Summary
Varios modelos animales de hernia diafragmática congénita y oclusión traqueal fetal presentan ventajas y desventajas con respecto a cuestiones éticas, costo, dificultad quirúrgica, tamaño, tasas de supervivencia y disponibilidad de herramientas genéticas. Este modelo proporciona una nueva herramienta para estudiar el impacto de la oclusión traqueal y el aumento de la presión luminal en el desarrollo pulmonar.
Abstract
La oclusión traqueal fetal (TO), una modalidad de tratamiento establecida, promueve el crecimiento pulmonar fetal y la supervivencia en hernia diafragmática congénita grave (CDH). Después de TO, la retención del líquido epitelial secreto aumenta la presión luminal e induce el crecimiento pulmonar. Se han definido varios modelos animales para entender la fisiopatología de CDH y TO. Todos tienen sus propias ventajas y desventajas como la dificultad de la técnica, el tamaño del animal, el costo, las altas tasas de mortalidad y la disponibilidad de herramientas genéticas. En este documento, se describe un nuevo modelo transuterino de TO fetal murino. Los ratones embarazadas fueron anestesiados y el útero expuesto a través de una laparotomía de línea media. La tráquea de fetos seleccionados se ligaron con una sola sutura transuterina colocada detrás de la tráquea, una arteria carótida y una vena yugular. La presa fue cerrada y se le permitió recuperarse. Los fetos fueron recogidos justo antes de la parto. La relación entre pulmón y peso corporal en los fetos TO fue mayor que la de los fetos de control. Este modelo proporciona a los investigadores una nueva herramienta para estudiar el impacto de to y aumento de la presión luminal en el desarrollo pulmonar.
Introduction
La hernia diafragmática congénita (CDH) ocurre en 1:2500 embarazos y da como resultado hipoplasia pulmonar e hipertensión pulmonar neonatal1,2,3,4,5,6. La oclusión traqueal fetal (TO) es una terapia prenatal establecida en pacientes graves con CDH que involucran fetoscopia en la semanagestacional 26-30 en la que se coloca un globo justo por encima de la carina y luego se retira en la semanagestacional 32. Este TEMPORAL PARA INducir el crecimiento pulmonar fetal y mejora la supervivencia. El síndrome congénito de obstrucción de las vías respiratorias altas es una condición letal asociada con la hiperplasia pulmonar, que inspiró a los cirujanos a realizar la oclusión artificial de la tráquea para promover la retención del líquido epitelial secreto. Esta oclusión aumentó la presión luminal y indujo el crecimiento pulmonar7. Sin embargo, la oclusión debe revertirse para permitir la maduración de células epiteliales.
Varios modelos animales de CDH y TO - ovino, conejo, rata y ratón - han sido desarrollados para entender la fisiopatología de CDH y TO. Todos tienen sus propias ventajas y desventajas como la dificultad de la técnica, el tamaño del animal, el costo, las altas tasas de mortalidad y la disponibilidad de herramientas genéticas. Aunque la técnica quirúrgica utilizada para el modelo ovino es muy similar a la utilizada en los seres humanos y podría revertirse, los principales inconvenientes de este modelo son el gasto del animal, el largo período gestacional y el número limitado de cirugías posibles. El modelo de conejo tiene un período gestacional más corto y es menos costoso que el modelo de oveja. Sin embargo, el modelo de conejo es irreversible8,9. El modelo murino tiene el costo más bajo, el mayor número de fetos por embarazo, el genoma mejor caracterizado y herramientas ampliamente disponibles para análisis celulares y moleculares. Sin embargo, un inconveniente clave es la falta de reversibilidad de la TO, evitando la comprensión completa del impacto de TO. En este documento, se presenta un método que combina todas las ventajas de los modelos anteriormente mencionados y crea un modelo TO de roedor fácil, potencialmente reversible y mínimamente invasivo.
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Protocol
Todos los experimentos han cumplido con la Guía de Los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Nih Publications No. 80023, revisado en 1978). El procedimiento fue aprobado con el protocolo de la UICN #2016-0068 por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati.
