Summary
Divers modèles animaux d’hernie diaphragmatique congénitale et d’occlusion trachéale fœtale présentent des avantages et des inconvénients en ce qui concerne les questions éthiques, le coût, la difficulté chirurgicale, la taille, les taux de survie et la disponibilité des outils génétiques. Ce modèle fournit un nouvel outil pour étudier l’impact de l’occlusion trachéale et de la pression luminaire accrue sur le développement pulmonaire.
Abstract
L’occlusion trachéale foetale (TO), une modalité établie de traitement, favorise la croissance et la survie foetales de poumon dans l’hernie diaphragmatique congénitale grave (CDH). Après to, la rétention du fluide épithélial sécrété augmente la pression luminaire et induit la croissance pulmonaire. Divers modèles animaux ont été définis pour comprendre la pathophysiologie du CDH et du TO. Tous ont leurs propres avantages et inconvénients tels que la difficulté de la technique, la taille de l’animal, le coût, les taux de mortalité élevés, et la disponibilité des outils génétiques. Ci-après, un nouveau modèle transuté de to fœtal murin est décrit. Les souris enceintes ont été anesthésiés, et l’utérus exposé par une laparotomie de midline. La trachée des foetus choisis ont été ligated avec une suture transutéine simple placée derrière la trachée, une artère carotide, et une veine jugulaire. Le barrage a été fermé et a été autorisé à récupérer. Des foetus ont été rassemblés juste avant la parturition. Le rapport poumon/poids corporel chez les fœtus TO était plus élevé que celui des fœtus de contrôle. Ce modèle fournit aux chercheurs un nouvel outil pour étudier l’impact de la to et de la pression luminaire accrue sur le développement pulmonaire.
Introduction
L’hernie diaphragmatique congénitale (CDH) se produit dans 1:2500 grossesses et a comme résultat l’hypoplasie pulmonaire et l’hypertension pulmonairenéonatale 1,2,3,4,5,6. L’occlusion trachéale foetale (TO) est une thérapie prénatale établie dans les patients graves de CDH impliquant la fetoscopy dans la semaine gestationnelle 26-30e dans laquelle un ballon est placé juste au-dessus de la carina et puis enlevé dans la semaine gestationnelle de 32nd. Ce TO temporaire induit la croissance pulmonaire fœtale et améliore la survie. Le syndrome congénital d’obstruction de voie aérienne élevée est une condition mortelle liée à l’hyperplasie pulmonaire, qui a inspiré des chirurgiens pour exécuter l’occlusion artificielle de la trachée pour favoriser la conservation du fluide épithélial sécrété. Cette occlusion a augmenté la pression luminaire et induit la croissance pulmonaire7. Cependant, l’occlusion devrait être inversée pour permettre la maturation épithéliale de cellules.
Divers modèles animaux de CDH et TO - ovine, lapin, rat et souris - ont été développés pour comprendre la pathophysiologie du CDH et du TO. Tous ont leurs propres avantages et inconvénients tels que la difficulté de la technique, la taille de l’animal, le coût, les taux de mortalité élevés, et la disponibilité des outils génétiques. Bien que la technique chirurgicale utilisée pour le modèle de l’ovine soit très similaire à celle utilisée chez l’homme et pourrait être inversée, les principaux inconvénients de ce modèle sont les dépenses de l’animal, la longue période gestationnelle et le nombre limité de chirurgies possibles. Le modèle lapin a une période gestationnelle plus courte et est moins cher que le modèle de mouton. Cependant, le modèle de lapin est irréversible8,9. Le modèle murin a le coût le plus bas, le plus grand nombre de foetus par grossesse, le génome le mieux caractérisé, et des outils largement disponibles pour des analyses cellulaires et moléculaires. Cependant, un inconvénient clé est le manque de réversibilité du TO, empêchant la pleine compréhension de l’impact de TO. Dans ce cas, une méthode est présentée qui combine tous les avantages des modèles mentionnés précédemment et crée un modèle facile, potentiellement réversible, et peu envahissant de rongeur TO.
