Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado
Summary
Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.
Abstract
El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Aunque existen protocolos de aislamiento celular establecidos que utilizan la tinción Hoechst 33342 en combinación con la clasificación celular activada por fluorescencia, requiere clasificadores celulares equipados con un láser ultravioleta. Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV), un tinte de unión de ADN de baja citotoxicidad estructuralmente similar a Hoechst 33342. DcV puede ser excitado por láseres ultravioleta y violeta, lo que mejora la flexibilidad de la elección del equipo, incluyendo un clasificador de células no equipado con un láser ultravioleta. Usando este protocolo, uno puede aislar tres subpoblaciones de células vivas en la profase meótica I, incluyendo leptoteno/zygotene, paquiteno y espermatozoides diploteno, así como espermatozoides redondos post-meyóticos. También describimos un protocolo para preparar la suspensión de una sola célula a partir de testículos de ratón. En general, el procedimiento requiere un corto tiempo para completarse (4-5 horas dependiendo del número de celdas necesarias), lo que facilita muchas aplicaciones posteriores.
Introduction
La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques diferentes para aislar los espermatocitos meyóticos, incluyendo la separación basada en sedimentación6,7 y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones técnicas. Mientras que la separación basada en sedimentación produce un gran número de células5,6,7,es intensiva en mano de obra. El método establecido basado en FACS utiliza Hoechst 33342 (Ho342) para separar los espermatocitos meyóticos basados en el contenido de ADN y las propiedades de dispersión de luz y requiere clasificadores celulares FACS equipados con un láser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Los métodos alternativos basados en FACS requieren líneas de ratón transgénicas que expresen proteínas florescentes, sincronización de espermatogénesis12o fijación celular y etiquetado de anticuerpos que no sea compatible con el aislamiento de células vivas13. Si bien hay otro método alternativo utilizando un tinte de unión de ADN permeable a las células, DyeCycle Green stain14,15,16,17, este método se recomienda para el aislamiento de células espermatogénicas de testículos juveniles. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar un método de aislamiento simple y robusto para los esperatocitos meyóticos vivos que se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón de cualquier edad y que se puede realizar utilizando cualquier clasificador celular FACS.
Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular tan buscado desde hace mucho tiempo utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV). El DCV es un tinte de unión de ADN permeable a la célula de baja citotoxicidad estructuralmente similar al Ho342, pero con un espectro de excitación desplazado hacia el rango violeta18. Además, DCV tiene un espectro de emisiones más amplio en comparación con DCG. Por lo tanto, puede ser excitado por láseres UV y violeta, lo que mejora la flexibilidad del equipo, permitiendo el uso de un clasificador de células FACS no equipado con un láser UV. El protocolo DCV presentado aquí utiliza la separación bidimensional con azul DCV y rojo DCV, imitando la ventaja del protocolo Ho342. Con esta ventaja, nuestro protocolo DCV nos permite aislar células germinales altamente enriquecidas de los testículos adultos. Proporcionamos un protocolo detallado para aislar las células espermatogénicas vivas de los testículos adultos de ratón de un ratón (de dos testículos). También describimos un protocolo eficiente y rápido para preparar la suspensión de una sola célula a partir de pruebas de ratón que se pueden utilizar para este aislamiento de celda. El procedimiento requiere un corto tiempo para completar (preparación de la suspensión de una sola célula – 1 hora, tinción de tinte – 30 min, y clasificación celular – 2-3 horas: total – 4-5 horas dependiendo del número de células necesarias; Figura 1). Después del aislamiento celular, se puede completar una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq y cultivo celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un protocolo práctico y simple para aislar las subpoblaciones de espermatozoides y espermatozoides de un solo ratón macho adulto. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, hay algunos pasos críticos que necesitan atención. Antes de la digestión enzimática, el paso de lavado tiene como objetivo eliminar las células intersticiales; después de la digestión, este paso ayuda a eliminar los espermatozoides y los desechos. Lavar/centrifugar 3 veces es importante. En nuestra receta de tamp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros de los laboratorios Namekawa, Yoshida y Maezawa por su ayuda; Katie Gerhardt por editar el manuscrito; Mary Ann Handel por compartir el anticuerpo H1T, el Núcleo de Citometría de Flujo de Investigación del Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) para compartir el equipo FACS apoyado por NIH S10OD023410; Subvención en Ayuda para la Investigación Científica (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Beca Postdoctoral de la Fundación Lalor a A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; la Beca de Proyectos de Investigación de la División de Servicios de Investigación de la Universidad de Azabu, Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT)-Programa apoyado para el Proyecto de Marca de Investigación de Universidades Privadas (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019), y la Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) a S.M;; Instituto Nacional de Salud R01 GM122776 a S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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