1. Preparación
- Para aparearse con ratones tipo salvaje (WT) C57BL/6 emparejados a la edad, colóquelos en la misma jaula a las 6:00 p.m. y sepáralos a las 9:00 a.m. del día siguiente.
- Para determinar el día embrionario 0 (E0), mira el tapón vaginal, que tiene una zona exterior homogénea unida a la pared vaginal y una zona interna que es fibrosa e incluye algunos espermatozoides que forman masas enredadas mezcladas con las fibras del material del enchufe.
- Registre el peso de los ratones en el momento del apareamiento.
- Vuelva a pesar a los ratones en E10 para garantizar el embarazo continuo.
- Realice la cirugía en E16.5 (etapa canalicular temprana).
- Esterilizar los instrumentos que se van a utilizar durante la cirugía: tijeras, soporte de aguja, fórceps, abrazaderas y cuchillos y asas quirúrgicas.
- Pre-calentar la plataforma de cirugía a 24 °C y preparar solución salina caliente (24 °C) antes de la cirugía.
- Crea un ambiente cálido para la recuperación y deja comida húmeda dentro de la jaula para la alimentación temprana.
- Quédese con los animales operados hasta que puedan alimentarse.
- Mantenga a los ratones operados solos en sus jaulas individuales después de la cirugía.
2. Anestesia
- Aplicar subcutánea 0,1 mg/kg de buprenorfina a las presas embarazadas 1 h antes del procedimiento.
- Utilice inhalado 5 mL/h de isoflurano para inducción y 2 mL/h continuamente durante el procedimiento de anestesia.
- Monitoree los movimientos de las barbillas de los ratones embarazadas.
3. Laparotomía
- Limpie la superficie abdominal con alcohol y povidone-yodo. Mantenga condiciones estériles durante toda la operación.
- Realice una incisión vertical para la laparotomía de las presas embarazadas. Corte todas las capas por separado.
- Identifique los cuernos uterinos a cada lado.
- Determine los fetos candidatos para la cirugía.
NOTA: No opere en los fetos más cercanos a la vagina. - Operar en dos fetos en cada cuerno uterino si hay un número par de fetos a cada lado (4 la mayoría de las veces), y en 1 feto en cada cuerno uterino si hay un número impar del útero(3 la mayor parte del tiempo).
4. Oclusión traqueal
- Utilice gafas de ampliación de 2,5x para la visualización.
- Coloque el cuerno uterino de forma transversal.
- Tome los cachorros, mirando hacia arriba, entre dos dedos usando los ojos de los cachorros y la cola como guía para colocar el feto.
- Aplique presión suave en la cabeza del cachorro para permitir la extensión de la cabeza y, por lo tanto, la visualización del cuello.
- Utilice una sutura de polipropileno 6.0 con una aguja atraumática para realizar TO (Figura 1). Mantenga la placenta en el lado y lejos de los puntos de entrada y salida de la aguja.
- Inserte la aguja transversalmente a través del lado del útero lejos de la placenta a través de la parte anterior de 1/3rd del cuello.
- Mueva suavemente la aguja hasta la línea media del cuello y diríjala a la parte anterior, luego salga del cuello entre la tráquea y frente a la vaina carótida y el útero.
- Anudar la sutura, teniendo cuidado de mantener la integridad de las membranas y la pared uterina, y mantener el cordón umbilical seguro durante el anudamiento.
Figura 1: Oclusión traqueal. (A) La sutura transuterina que pasa a través del cuello. (B) Representación esquemática de las estructuras después de que la sutura pase a través y antes del nudo. Abreviaturas: C = Arteria carótida; J = Vena yugular; T =Trachea; E = Esófago; V = Vértebra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Cierre de pared abdominal
- Reemplace el cuerno uterino en el abdomen.
- Inyecte 2 ml de solución salina estéril caliente en la cavidad peritoneal antes del cierre.
