Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Yu-Han Yeh; Mengwen Hu; Toshinori Nakagawa; Akihiko Sakashita; Shosei Yoshida; So Maezawa; Satoshi H. Namekawa

doi:10.3791/61666

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Article de méthode

Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

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DOI :

10.3791/61666

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14 janvier 2021

Yu-Han Yeh^*¹^,² , Mengwen Hu^*¹^,² , Toshinori Nakagawa³^,⁴ , Akihiko Sakashita¹^,² , Shosei Yoshida³^,⁴ , So Maezawa⁵^,⁶ , Satoshi H. Namekawa¹^,²

¹Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ²Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, ³Division of Germ Cell Biology, National Institute for Basic Biology, National Institutes of Natural Sciences, ⁴Department of Basic Biology, School of Life Science, Graduate University for Advanced Studies (Sokendai), ⁵Department of Animal Science and Biotechnology, School of Veterinary Medicine, Azabu University, ⁶Faculty of Science and Technology, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

Résumé

L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la méiose et à la spermatogenèse. Bien qu’il existe des protocoles établis d’isolement cellulaire à l’aide de la coloration Hoechst 33342 en combinaison avec le tri cellulaire activé par fluorescence, il nécessite des trieurs cellulaires équipés d’un laser ultraviolet. Ici nous décrivons un protocole d’isolement cellulaire utilisant la tache de violet de DyeCycle (DCV), un colorant liant d’ADN de basse cytotoxicité structurellement semblable à Hoechst 33342. DCV peut être excité par les lasers ultraviolets et violets, ce qui améliore la flexibilité du choix de l’équipement, y compris un trieur de cellules non équipé d’un laser ultraviolet. En utilisant ce protocole, on peut isoler trois sous-populations de cellules vivantes dans la prophase méiotique I, y compris le leptotene/zygotène, le pachytene et les spermatocytes diplotènes, ainsi que les spermatides ronds post-méiotiques. Nous décrivons également un protocole pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris. Dans l’ensemble, la procédure nécessite un court laps de temps à compléter (4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires), ce qui facilite de nombreuses applications en aval.

Introduction

La spermatogenèse est un processus complexe dans lequel une petite population de cellules souches spermatogoniales soutiennent la production continue d’un grand nombre de spermatozoïdes tout au long de la^{vie adulte 1}^,². Pendant la spermatogenèse, le remodelage dynamique de chromatine a lieu quand les cellules spermatogenic subissent la méiose pour produire des spermatides haploïdes^3,^4,^5. L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel à l’investigation moléculaire, et plusieurs approches différentes pour isoler....