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Protocol
Toutes les expériences ont été conformes au Guide national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications no 80023, révisé en 1978). La procédure a été approuvée avec le protocole IACUC #2016-0068 par le Cincinnati Children’s Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Préparation
- Pour accoupler les souris C57BL/6 de type sauvage assorties à l’âge, placez-les dans la même cage à 18 h.m et séparez-les à 9 h.m le lendemain.
- Pour déterminer le jour embryonnaire 0 (E0), regardez la fiche vaginale, qui a une zone extérieure homogène attachée à la paroi vaginale et une zone intérieure qui est fibreuse et comprend quelques spermatozoa qui forment des masses emmêlés mélangés avec les fibres du matériau plug.
- Enregistrez le poids des souris au moment de l’accouplement.
- Re-peser les souris sur E10 pour assurer la grossesse en cours.
- Effectuer la chirurgie sur E16.5 (stade canaliculaire précoce).
- Stériliser les instruments qui vont être utilisés pendant la chirurgie: ciseaux, porte-aiguilles, pinces, pinces, couteaux chirurgicaux et poignées.
- Préchauffer la plate-forme chirurgicale à 24 °C et préparer la solution saline chaude (24 °C) avant la chirurgie.
- Créez un environnement chaud pour la récupération et laissez les aliments humides à l’intérieur de la cage pour l’alimentation précoce.
- Restez avec les animaux opérés jusqu’à ce qu’ils puissent se nourrir eux-mêmes.
- Gardez les souris opérées seules dans leurs cages individuelles après l’opération.
2. Anesthésie
- Appliquer sous-cutanée 0,1 mg/kg de buprénorphine sur les mères enceintes 1 h avant l’intervention.
- Utiliser inhalé 5 mL/h d’isoflurane pour l’induction et 2 mL/h en continu pendant la procédure d’anesthésie.
- Surveiller les mouvements des mentons des souris enceintes.
3. Laparotomie
- Nettoyez la surface abdominale avec de l’alcool et de la povidone-iode. Maintenir des conditions stériles tout au long de l’opération.
- Effectuer une incision verticale pour la laparotomie des mères enceintes. Couper toutes les couches séparément.
- Identifier les cornes utérine de chaque côté.
- Déterminer les fœtus candidats à la chirurgie.
REMARQUE : N’œlez pas sur les fœtus les plus proches du vagin. - Opérer sur deux fœtus dans chaque corne utérine s’il y a un nombre même de fœtus de chaque côté (4 la plupart du temps), et sur 1 fœtus dans chaque corne utérine s’il y a un nombre impair de l’utérus(3 la plupart du temps).
4. Occlusion trachéale
- Utilisez des loupes 2,5 x pour la visualisation.
- Placez la corne utérine d’une manière transversale.
- Prenez les chiots, orientés vers le haut, entre deux doigts en utilisant les yeux des chiots et la queue comme un guide pour positionner le fœtus.
- Appliquer une pression douce sur la tête du chiot pour permettre l’extension de la tête et donc, la visualisation du cou.
- Utilisez une suture de polypropylène de 6,0 avec une aiguille atraumatique pour effectuer TO (Figure 1). Gardez le placenta sur le côté et loin des points d’entrée et de sortie de l’aiguille.
- Insérez l’aiguille transversalement à travers le côté de l’utérus loin du placenta à travers la partie antérieure 1/3rd du cou.
- Déplacez doucement l’aiguille jusqu’à la ligne médiane du cou et dirigez-la vers la partie antérieure, puis sortez du cou entre la trachée et en face de la gaine et de l’utérus carotides.
- Nouez la suture, en prenant soin de maintenir l’intégrité des membranes et de la paroi utérine, et de garder le cordon ombilical en toute sécurité pendant le nouage.
Figure 1: Occlusion trachéale. (A) La suture transuté marine passant par le cou. (B) Représentation schématique des structures après le passage de la suture à travers et avant le nœud. Abréviations: C = Artère carotide; J = Veine jugulaire; T =Trachée; E = Œsophage; V = Vertèbre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
5. Fermeture abdominale de mur
- Remplacer la corne utérine dans l’abdomen.
- Injecter 2 mL de solution saline stérile chaude dans la cavité péritonéale avant la fermeture.
- Mettez une suture de polyglactine 5/0 en cours d’exécution pour fermer la paroi abdominale, et fermez la peau avec une suture de soie non courante.