- Ponga una sutura de poliglactina 5/0 para cerrar la pared abdominal y cierre la piel con una sutura de seda que no funcione.
- Aplicar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía intraperitoneally para la analgesia, y permitir la recuperación de la presa en una incubadora caliente.
6. Cosecha
- Aplique anestesia en la presa embarazada y coseche todos los fetos en E18.5 por cesárea.
- Compruebe la viabilidad de los fetos observando los movimientos de los fetos.
- Utilice al menos dos técnicas diferentes para la eutanasia: insuficiencia de dióxido de carbono y dislocación cervical.
- Retire los cuerpos según la regulación del laboratorio veterinario.
- Pesar todos los fetos.
- Realice una incisión vertical en el tórax para la toracotomía para extirpar los pulmones.
- Disecciona los pulmones de los embriones y sopesa para calcular la relación peso total pulmón-cuerpo (LBWR = (peso pulmonar izquierdo + peso pulmonar derecho)/peso corporal x100).
7. Histología
- Congele los tejidos en nitrógeno líquido, compuesto de temperatura de corte óptimo y hielo seco.
- Corte las muestras en secciones de 10 μm usando un criostato y colóqueslas en diapositivas recubiertas de poli-lisina.
- Hornee los toboganes a 60 °C durante la noche, y manche las diapositivas horneadas con hematoxilina y eosina antes de montarlas para la adquisición de imágenes a una ampliación de 10-20x usando un microscopio de campo ancho.
8. Procesamiento de tejidos para análisis de proteínas y ADN
- Congelar los pulmones fetales diseccionados y homogeneizarlos en 300 μL de amortiguador de ensayo de radioinmunoprecipitación. Centrífuga a 4 °C durante 5 min a 18.000 × g.
- Extraer y cuantificar proteínas, ADN y ARN10,12.
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Representative Results
Este estudio examinó 37 fetos: 20 (54,1%) como TO frente a 17 (45,9%) como control. Como la tráquea no podía ser ocluida en 4 fetos en el grupo TO, fueron excluidos del estudio. No hubo ninguna diferencia significativa en la mortalidad en ambos grupos: 4 fetos (25%) en el grupo TO y 2 fetos (12%) en el grupo de control (p=0,334, relación de cuotas (OR) 2,5, intervalo de confianza del 95% (CI) 0,39-16,05). El peso corporal medio, el peso pulmonar y la relación entre pulmón y peso corporal (LBWR) fueron más altos en el grupo TO que en el grupo de control (Tabla 1). Hubo una diferencia significativa en LBWR (p=0.006) entre los grupos TO y control.
El ADN, el ARN y la proteína se cuantificaron para determinar la razón de la diferencia en LBWR (Figura 2). Las cantidades de ADN pulmonar y la relación ADN/proteína fueron más altas en el grupo TO, no se observó ninguna diferencia en el ARN pulmonar, y las cantidades de proteínas fueron menores en el grupo TO que en el grupo de control, como se observó anteriormente en el modelo de conejo TO en el que se observó hiperplasia epitelial12. Los diámetros de las vías respiratorias del grupo TO también mostraron un aumento.
Los análisis histológicos de los pulmones E18.5 mostraron la etapa saccular tardía canalicular/temprana del desarrollo pulmonar con espacios aéreos en desarrollo e intersticioses engrosados entre superficies epiteliales en las muestras de control, mientras que los pulmones del grupo TO habían dilatado los espacios aéreos centrales y distales con un número subjetivamente mayor de núcleos(Figura 2). Este aumento de la cellularidad es consistente con el aumento observado en la cantidad de ADN pulmonar.
