di tempo per il completamento (4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie), il che facilita molte applicazioni downstream.
Introduction
La spermatogenesi è un processo complesso in cui una piccola popolazione di cellule staminali spermatogoniche sostiene la produzione continua di un gran numero di spermatozoi per tutta lavita adulta 1,2. Durante la spermatogenesi, il rimodellamento dinamico della cromatina avviene quando le cellule spermatogeniche subiscono meiosi per produrre spermatidi aploidi3,4,5. L’isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per l’indagine molecolare e sono stati stabiliti diversi approcci per isolare gli spermatociti meiotici, tra cui la separazione basata sulla sedimentazione6,7 e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni tecniche. Mentre la separazione basata sulla sedimentazione produce un gran numero dicellule 5,6,7, è ad alta intensità di lavoro. Il metodo stabilito basato su FACS utilizza Hoechst 33342 (Ho342) per separare gli spermatociti meiotici in base al contenuto di DNA e alle proprietà di scattering della luce e richiede smistatori cellulari FACS dotati di un laser ultravioletto (UV)8,9,10,11. Metodi alternativi basati su FACS richiedono linee di topo transgeniche che esprimono proteine florescenti, sincronizzazione della spermatogenesi12o fissazione cellulare ed etichettatura degli anticorpi che non è compatibile con l’isolamento delle cellulevive 13. Mentre esiste un altro metodo alternativo che utilizza un colorante legante al DNA permeabile alle cellule, colorante DyeCycle Green14,15,16,17, questo metodo è raccomandato per l’isolamento delle cellule spermatogeniche dal testicolo giovanile. Pertanto, è fondamentale sviluppare un metodo di isolamento semplice e robusto per gli spermatociti meiotici vivi che possono essere applicati a qualsiasi ceppo di topo di qualsiasi età e che possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi smistatore di celle FACS.
Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare così ricercato da tempo usando la macchia DyeCycle Violet (DCV). Il DCV è un colorante legante il DNA a bassa citotossicità e permeabile alle cellule strutturalmente simile all’Ho342, ma con uno spettro di eccitazione spostato verso l’intervallo viola18. Inoltre, il DCV ha uno spettro di emissione più ampio rispetto al DCG. Pertanto, può essere eccitato sia dai laser UV che viola, che migliorano la flessibilità delle apparecchiature, consentendo l’uso di uno smistatore di celle FACS non dotato di un laser UV. Il protocollo DCV qui presentato utilizza la separazione bidimensionale con blu DCV e rosso DCV, imitando il vantaggio del protocollo Ho342. Con questo vantaggio, il nostro protocollo DCV ci consente di isolare le cellule germinali altamente arricchite dal testicolo adulto. Forniamo un protocollo di gating dettagliato per isolare le cellule spermatogeniche vive dai tester di topo adulti di un topo (da due teste). Descriviamo anche un protocollo efficiente e rapido per preparare sospensioni a cella singola dai test del mouse che possono essere utilizzati per questo isolamento cellulare. La procedura richiede un breve tempo per essere completata (preparazione della sospensione a cella singola – 1 ora, colorazione del colorante – 30 minuti e smistamento delle cellule – 2-3 ore: totale – 4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie; Figura 1). A seguito dell’isolamento cellulare, è possibile completare un’ampia gamma di applicazioni downstream tra cui RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e coltura cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui presentiamo un protocollo pratico e semplice per isolare le sottopopolazioni di spermatociti e spermatidi da un singolo topo maschio adulto. Per garantire la riproducibilità di questo protocollo, ci sono alcuni passaggi critici che necessitano di attenzione. Prima della digestione enzimatica, il passaggio di lavaggio mira a rimuovere le cellule interstiziali; dopo la digestione, questo passaggio aiuta a rimuovere spermatozoi e detriti. Lavare / centrifugare 3 volte è importante. Nella nostra ricetta del tampone di …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri dei laboratori Namekawa, Yoshida e Maezawa per il loro aiuto; Katie Gerhardt per aver modificato il manoscritto; Mary Ann Handel per aver condiviso l’anticorpo H1T, il Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core per la condivisione delle apparecchiature FACS supportate da NIH S10OD023410; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship ad A.S.; da AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; il Research Project Grant della Divisione Servizi di Ricerca dell’Università di Azabu, Programma sostenuto dal Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) per il Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) e Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) a S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 to S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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