Summary
Konjenital diyafram fıtığı ve fetal trakeal tıkanıklık gibi çeşitli hayvan modelleri etik konular, maliyet, cerrahi zorluk, boyut, sağkalım oranları ve genetik araçların mevcudiyeti ile ilgili avantaj ve dezavantajlar sürmektedir. Bu model, hem trakeal tıkanıklık hem de artan ışık basıncının akciğer gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için yeni bir araç sağlar.
Abstract
Yerleşik bir tedavi yöntemi olan fetal trakeal oklüzyon (TO), şiddetli konjenital diyafram fıtığı (CDH) fetal akciğer büyümesini ve sağkal sağkalımı destekler. TO'yu takiben, salgılanan epitel sıvısının tutulması ışık basıncını arttırır ve akciğer büyümesine neden olan. CDH ve TO patofizyolojisini anlamak için çeşitli hayvan modelleri tanımlanmıştır. Tekniğin zorluğu, hayvanın büyüklüğü, maliyet, yüksek ölüm oranları ve genetik araçların mevcudiyeti gibi hepsinin kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Burada, murine fetal TO'nun yeni bir transuterin modeli tanımlanmıştır. Hamile fareler uyuşturuldu ve rahim orta çizgi laparotomi yoluyla maruz kaldı. Seçilen fetüslerin trakeası, trakeanın arkasına yerleştirilen tek bir transuterin dikiş, bir şahdamar ve bir şah damarı ile bağlandı. Baraj kapatıldı ve iyileşmesine izin verildi. Fetüsler parçalandırılmadan hemen önce toplandı. TO fetüslerinde akciğer-vücut ağırlığı oranı kontrol fetüslerindekinden daha yüksekti. Bu model, araştırmacılara hem TO'nun hem de artan ışık basıncının akciğer gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için yeni bir araç sağlar.
Introduction
Konjenital diyafram fıtığı (CDH) 1:2500 gebelikte ortaya çıkar ve pulmoner hipoplazi ve yenidoğan pulmoner hipertansiyon 1,2 ,3,4,5,6ile sonuçlanır. Fetal trakeal oklüzyon (TO), 26-30. gebelik haftasında fetoskopi içeren ağır CDH hastalarında, bir balonun karinanın hemen üzerine yerleştiği ve daha sonra 32nd gebelik haftasında çıkarıldığı yerleşik bir prenatal tedavidir. Bu geçici TO fetal akciğer büyümesini teşvik eder ve sağkalım geliştirir. Konjenital Yüksek Hava Yolu Tıkanıklığı Sendromu, cerrahlara salgılanan epitel sıvısının tutulmasını teşvik etmek için trakeanın yapay tıkanıklığını gerçekleştirmeleri için ilham veren akciğer hiperplazisi ile ilişkili ölümcül bir durumdur. Bu tıkanma ışık basıncıyı artırdı ve akciğer büyümesine neden oldu7. Bununla birlikte, epitel hücre olgunlaşmasını sağlamak için tıkanıklık tersine çevrilmelidir.
CDH ve TO'nun çeşitli hayvan modelleri - yumurta, tavşan, sıçan ve fare - CDH ve TO'nun patofizyolojisini anlamak için geliştirilmiştir. Tekniğin zorluğu, hayvanın büyüklüğü, maliyet, yüksek ölüm oranları ve genetik araçların mevcudiyeti gibi hepsinin kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Yumurta modeli için kullanılan cerrahi teknik insanlarda kullanılana çok benzer ve tersine çevrilebilir olsa da, bu modelin en büyük dezavantajları hayvanın masrafı, uzun gebelik süresi ve mümkün olan sınırlı sayıda ameliyattır. Tavşan modeli daha kısa bir gebelik süresine sahiptir ve koyun modelinden daha ucuzdur. Ancak, tavşan modeli geri döndürülemez8,9. Murine modeli en düşük maliyete, gebelik başına en yüksek fetüs sayısına, en iyi karakterize genoma ve hücresel ve moleküler analizler için yaygın olarak bulunan araçlara sahiptir. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, TO'nun etkisinin tam olarak anlaşılmasını önleyen, TO'nun geri döndürülebilir olmamasıdır. Burada, daha önce bahsedilen modellerin tüm avantajlarını birleştiren ve kolay, potansiyel olarak geri döndürülebilir ve minimal invaziv bir kemirgen TO modeli oluşturan bir yöntem sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne (NIH Yayınları No. 80023, revize 1978) uygundur. Prosedür, Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından #2016-0068 IACUC protokolü ile onaylandı.