- Appliquer 0,1 mg/kg de buprénorphine intrapénitéralement pour l’analgésie, et permettre la récupération du barrage dans un incubateur chaud.
6. Récolte
- Appliquer l’anesthésie sur la mère enceinte, et récolter tous les fœtus à E18,5 par césarienne.
- Vérifiez la viabilité des fœtus en observant les mouvements des fœtus.
- Utilisez au moins deux techniques différentes pour l’euthanasie : l’insufflation de dioxyde de carbone et la dislocation cervicale.
- Enlever les corps selon la réglementation du laboratoire vétérinaire.
- Pesez tous les fœtus.
- Effectuer une incision verticale sur le thorax pour la thoracotomie pour enlever les poumons.
- Disséquer les poumons des embryons et les peser pour calculer le rapport poids total poumon/corps (LBWR = (poids du poumon gauche + poids du poumon droit)/poids corporel x100).
7. Histologie
- Congelez les tissus dans de l’azote liquide, un composé optimal de température de coupe et de la glace sèche.
- Couper les échantillons en sections de 10 μm à l’aide d’un cryostat et les monter sur des glissières recouvertes de polylysine.
- Cuire les diapositives à 60 °C pendant la nuit et tacher les glissières cuites au four avec de l’hématoxyline et de l’éosine avant de les monter pour l’acquisition d’images à 10-20 x grossissement à l’aide d’un microscope à champ large.
8. Traitement des tissus pour les analyses des protéines et de l’ADN
- Congelez les poumons foetaux disséqués et homogénéisez-les dans 300 μL de tampon d’analyse de radioimmunoprécipation. Centrifugeuse à 4 °C pendant 5 min à 18 000 × g.
- Extraire et quantifier les protéines, l’ADN etl’ARN 10,12.
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Representative Results
Cette étude a examiné 37 fœtus : 20 (54,1 %) comme TO contre 17 (45,9%) comme contrôle. Comme la trachée ne pouvait pas être occluse chez 4 fœtus du groupe TO, ils ont été exclus de l’étude. Il n’y avait aucune différence significative dans la mortalité dans les deux groupes : 4 foetus (25%) dans le groupe TO et 2 fœtus (12%) dans le groupe témoin (p=0,334, rapport de cotes (OR) 2,5, intervalle de confiance de 95 % (IC) 0,39-16,05). Le poids corporel moyen, le poids pulmonaire et le rapport poids poumon/corps (LBWR) étaient plus élevés dans le groupe TO que dans le groupe témoin (tableau 1). Il y avait une différence significative dans LBWR (p=0.006) entre le TO et les groupes de contrôle.
L’ADN, l’ARN et les protéines ont été quantifiés pour déterminer la raison de la différence dans le LBWR (Figure 2). Les quantités d’ADN pulmonaire et le rapport ADN/protéine étaient plus élevés dans le groupe TO, aucune différence n’a été observée dans l’ARN pulmonaire, et les quantités de protéines étaient plus faibles dans le groupe TO que dans le groupe témoin, comme précédemment observé dans le modèle de TO de lapin dans lequel l’hyperplasie épithéliale a éténotée 12. Les diamètres des voies respiratoires du groupe TO ont également démontré une augmentation.
Les analyses histologiques des poumons E18.5 ont montré le stade canaliculaire/sacculaire tardif du développement pulmonaire avec des espaces aériens en développement et un interstitium épaissi entre les surfaces épithéliales dans les échantillons de contrôle, tandis que les poumons du groupe TO avaient dilaté les espaces aériens centraux et distals avec un nombre subjectivement plus élevé de noyaux (figure 2). Cette cellularité accrue est compatible avec l’augmentation notée de la quantité d’ADN pulmonaire.