Figura 2: Características de los grupos. (A) Relación normalizada de peso de pulmón a feto, (B) Relación entre el ADN pulmonar y la proteína, (C) Contenido de ADN pulmonar normalizado a peso pulmonar, (D) Contenido de ARN pulmonar normalizado al peso pulmonar, y (E) Contenido de proteína pulmonar normalizado al peso pulmonar. (F) Imágenes representativas de hematoxilina y eosina de C57BL/6 E18.5 pulmones sin (barra de escala = 50 μm) y (G) con oclusión traqueal transuterina fetal que muestra hiperplasia de conducir vías respiratorias y mayor tamaño de espacios aéreos distales; escala = 100 μm. La comparación del control (n=9) y la oclusión tqueal (TO) (n=6) se realizó mediante la prueba tdel alumno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tabla 1: Resultados morfométricos de los grupos | |||
| Para | control | p | |
| Peso feto (mg) | 1100.52 ± 229.38 | 1087.15 ± 172.32 | 0.896 |
| Peso pulmonar (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR | 0.0259 ± 0.0021 | 0.0217 ± 0.0028 | 0.006* |
| Valores expresados como medios ± desviaciones estándar. Abreviaturas: LBWR = Relación de peso corporal pulmonar a fetal; TO = oclusión traqueal. | |||
| *95% Intervalo de confianza 0,0222–0,0249. Grupos comparados por la prueba t del estudiante. | |||
Tabla 1: Resultados morfométricos de los grupos
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Discussion
Este método describe un procedimiento quirúrgico de oclusión traqueal fetal en ratones y su impacto en el desarrollo pulmonar. Hay algunos pasos críticos en el protocolo que deben realizarse cuidadosamente para lograr un to correctamente. El calor de la plataforma en la que se lleva a cabo la cirugía y la solución salina introducida en la cavidad peritoneal es crucial para la progresión del embarazo. Además, se debe aplicar una ligera presión en la cabeza de los cachorros para garantizar la exposición del cuello.
Una sutura de polipropileno 6.0 es la única sutura que se puede utilizar para esta técnica. Las agujas de suturas mayores de 6,0 son más gruesas y destruyen las estructuras alrededor de la tráquea en el cuello, lo que resulta en la pérdida del feto. Las agujas de las suturas más delgadas son muy cortas y no pueden pasar a través del cuello de un cachorro E16.5 (etapa canalicular temprana). Además, una aguja de corte no es apropiada, ya que podría destruir las estructuras adyacentes.
Este modelo tiene algunas limitaciones. En primer lugar, hay una diferencia en la correlación de las etapas de desarrollo pulmonar y el período gestacional entre ratones y humanos. En segundo lugar, es difícil desarrollar CDH en ratones y, por último, los estudios hemodinámicos son difíciles de llevar a cabo en modelos de ratón. Sin embargo, la corta curva de aprendizaje en este estudio resultó en una disminución dramática en la tasa de mortalidad fetal. Como se indicó anteriormente, el costo de los animales, así como su mantenimiento, el número de fetos por embarazo, la duración del período de embarazo y la disponibilidad limitada de herramientas genéticas son los principales factores limitantes en los modelos de conejos y ovejas.
La primera ventaja de este modelo de ratón es que elimina la necesidad de histerotomía para TO y tiene el potencial de revertirse en el útero11,lo que explica las bajas tasas de mortalidad observadas en este estudio. En segundo lugar, la reducción del costo de los animales y su mantenimiento y un período de embarazo más corto facilita una mayor gama de experimentos. En tercer lugar, las causas no técnicas de complicaciones, como hipotermia y anestesia, se previenen por la corta duración de la cirugía. Por último, la amplia variedad de herramientas genéticas disponibles en ratones dará lugar a más estudios para entender la fisiopatología de la CDH. La eliminación de la sutura transuterina con el nacimiento vivo del feto en los modelos nitrofeno y knockout de CDH serán las futuras aplicaciones de esta técnica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de las agencias de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro. Todos los autores han hecho contribuciones sustanciales a la concepción y el diseño del estudio, adquisición, análisis e interpretación de datos, redactando el artículo y revisándolo para obtener contenido intelectual importante y la aprobación final de la versión que se presentará. Los autores agradecen a Can Sabuncuoğlu por sus amables esfuerzos en la producción de la obra de arte de la técnica quirúrgica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
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