1. Hazırlık
- Yaşla eşleşen vahşi tip (WT) C57BL/6 fareleri çiftleşmek için, onları saat 18:00'de aynı kafese yerleştirin.m ve ertesi gün saat 9:00'da.m ayırın.
- Embriyonik gün 0'ı (E0) belirlemek için, vajina duvarına bağlı homojen bir dış bölgeye ve lifli bir iç bölgeye sahip olan ve fiş malzemesinin lifleriyle karıştırılmış dolaşmış kitleler oluşturan bazı spermatozoa içeren vajinal tıkaçlara bakın.
- Çiftleşme anında farelerin ağırlığını kaydedin.
- Devam eden hamileliği sağlamak için fareleri E10'da yeniden tartın.
- Ameliyatı E16.5 (erken canaliküler evre) üzerinde gerçekleştirin.
- Ameliyat sırasında kullanılacak aletleri sterilize edin: makas, iğne tutucu, tokalar, kelepçeler ve cerrahi bıçaklar ve tutamaklar.
- Ameliyat platformunu 24 °C'ye ısıtın ve ameliyattan önce ılık salin (24 °C) hazırlayın.
- İyileşme için sıcak bir ortam yaratın ve erken beslenme için kafesin içinde ıslak yiyecekler bırakın.
- Kendilerini besleyene kadar işletilen hayvanların yanında kalın.
- Ameliyat edilen fareleri ameliyattan sonra bireysel kafeslerinde yalnız tutun.
2. Anestezi
- İşlemden 1 saat önce hamile barajlarına 0,1 mg/kg buprenorfin deri altı uygulayın.
- İndüksiyon için inhale 5 mL/h izofluran ve anestezi işlemi sırasında sürekli olarak 2 mL/sa kullanın.
- Hamile farelerin çene hareketlerini izleyin.
3. Laparotomi
- Karın yüzeyini alkol ve povidon-iyot ile temizleyin. Operasyon boyunca steril koşulları koruyun.
- Hamile barajların laparotomi için dikey bir kesi gerçekleştirin. Tüm katmanları ayrı ayrı kesin.
- Her iki taraftaki rahim boynuzlarını tanımlayın.
- Ameliyat için aday fetüsleri belirleyin.
NOT: Vajinaya en yakın olan fetüsleri ameliyat etmeyin. - Her iki tarafta eşit sayıda fetüs varsa (çoğu zaman 4) her rahim boynuzunda iki fetüs ve uterusun tek bir sayısı varsa her rahim boynuzunda 1 fetüs üzerinde (çoğu zaman 3) ameliyat et.
4. Trakeal tıkanma
- Görselleştirme için 2,5x büyütme gözlüğü kullanın.
- Rahim boynuzu enine bir şekilde konumlandırın.
- Yavruları yukarı bakacak şekilde, yavruların gözlerini ve kuyruğunu fetüse konumlandırmak için bir rehber olarak kullanarak iki parmak arasına alın.
- Başın uzatılmasına ve dolayısıyla boynun görselleştirilmesine izin vermek için yavrunun kafasına hafif basınç uygulayın.
- TO(Şekil 1)gerçekleştirmek için atravmatik iğne ile 6.0 polipropilen dikiş kullanın. Plastantayı iğnenin giriş ve çıkış noktalarından uzakta ve yan tarafta tutun.
- İğneyi uterusun yanından enine bir şekilde plasetadan boynun 1/3rd ön kısmına yerleştirin.
- İğneyi boynun orta çizgisine kadar hafifçe hareket ettirip ön kısmaya yönlendirin, ardından boyundan trakea arasında ve şahdabı kılıfı ve uterusun karşısında çıkın.
- Dikişi düğümle, zarların ve rahim duvarının bütünlüğünü korumaya ve düğümleme sırasında göbek kordonu güvende tutmaya özen göster.
Şekil 1: Trakeal oklüzyon. (A) Boyundan geçen transuterin dikiş. (B) Dikiş geçtikten sonra ve düğümden önce yapıların şematik gösterimi. Kısaltmalar: C = Karotid arter; J = Şahdamarı; T =Trakea; E = Yemek Borusu; V = Omur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Karın duvarı kapatma
- Karın bölgesindeki rahim boynuzu değiştirin.
- Kapanmadan önce periton boşluğuna 2 mL ılık steril salin enjekte edin.