Figure 2: Caractéristiques des groupes. (A) Rapport normalisé de poids de poumon à foetus, (B) RAPPORT d’ADN de poumon à protéine, (C) teneur en ADN de poumon normalisée au poids de poumon, (D) teneur en ARN de poumon normalisée au poids de poumon, et (E) teneur en protéine pulmonaire normalisée au poids de poumon. F) Images représentatives d’hématoxyline et d’éosine de poumons C57BL/6 E18.5 sans (barre d’échelle = 50 μm) et ( G )avecocclusion trachéale transutétale foetale montrant l’hyperplasie des voies aériennes de conduite et la taille accrue des espaces aériens distals ; barre à l’échelle = 100 μm. La comparaison du contrôle (n=9) et de l’occlusion trachéale (TO) (n=6) a été effectuée à l’aide du t-test de l’élève. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tableau 1 : Résultats morphométriques des groupes | |||
| À | contrôle | p | |
| Poids du fœtus (mg) | 1100,52 ± 229,38 | 1087,15 ± 172,32 | 0.896 |
| Poids des poumons (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23h38 ± 3,09 | 0.043 |
| LBWR (en) | 0,0259 ± 0,0021 | 0,0217 ± 0,0028 | 0,006* |
| Valeurs exprimées comme moyens ± écarts types. Abréviations : LBWR = Rapport poids corporel de poumon à foetal ; TO = occlusion trachéale. | |||
| *Intervalle de confiance de 95 % 0,0222-0,0249. Groupes comparés par t-test de l’étudiant. | |||
Tableau 1 : Résultats morphométriques des groupes
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Discussion
Cette méthode décrit une procédure chirurgicale d’occlusion trachéale foetale chez la souris et son impact sur le développement de poumon. Il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui devraient être soigneusement exécutées pour réussir TO. La chaleur de la plate-forme sur laquelle la chirurgie a lieu et la solution saline introduite dans la cavité péritonéale est cruciale pour la progression de la grossesse. En outre, une légère pression doit être appliquée sur la tête des chiots pour assurer l’exposition du cou.
Une suture de polypropylène 6,0 est la seule suture qui peut être utilisée pour cette technique. Les aiguilles des sutures de plus de 6,0 sont plus épaisses et détruisent les structures autour de la trachée dans le cou, entraînant la perte du fœtus. Les aiguilles des sutures plus minces sont très courtes et ne peuvent pas passer par le cou d’un chiot E16.5 (stade canaliculaire précoce). De plus, une aiguille de coupe n’est pas appropriée car elle pourrait détruire les structures adjacentes.
Ce modèle a certaines limites. Premièrement, il existe une différence dans la corrélation entre les stades de développement pulmonaire et la période gestationnelle entre les souris et les humains. Deuxièmement, il est difficile de développer le CDH chez la souris et enfin, les études hémodynamiques sont difficiles à mener dans les modèles muraux. Cependant, la courbe d’apprentissage courte dans cette étude a eu comme conséquence une diminution dramatique du taux foetal de mortalité. Comme indiqué précédemment, le coût des animaux ainsi que leur entretien, le nombre de fœtus par grossesse, la durée de la période de grossesse et la disponibilité limitée des outils génétiques sont les principaux facteurs limitants dans les modèles de lapins et de moutons.
Le premier avantage de ce modèle de souris est qu’il élimine le besoin d’hystéromie pour to et a le potentiel d’être inversé in utero11, ce qui explique les faibles taux de mortalité observés dans cette étude. Deuxièmement, la réduction du coût des animaux et de leur entretien et une période de grossesse plus courte facilitent un plus grand éventail d’expériences. Troisièmement, les causes non techniques de complications, comme l’hypothermie et l’anesthésie, sont prévenues par la courte durée de la chirurgie. Enfin, la grande variété d’outils génétiques disponibles chez la souris mènera à plus d’études pour comprendre la pathophysiologie du CDH. L’ablation de la suture transutérine avec la naissance vivante du fœtus dans les modèles nitrofène et knockout de CDH sera les futures applications de cette technique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche n’a reçu aucune subvention spécifique d’organismes de financement des secteurs public, commercial ou sans but lucratif. Tous les auteurs ont apporté des contributions substantielles à la conception et à la conception de l’étude, à l’acquisition, à l’analyse et à l’interprétation des données, à la rédaction de l’article et à sa révision pour le contenu intellectuel important et l’approbation finale de la version à soumettre. Les auteurs remercient Can Sabuncuoğlu pour ses efforts aimables sur la production de l’œuvre d’art de la technique chirurgicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
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