보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리
Summary
여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.
Abstract
메이오성 정자 세포의 격리는 meiosis 및 정자 발생의 근본적인 분자 기계장치를 조사하기 위하여 필수적입니다. Hoechst 33342를 사용하여 세포 격리 프로토콜이 확립되어 있지만 형광 활성화 셀 선별과 함께 염색되지만 자외선 레이저가 장착 된 세포 선별기가 필요합니다. 여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 세포 격리 프로토콜을 설명, 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료는 구조적으로 Hoechst 33342와 유사. DCV는 자외선과 보라색 레이저 모두에 의해 흥분 될 수 있으며, 자외선 레이저가 장착되지 않은 셀 선별기를 포함하여 장비 선택의 유연성을 향상시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나는 렙토텐 / zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 세포뿐만 아니라, 메이오틱 한 후 정자를 포함하여 메이오틱 프PHASE I에서 3 개의 라이브 셀 하위 집단을 격리 할 수 있습니다. 우리는 또한 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 전반적으로 이 절차는 완료하는 데 짧은 시간(필요한 셀 수에 따라 4-5시간)이 필요하며, 이는 많은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.
Introduction
정자 발생은 정자 줄기 세포의 작은 인구가 성인 생활1,2에걸쳐 많은 수의 정자의 지속적인 생산을 유지하는 복잡한 과정이다. 정자 발생 동안, 동적 크로마틴 리모델링은 정자 세포가 혈전증을 유발하여3, 4,5를생성할 때 일어난다. 메이오혈 정자 세포의 분리는 분자 조사에 필수적이며, 퇴적물 계분리6,7 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)8,9,10,11,12,13,14, 14,16, 16, 16, 16, 16을포함하여 메이오틱 정자 세포를 분리하는 몇 가지 다른접근법이확립되었습니다. 그러나 이러한 방법에는 기술적 한계가 있습니다. 침전계 분리는 다수의세포를5,6,7을산출하지만, 노동집약적이다. 설립된 FACS 기반 방법은 Hoechst 33342(Ho342)를 사용하여 DNA 함량 및 광 산란 특성에 따라 메이오틱 정자세포를 분리하고 자외선(UV) 레이저8,9,10,11을갖춘 FACS 세포 선별기가 필요합니다. 대체 FACS 기반 방법은 생동성 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 라인, 정자발생(12)의동기화, 또는 살아있는세포(13)의분리와 호환되지 않는 세포 고정 및 항체 라벨링을 필요로 한다. 세포 투과성 DNA 결합 염료, 염료 자전거 녹색 얼룩14,15,16,17을사용하는 또 다른 대안 방법이 있지만, 이 방법은 청소년 고환으로부터 정자 유발 세포의 분리를 위해 권장된다. 따라서, 모든 연령의 마우스 변형에 적용할 수 있고 어떤 FACS 세포 선별기를 사용하여 수행될 수 있는 살아있는 메이오성 정자 세포에 대한 간단하고 강력한 격리 방법을 개발할 필요가 있다.
여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 이러한 오랫동안 추구 된 세포 격리 프로토콜을 설명합니다. DCV는 호342와 구조적으로 유사하지만 흡개 스펙트럼이 바이올렛범위(18)로이동한 낮은 세포 독성, 세포 투과성 DNA 결합 염료이다. 또한 DCV는 DCG에 비해 광범위한 배기가스 스펙트럼을 가지고 있습니다. 따라서 UV와 바이올렛 레이저가 모두 흥분할 수 있어 장비의 유연성을 향상시켜 UV 레이저가 장착되지 않은 FACS 셀 선별기를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 DCV 프로토콜은 DCV 블루 및 DCV 빨간색으로 2차원 분리를 사용하여 Ho342 프로토콜의 이점을 모방합니다. 이러한 이점을 통해 DCV 프로토콜을 사용하면 고농축 세균 세포를 성인 고환으로부터 분리할 수 있습니다. 우리는 한 마우스 (두 개의 고환에서) 한 마우스의 성인 마우스 고환에서 살아있는 정자 세포를 격리하기 위하여 상세한 게이팅 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 이 세포 격리를 위해 사용될 수 있는 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 효율적이고 빠른 프로토콜을 기술합니다. 절차는 완료하는 짧은 시간이 필요합니다 (단일 세포 현탁액의 준비 – 1 시간, 염색 염색 – 30 분 및 셀 정렬 – 2-3 시간 : 필요한 세포의 수에 따라 총 – 4-5 시간; 그림 1). 세포 격리에 따라 RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq 및 세포 배양을 포함한 광범위한 다운스트림 응용 프로그램을 완료할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 단일 성인 남성 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 인구를 격리하기 위하여 실용적이고 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 효소 소화 전에, 세척 단계는 간질 세포를 제거하는 것을 목표로; 소화 후,이 단계는 정자와 파편을 제거하는 데 도움이됩니다. 세탁/원심 분리는 3배나 중요합니다. 우?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
네카와, 요시다, 마에자와 연구소 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 원고편집을 위한 케이티 게르하르트; H1T 항체를 공유하기위한 메리 앤 헨델, 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC) NIH S10OD023410에 의해 지원 되는 FACS 장비를 공유 하기 위한 연구 흐름 사이토 메 트리 코어; 과학 연구를 위한 보조금 지원 (KAKENHI; 17K07424) T.N.에; Lalor 재단 박사 후 A.S.에 대한 펠로우십; AMED-CREST (JP17gm110005h00001) – S.Y.; 아자부대학 연구서비스부, 교육부, 문화체육과학기술부(MEXT) 지원 프로그램 (2016~2019), 연구활동 스타트업 보조금 지원(19K21196), 다케다과학재단(2019), 우에하라재단(2019년.M) 건강의 국립 연구소 R01 GM122776 에 S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
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