- Karın duvarını kapatmak için çalışan bir 5/0 poliglactin dikişi koyun ve cildi çalışmayan bir ipek dikişle kapatın.
- Analjezi için intraperitoneal olarak 0,1 mg/kg buprenorfin uygulayın ve barajın ılık bir inkübatörde geri kazanılmasına izin verin.
6. Hasat
- Gebe barajına anestezi uygulayın ve E18.5'teki tüm fetüsleri sezaryenle hasat edin.
- Fetüslerin hareketlerini izleyerek fetüslerin canlılığını kontrol edin.
- Ötenazi için en az iki farklı teknik kullanın: karbondioksit insufflation ve servikal çıkık.
- Veteriner laboratuvarının yönetmeliğine göre cesetleri çıkarın.
- Tüm fetüsleri tartın.
- Akciğerleri çıkarmak için toraksotomi için toraks üzerinde dikey bir kesi gerçekleştirin.
- Embriyoların akciğerlerini parçalara ayrılın ve toplam akciğer-vücut ağırlığı oranını hesaplamak için tartın (LBWR = (sol akciğer ağırlığı + sağ akciğer ağırlığı)/vücut ağırlığı x100).
7. Histoloji
- Dokuları sıvı nitrojen, optimum kesme sıcaklığı bileşiği ve kuru buzda çıtlatın.
- Numuneleri kriyostat kullanarak 10 μm bölümde kesin ve poli lizin kaplı slaytlara monte edin.
- Slaytları gece boyunca 60 °C'de pişirin ve pişmiş slaytları hematoksilin ve eozin ile lekeleyin ve geniş alan mikroskobu kullanarak 10-20x büyütmede görüntü alımı için monte edin.
8. Protein ve DNA analizleri için doku işleme
- Parçalanmış fetal akciğerleri çıtlatın ve 300 μL radyoimmünötepektasyon test tamponunda homojenize edin. 4 °C'de 5 dakika 18.000 × g'da santrifüj.
- Protein, DNA ve RNA10,12'yiçıkarın ve ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada 37 fetüs incelendi: 20 (%54.1) TO ve 17 (%45,9) olarak kontrol olarak. TO grubundaki 4 fetüste trakea tıkanamadığı için çalışma dışı bırakıldı. Her iki grupta da mortalitede anlamlı bir fark yoktu: 4 fetüs (%25) TO grubunda ve 2 fetüste (%12) kontrol grubunda (p=0.334, oran oranı (OR) 2.5, %95 güven aralığı (CI) 0.39-16.05). Ortalama vücut ağırlığı, akciğer ağırlığı ve akciğer-vücut ağırlığı oranı (LBWR) TO grubunda kontrol grubuna göre daha yüksekti(Tablo 1). TO ve kontrol grupları arasında LBWR (p=0.006) arasında anlamlı bir fark vardı.
DNA, RNA ve protein LBWR'deki farkın nedenini belirlemek için ölçüldü (Şekil 2). Akciğer DNA miktarları ve DNA/protein oranı TO grubunda daha yüksekti, akciğer RNA'sında fark görülmedi ve protein miktarları, daha önce epitel hiperplazisinin belirtildiği tavşan TO modelinde gözlemlendiği gibi, KONTROL GRUBUNA göre TO grubunda daha düşüktü12. TO grubundaki hava yollarının çapları da bir artış gösterdi.
E18.5 akciğerlerinin histolojik analizleri, gelişmekte olan hava sahaları ve kontrol örneklerindeki epitel yüzeyler arasında kalınlaşmış intersityum ile akciğer gelişiminin geç kanaliküler/erken sakküler evresini gösterirken, TO grubundaki akciğerler merkezi ve distal hava sahalarını öznel olarak daha yüksek sayıda çekirdekle genişletmiştir(Şekil 2). Bu artan hücresellik, akciğer DNA miktarındaki belirtilen artışla tutarlıdır.
Şekil 2: Grupların özellikleri. (A) Akciğerden fetüs kilo oranına normalleştirilmiş, (B) Akciğer DNA'sı protein oranına, (C) Akciğer DNA içeriği akciğer ağırlığına normalleştirilmiş, (D) Akciğer RNA içeriği akciğer ağırlığına normalleştirilmiş ve (E) Akciğer protein içeriği akciğer ağırlığına normalleştirilmiştir. (F) C57BL/6 E18.5 akciğersiz (ölçek çubuğu = 50 μm) ve(G)fetal transuterin trakeal oklüzyon ile iletim hava yollarının hiperplazisini ve distal hava sahalarının boyutunu gösteren temsilci hematoksilin ve eozin görüntüleri; ölçek çubuğu = 100 μm. Kontrol (n=9) ve trakeal tıkanıklık (TO) (n=6) karşılaştırması Student's t-test kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tablo 1: Grupların morfometrik sonuçları | |||
| Hedef | kontrol | P | |
| Fetüs ağırlığı (mg) | 1100,52 ± 229,38 | 1087,15 ± 172,32 | 0.896 |
| Akciğer ağırlığı (mg) | 28,41 ± 5,87 | 23,38 ± 3,09 | 0.043 |
| LBWR | 0,0259 ± 0,0021 | 0,0217 ± 0,0028 | 0.006* |
| Standart sapmalar ± anlamına gelen değerler. Kısaltmalar: LBWR = Akciğer-Fetal Vücut Ağırlığı Oranı; TO = trakeal tıkanıklık. | |||
| *%95 Güven Aralığı 0.0222–0.0249. Öğrenci t testi ile karşılaştırılan gruplar. | |||
Tablo 1: Grupların morfometrik sonuçları
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, farelerde fetal trakeal tıkanıklık cerrahi bir prosedürü ve akciğer gelişimi üzerindeki etkisini açıklar. Başarılı TO için protokolde dikkatle gerçekleştirilmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Ameliyatın gerçekleştiği platformun sıcaklığı ve periton boşluğuna sokulan salin gebeliğin ilerlemesi için çok önemlidir. Ek olarak, boynun maruz kalmasını sağlamak için yavruların başına hafif bir basınç uygulanmalıdır.
6.0 polipropilen dikiş bu teknik için kullanılabilecek tek dikiştir. 6.0'dan büyük dikişlerin iğneleri daha kalındır ve boyundaki trakea etrafındaki yapıları tahrip ederek fetüsün kaybına neden olabilir. Tiner dikişlerinin iğneleri çok kısadır ve bir E16.5 yavrusunun boynundan geçemez (erken kanaliküler evre). Ayrıca, bir kesme iğnesi bitişik yapıları tahrip edebileceğinden uygun değildir.
Bu modelin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, fareler ve insanlar arasındaki akciğer gelişim evreleri ve gebelik döneminin korelasyonunda bir fark vardır. İkincisi, farelerde CDH geliştirmek zordur ve son olarak, fare modellerinde hemodinamik çalışmaların yapılması zordur. Bununla birlikte, bu çalışmadaki kısa öğrenme eğrisi fetal ölüm oranında dramatik bir azalmaya neden oldu. Daha önce de belirtildiği gibi, hayvanların bakımlarının yanı sıra, gebelik başına fetüs sayısı, hamilelik süresinin uzunluğu ve genetik araçların sınırlı mevcudiyeti tavşan ve koyun modellerinde ana sınırlayıcı faktörlerdir.
Bu fare modelinin ilk avantajı, TO için histerotomi ihtiyacını ortadan kaldırması ve utero11'de tersine çevrilme potansiyeline sahip olması bu çalışmada gözlenen düşük ölüm oranlarını hesaba katıldığıdır. İkincisi, hayvanların maliyetindeki azalma ve bakımları ve daha kısa bir hamilelik süresi daha geniş bir deney yelpazesini kolaylaştırır. Üçüncü olarak, hipotermi ve anestezi gibi komplikasyonların teknik olmayan nedenleri kısa ameliyat süresi ile önlenir. Son olarak, farelerde bulunan çok çeşitli genetik araçlar, CDH'nin patofizyolojisini anlamak için daha fazla çalışmaya yol açacaktır. CDH'nin nitrofen ve nakavt modellerinde fetüsün canlı doğumu ile transuterin dikişin çıkarılması bu tekniğin gelecekteki uygulamaları olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, kamu, ticari veya kar amacı gütmeyen sektörlerdeki fon kuruluşlarından belirli bir hibe almamaktadır. Tüm yazarlar, çalışmanın gebeliğine ve tasarımına, verilerin edinilmesine, analizine ve yorumlanmasına, makalenin hazırlanmasına ve önemli entelektüel içerik ve sunulacak sürümün nihai onayı için revize edilmesine önemli katkılarda bulundular. Yazarlar Can Sabuncuoğlu'na cerrahi tekniğin sanat eserinin üretilmesi konusundaki nazik çabaları için teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
